Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
Monostrato o di sospensione attuali test di coltura cellulare per lo sviluppo di farmaci non riescono a emulare il microambiente delle cellule umane e, quindi, portare a una de-differenziazione rapida e perdita di funzione in colture primarie di cellule umane. Sono necessari modelli di tessuto con una maggiore rilevanza fisiologica di predire l'efficacia e la sicurezza di composti per ammetterli alla sperimentazione clinica. Recentemente, di serie nelle tecniche di coltura cellulare in vitro hanno evoluto da colture monostrato bidimensionali verso modelli multi-cellulari tridimensionali, con l'obiettivo di imitare il vivo microambiente tessuto. Questi sistemi hanno già mostrato importanti miglioramenti verso previsione più accurata della modalità di azione dei composti 1,2. Inoltre, adattando le condizioni di coltura in vitro delle esigenze altamente specializzate di cellule è di particolare interesse.
In serie in condizioni in vitro, una serie di importanti culture parametri, quali la fornitura di nutrienti e ossigeno, la rimozione dei prodotti accumulando e forza meccanica che agiscono sulle cellule spesso non possono essere controllati accuratamente nella maggioranza dei casi. Molti organi possiedono gradienti di concentrazione fisiologicamente rilevanti di sostanze e di ossigeno disciolto. Tuttavia, tali condizioni altamente regolamentati e ottimizzati sono in netta opposizione ai gradienti di diffusione incontrollabili intorno tessuti in condizioni in vitro, che porta a un ambiente altamente instabile e limitando sviluppo cellulare 3. Così, sono richiesti più stabile e soprattutto più quantificabile in condizioni in vitro per mantenere le cellule vitali e differenziato per periodi di tempo prolungati. Sistemi di perfusione, in cui i componenti di media vengono regolarmente rimossi e sostituiti, sono spesso meglio caratterizzati e controllabile di culture statiche riguardanti la circostante diretta dei tessuti. In condizioni statiche, gradienti di diffusione di secrezioni cellulari e medie cultura nutrientipotrebbe circondare cellule in coltura 3. Introduzione ben caratterizzati portate medie intorno ai tessuti permettono secrezioni cellulari per mescolare con il ricco mezzo attraverso perfusione. Ciò consente la generazione di microambienti cellulari definiti, assicurando un fenotipo cellulare stabile e metabolizzare espressione dell'enzima per tutta la durata del test 4.
I recenti sviluppi in chip di multi-organo (MOC) a base di sistemi uniscono i vantaggi di un flusso medio controllato attorno tessuti con le piccole esigenze medie e di massa delle cellule di bioreattori microscala ingegnerizzati, portando ad una ridotta quantità di sostanza necessaria durante il test. Diversi sistemi microfluidici per coltura tissutale sono state descritte finora 5,6. Tissue-a-liquido rapporti all'interno di questi sistemi svolgono un ruolo fondamentale soprattutto nella simulazione fisiologicamente rilevanti crosstalk cellulare. Tuttavia, a causa di limitazioni tecniche, come l'uso di pompe esterne e serbatoi multimediali, the nel complesso il volume circolante media la maggior parte dei sistemi è troppo grande rispetto ai volumi di tessuto. Il gruppo di Shuler et al. Sono stati i primi a sviluppare un sistema che garantisca tempi di permanenza propri di sostanze all'interno dei compartimenti di coltura cellulare e in vivo rilevanti rapporti 7,8 tessuto-to-fluido. Questo è stato ottenuto scalando il serbatoio esterno fino a una piastra a 96 pozzetti, che rappresenta anche il comparto "altri tessuti". Per minimizzare il volume circolante media all'interno nostra piattaforma MOC, abbiamo integrato un peristaltica on-chip micropompa, eliminando la necessità di circuiti supporti esterni. Questa micropompa è in grado di operare il sistema ad un numero selezionabile di velocità di flusso media e tassi di sollecitazione di taglio 9. Un sistema canale microfluidico di 500 micron di larghezza e 100 micron altezza interconnette due spazi coltura tissutale standardizzati, ciascuna avente la dimensione di un singolo pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aderendo alle dimensioni dell'industria pozzetti di series permette l'integrazione di modelli di tessuto già esistenti prodotte nel formato transwell. Inoltre, la posizione verticale transwell inserti di coltura cellulare è regolabile, permettendo la coltivazione di modelli di tessuto che non solo direttamente esposti al flusso di fluido, ma può anche essere sollevato e schermato dalla corrente sottostante. Allo stesso modo, le culture di interfaccia aria-liquido sono fattibili con questo sistema.
La piattaforma MOC è fabbricato da un polidimetilsilossano (PDMS) strato di 2 mm e un vetrino da microscopio in vetro con un ingombro di 75 x 25 mm 2, che sono legati in modo permanente a bassa ossidazione del plasma pressione per formare il circuito di microfluidica tenuta di fluido. Lo strato PDMS contenente i rispettivi canali e vani di colture cellulari è prodotto da litografia soft di serie e replica stampaggio 9. Il design microfluidica del MOC utilizzata durante questo studio consisteva di due circuiti separati microfluidica per chip, ciascuno con due celle ccompartimenti ulture interconnessi da un sistema di canali 100 micron alta. Questo ha permesso l'esecuzione di due co-colture di due tessuti singoli con un chip multi-organo. Frequenze di pompaggio sono stati adeguati per produrre medie portate di 40 microlitri / min.
Questo disegno MOC due tessuti disponibile la capacità di co-coltura uno sferoide fegato e una biopsia cutanea in spazi coltura separati, anche se in un circuito di media combinata in condizioni di flusso fisiologiche. Cellule differenziate HepaRG sono stati aggregati insieme con le cellule umane epatiche stellate (HHSteC) in un rapporto di 24: 1 per formare sferoidi omogenee. Questo rapporto è risultato ottimale, come osservato negli esperimenti precedenti 10, anche se, quasi il doppio del numero di epatociti sono stati utilizzati rispetto alla situazione in vivo. La pelle era coltivato ad una interfaccia aria-liquido all'interno di un inserto di coltura cellulare transwell, consentendo in tal modo l'esposizione sostanza topica. Questi modelli di tessuto sono stati cocultivated per 28 days del MOC per dimostrare la completezza di questo sistema. Inoltre, il circuito di canale microfluidico dei chip è stato completamente ricoperto con le cellule endoteliali microvascolari cutanea umana (HDMEC) per simulare più strettamente il sistema vascolare.
La piattaforma MOC descritto rappresenta uno strumento stabile e potente per la coltivazione di tessuti di varia origine in condizioni di flusso medie dinamiche per periodi prolungati di coltura 10,16. In questo esempio, la piattaforma è stato usato per coltivare le cellule primarie (HDMEC), equivalenti tessuto generati da una linea cellulare (aggregati fegato), e un co-coltura del citato con una biopsia tissutale. La MOC è stato in grado di sostenere la co-coltura di tre tessuti fino a 28 giorni in un circuito medio combinato. Per quanto a conoscenza degli autori, questa è la prima volta un coculture multi-tessuto comprese biopsie, cellule primarie e linee cellulari è stata eseguita per quattro settimane.
Uno dei principali inconvenienti dei sistemi microfluidici è l'affinità di piccole molecole di aderire al materiale di superficie del circuito fluidico. Poiché il rapporto tra superficie e volume è particolarmente elevata in sistemi microfluidici, questo effetto diventa ancora più pronunciato 17 </sup>. La copertura HDMEC stabile dei canali, introdotto qui, potrebbe agire da barriera biologica impedire l'adesione delle molecole al MOC. Inoltre, può servire come un vaso emocompatibilità per tutta la circolazione sanguigna, impedendo la coagulazione del sangue. Tuttavia, l'uso del sangue intero come sostituzione terreno non è fattibile, come non è ancora stato raggiunto un vascolarizzazione completa degli equivalenti organi. Lavori per la vascolarizzazione dei tessuti -Generata in vitro esistente è promettente e guida la strada a ulteriori studi 18,19.
È ben noto che epatociti tendono a perdere le loro funzioni specifiche fegato nel tempo sotto statico bidimensionali in vitro condizioni di coltura 20. Enzimi del metabolismo, come la famiglia del citocromo P450, sono di particolare importanza se il metabolismo di un certo farmaco è da studiare. Citocromo P450 3A4, un enzima legato alla biotrasformazione di molti xenobiotici, e citocromo P450 7A, which è coinvolto nella sintesi degli acidi biliari, sono stati espressi nel fegato aggregati coltivate in MOC oltre 14 giorni. Ciò indica la conservazione di un fenotipo metabolicamente attiva, consentendo studi sul metabolismo farmaco. L'aumento del tasso di produzione di albumina di aggregati nel MOC rispetto alle culture statiche è un'indicazione supplementare per adeguate condizioni di coltura. I tassi di produzione di albumina osservati nel corso di questo studio sono stati paragonabili o addirittura superiori a quelli precedentemente riportati ottenuti da chip microfluidici tra cui cellule HepG2 21 – 23, invece, i valori non ha raggiunto quelli delle culture di epatociti umani primari 24. Inoltre, il sistema MOC, nella sua configurazione temporanea, non consente una separazione separata di bile. Le cellule in strutture aggregate canalicoli simili biliari polarizzati e formati, come mostrato dal MRP-2 colorazione. Tuttavia, tali canalicoli non erano collegati ad un canale tecnica raccolta della bile. Questo mix non-fisiologicazione della bile con il vano di sangue deve essere affrontata in un futuro riprogettazione del sistema.
La regolazione delle caratteristiche di flusso è di grande importanza 25, soprattutto per quanto riguarda i tessuti sensibili a sollecitazioni di taglio, come il fegato. La quantità di sollecitazione di taglio percepito dal tessuto può essere modificata in due modi: in primo luogo, la pressione dell'aria usata per spingere le membrane della pompa può essere abbassata, diminuendo valori di picco della tensione tangenziale nel sistema. In secondo luogo, i tessuti possono essere incorporati in una stratificazione matrice extracellulare o coltivati in inserti cultura transwell. Quest'ultimo schermare i tessuti della corrente sottostante con una membrana porosa. Queste regolazioni devono essere eseguite su base individuale per ogni equivalente organo prima di iniziare l'esperimento MOC. A un'operazione pulsatile di 2,4 Hz, per esempio, che corrisponde ad una elevata attività, ma ancora fisiologica cardiaca di 144 battiti / min nell'uomo, la sollecitazione di taglio misurata nelcanali del circuito microvascolare raggiunge circa 25 dine / cm 2. Ciò corrisponde ad una sollecitazione di taglio fisiologico alla fine più alto della scala in microcircolo ed è, quindi, ben applicabile per esperimenti compresa una endotelizzazione dei canali. Tuttavia, poiché la corrente di layout microfluidica del sistema MOC presentata consiste di un solo circuito di media che collega i due compartimenti organo, un tasso di sollecitazione di taglio e la velocità di pompaggio deve essere scelto per l'intero sistema. Pertanto, un adeguamento preciso delle caratteristiche di flusso alle esigenze di ogni singolo organo non è sempre fattibile.
Inoltre, la cura deve essere presa nella regolazione delle cellule per mezzo di comuni. Le cellule vengono coltivate in MOC in un circuito di media combinata, quindi, nessun individuo mezzi di coltura cellulare può essere utilizzato per ogni modello di tessuto, come è lo standard per coltura cellulare in vitro. Una formulazione dei media combinato minima deve essere definito in anticipo e tegli le cellule devono essere adeguate graduale a questo nuovo media. Una procedura di regolazione del 80% / 20% vecchio per nuovi media per due giorni, poi 50% seguita / 50% del 20% / 80%, e uno scambio sempre portato a una vitalità cellulare ragionevole e la funzionalità delle culture nelle nostre mani.
L'attuale assetto microfluidica del sistema MOC permette di co-coltura fino a tre tessuti. È necessaria una co-coltura di almeno il dieci organi più importanti del corpo umano per raggiungere omeostasi. Pertanto, il sistema presentato è in grado di predire interazioni tessuto tessuto specifici, ma non il vero risposta sistemica a una sostanza. Un ulteriore sviluppo del MOC per includere più cavità di organi è prevista. Inoltre, la validità del sistema deve essere mostrato utilizzando una serie di composti di riferimento. Preferibilmente, composti che hanno fallito durante gli studi clinici (come Troglitazone) devono essere testati per la loro performance nel MOC. Considerando che, una vera e propria convalida di tali sistemi complessi è ancora ostacolato by la mancanza di standardizzazione relativa biomarcatori e endpoint per la valutazione funzionale, raccogliendo più dati sulle prestazioni tossicologici di questa e simili sistemi amplierà la loro affidabilità e l'area di applicazione.
The authors have nothing to disclose.
Il lavoro è stato finanziato dal Ministero federale tedesco per l'Istruzione e la ricerca, GO-Bio di Grant No. 0.315.569.
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |