Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
Aktuelle monolag eller suspension celledyrkningsassays for lægemiddeludvikling er ikke at efterligne den menneskelige cellulære mikromiljø og dermed føre til en hurtig dedifferentiering og tab af funktion i primære humane cellekulturer. Tissue modeller med højere fysiologiske relevans er nødvendige for at forudsige effekten og sikkerheden af forbindelser, for at de kliniske forsøg. For nylig har standard in vitro-cellekultur teknikker udviklet sig fra todimensionale monolagskulturer mod tredimensionale multi-cellulære modeller med henblik på at efterligne in vivo væv mikromiljø. Disse systemer har allerede vist store forbedringer i retning af mere præcis forudsigelse af virkningsmekanismen af forbindelser 1,2. Endvidere tilpasse in vitro dyrkningsbetingelser til højt specialiserede behov celler er af særlig interesse.
Under standard in vitro betingelser, en række vigtige cultidige parametre, såsom næringsstoffer og ilt, fjernelse af akkumulerende produkter og mekanisk kraft, der virker på cellerne ofte ikke kan kontrolleres grundigt i de fleste tilfælde. Mange organer besidder fysiologisk relevante koncentrationsgradienter af stoffer og opløst ilt. Men de stærkt regulerede og optimerede betingelser er i klar opposition til de ukontrollable diffusion gradienter omkring væv under in vitro betingelser, der fører til et meget ustabilt miljø og begrænse cellulær udvikling 3. Således stabil og især mere kvantificerbare in vitro betingelser er forpligtet til at holde celler levedygtige og differentieret over længere perioder. Perfusionerede systemer, hvor mellemstore komponenter fjernes regelmæssigt og substituerede, er ofte bedre karakteriseret og kontrollerbar end statiske kulturer vedrørende direkte omkringliggende væv. Under statiske betingelser, diffusion gradienter af celle sekreter og kultur medium næringsstofferkan omgive dyrkede celler 3. Introduktion velkarakteriserede medium strømningshastigheder omkring væv tillader celle sekreter at blande sig med rigt medium gennem perfusion. Dette gør det muligt generation af definerede cellulære mikromiljøer, sikre en stabil cellulær fænotype og metabolizing enzymekspression gennem hele analysen varighed 4.
Den seneste udvikling i multiorgansystemer chip (MOC) -baserede systemer kombinerer fordelene ved en kontrolleret mediestrøm omkring manipuleret væv, hvor de små, mellemstore og cellemasse krav mikroskala bioreaktorer, hvilket fører til en reduceret mængde af stof nødvendig under test. Adskillige mikrofluide systemer til vævskultur er blevet beskrevet hidtil 5,6. Tissue-til-væske-forhold inden for disse systemer spiller en særlig afgørende rolle i at simulere fysiologisk relevant cellulær krydstale. Men på grund af tekniske begrænsninger, såsom brugen af eksterne pumper og medier reservoirer, the samlede cirkulerende medier volumen i de fleste systemer er for stor i forhold til vævet mængder. Gruppen af Shuler et al. Var de første til at udvikle et system, der sikrer ordentlige opholdstider af stoffer inden for cellekultur rum og in vivo relevante væv-til-væske-forhold 7,8. Dette blev opnået ved at skalere den eksterne reservoir ned til en plade med 96 brønde, som også repræsenterer "andre væv" rum. For at minimere den cirkulerende medier volumen i vores MOC platform, integreret vi en peristaltisk on-chip Mikropumpe, hvilket eliminerer behovet for eksterne medier kredsløb. Denne Mikropumpe er i stand til at betjene systemet ved en valgbar antal medier strømningshastigheder og shear stress satser 9. Mikrofluidapparat kanalsystem 500 um bredde og 100 um højde forbinder to standardiserede vævskulturplader rum, der hver har størrelsen af en enkelt brønd i en 96-brønds plade. Fastholdelsen af størrelserne af industristandard godt plades tillader integration af allerede eksisterende væv modeller fremstillet i transwell format. Endvidere lodrette stilling Transwell cellekultur skær er justerbar, således at dyrkning af væv modeller, der ikke kun direkte udsat for fluidstrømmen, men kan også løftes op og afskærmet fra den underliggende strøm. Tilsvarende, luft-væske-grænseflade kulturer er mulig ved hjælp af dette system.
MOC platform er fremstillet af et polydimethylsiloxan (PDMS) lag 2 mm høje og et objektglas med et footprint på 75 x 25 mm 2, som er permanent bundet ved lavt tryk plasma oxidation til dannelse af fluidtæt mikrofluid kredsløb. Det PDMS lag indeholdende de respektive kanaler og cellekultur rum er produceret af standard bløde litografi og replika støbning 9. Den microfluidic design af MOC anvendes under denne undersøgelse bestod af to separate mikrofluide kredsløb per chip, hver bedrift to celle cturprodukter rum indbyrdes forbundet af et kanalsystem 100 um høj. Dette tillod udførelse af to individuelle to-væv cokulturer ved hjælp af en multi-orgel chip. Pumping frekvenser blev justeret til opnåelse af mellemstore strømningshastigheder på 40 pl / min.
Denne to-væv MOC design billede evnen til cokultur en lever sfæroid og en hud hulning biopsi i separate kultur rum, omend i en kombineret medier kredsløb under fysiologiske flow betingelser. Differentieret HepaRG celler blev aggregeret sammen med humane hepatiske stjerneformige celler (HHSteC) ved et forhold på 24: 1 til dannelse af homogene sfæroider. Dette forhold blev fundet at være optimal, som observeret i tidligere forsøg 10, selv om, var næsten det dobbelte af antallet af hepatocytter anvendte sammenlignet med in vivo situationen. Huden blev dyrket ved en luft-væske-grænsefladen i en transwell celledyrkningsinsert, således at topisk stof eksponering. Disse væv modeller blev samdyrket for 28 days i MOC at demonstrere helheden i dette system. Desuden blev mikrofluid kanal kredsløb chips fuldstændigt dækkede humane dermale mikrovaskulære endotelceller (HDMEC) til nøjere at simulere det vaskulære system.
Den MOC platform beskrevet her repræsenterer en stabil og effektivt værktøj til at dyrke væv af forskellig oprindelse på dynamiske medium strømningsforhold i længere kultur perioder 10,16. I dette eksempel blev den platform, der anvendes til at dyrke primære celler (HDMEC), vævsækvivalenter genereret fra en cellelinje (lever aggregater), og en cokultur af førnævnte med en vævsbiopsi. Den MOC var stand til at opretholde de tre-væv cokultur i op til 28 dage i en kombineret medium kredsløb. Så vidt forfatternes viden, det er første gang en multi-væv cokultur herunder biopsier, primærelementer og cellelinjer er blevet udført over fire uger.
En af de store ulemper ved mikrofluide systemer er affiniteten af små molekyler til at klæbe til overfladen materiale af fluide kredsløb. Da overfladen volumenforhold er særlig høj i mikrofluide systemer, bliver denne virkning endnu mere udtalt 17 </sop>. Den stabile HDMEC dækning af kanalerne, der blev indført her, kan virke som en biologisk barriere, der forhindrer vedhæftning af molekyler til MOC. Endvidere kan det tjene som en Hæmokompatibelt fartøj for hele blodcirkulationen, forhindrer blodpropper. Men brugen af fuldblod som et medium substitution ikke er mulig som en fuld vaskularisering af orgel-ækvivalenter er endnu ikke nået. Eksisterende arbejde på vaskularisering af in vitro -generated væv er lovende og guider vejen for yderligere undersøgelser 18,19.
Det er velkendt, at hepatocytter tendens til at miste deres leverspecifikke funktioner over tid under dyrkningsbetingelser 20 statisk todimensionale in vitro. Enzymer, såsom cytochrom P450 familien, er af særlig betydning, hvis metabolisme af et bestemt stof er at blive undersøgt. Cytokrom P450 3A4, et enzym relateret til biotransformationen af mange xenobiotika og cytochrom P450 7A, which er involveret i galdesyresyntese, blev udtrykt i leveren aggregater dyrkes i MOC over 14 dage. Dette indikerer at bevarelsen af en metabolisk aktiv fænotype, der giver mulighed for lægemiddelmetabolisme studier. Den øgede albumin produktionshastighed af aggregater i MOC forhold til statiske kulturer er en yderligere indikation for passende dyrkningsbetingelser. Albumin produktion satser observeret i løbet af denne undersøgelse var sammenlignelige eller endog højere end tidligere rapporterede værdier opnået ved mikrofluide chips herunder HepG2-celler 21 – 23, dog værdierne ikke nåede de primære humane hepatocytkulturer 24. Desuden MOC systemet i sin midlertidige layout, giver ikke mulighed for en separat adskillelse af galde. Celler i det aggregerede polariserede og dannede galde-canaliculi-lignende strukturer, hvilket fremgår af MRP-2-farvning. Imidlertid blev disse canaliculi ikke forbundet til en teknisk kanal indsamle galden. Denne ikke-fysiologiske mixing af galde med blodet rum skal behandles i et kommende redesign af systemet.
Tilpasningen af strømningskarakteristika er af stor betydning 25, navnlig med hensyn til væv er følsomme over for forskydningsspænding, såsom leveren. Mængden af forskydningsspænding opfattes af vævet kan ændres på to måder: For det første kan lufttryk anvendes til at skubbe ned membraner pumpen sænkes, faldende peak shear stress værdier i systemet. For det andet kan vævene indlejret i en ekstracellulær matrix lagdeling eller dyrket i transwell kultur skær. Sidstnævnte beskytte væv fra den underliggende strøm med en porøs membran. Disse justeringer skal udføres på et individuelt grundlag for hvert organ svarende før du starter MOC eksperiment. Ved en pulserende drift af 2,4 Hz, for eksempel, som svarer til et højt, men stadig fysiologiske, hjerte aktivitet af 144 slag / min i mennesker, forskydningsspændingen målt ikanaler af mikrovaskulære kredsløb når ca. 25 dyn / cm2. Det svarer til en fysiologisk forskydningsspænding i den højere ende af skalaen i mikrovaskulatur og er derfor godt anvendelig til forsøg, herunder en endothelialisering af kanalerne. Men da den nuværende microfluidic layout af MOC ordning præsenteres kun består af ét medie ledning, der forbinder de to orgel rum, en pumpe hastighed og shear stress sats har at blive valgt for hele systemet. Derfor er en præcis justering af flydeegenskaber til behovene i de enkelte organ er ikke altid muligt.
Endvidere har omhu skal træffes i tilpasning af cellerne til den fælles medium. Celler dyrket i MOC i en kombineret medier kredsløb derfor ingen individuel celledyrkningsmedier kan anvendes til hvert væv model, som det er standard for in vitro-cellekultur. En minimal kombineret formulering medier skal defineres på forhånd og than celler skal justeres trinvist til denne nye medier. En procedure på 80% / 20% justering af gamle til nye medier i to dage, så 50% / 50%, efterfulgt af 20% / 80%, og en fuld udveksling altid ført til en rimelig celle levedygtighed og funktionalitet af kulturer i vores hænder.
Den nuværende microfluidic layout MOC system tillader cokultur af op til tre væv. En cokultur af mindst ti vigtigste organer i det menneskelige legeme er nødvendig for at nå homøostase. Derfor systemet præsenteret er i stand til at forudsige bestemte væv-væv interaktioner, men ikke den sande systemisk reaktion på et stof. En videreudvikling af MOC til at omfatte flere orgel hulrum påtænkes. Desuden gyldigheden af systemet skal vises ved hjælp af et sæt referencestoffer. Fortrinsvis forbindelser, der har undladt i kliniske forsøg (f.eks Troglitazon) skal testes for deres præstationer i MOC. Betragtninger, er en sand validering af sådanne komplekse systemer stadig hæmmet by den manglende standardisering vedrørende biomarkører og endepunkter for funktionel evaluering, indsamling flere data om den toksikologiske resultater af denne og lignende systemer vil udvide deres pålidelighed og anvendelsesområde.
The authors have nothing to disclose.
Arbejdet er finansieret af det tyske ministerium for uddannelse og forskning, GO-Bio Grant No. 0315569.
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |