Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.
The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments, as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier, more quantifiable extracellular relay of signals to the cells.
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.
Em monocamada ou em suspensão actuais ensaios de cultura de células para o desenvolvimento de drogas não estão a emular o microambiente celular humano e, por conseguinte, levar a um desdiferenciação rápida e perda de função em culturas primárias de células humanas. Modelos de tecido com maior relevância fisiológica são necessários para prever a eficácia e segurança de compostos para os admitir ensaios clínicos. Recentemente, a norma de técnicas de cultura de células in vitro têm evoluído a partir de culturas de monocamadas bidimensionais para modelos multi-celulares tridimensionais, com o intuito de imitar o tecido microambiente in vivo. Estes sistemas já demonstraram melhorias importantes no sentido de predição mais precisa do modo de acção dos compostos 1,2. Além disso, adaptando as condições de cultura in vitro para as necessidades altamente especializados de células é de particular interesse.
Sob padrão em condições in vitro, uma variedade de cul importantetura parâmetros, tais como nutrientes e oxigénio de alimentação, a remoção de produtos de acumulação, e força mecânica que actuam sobre as células, muitas vezes não pode ser completamente controlada, na maioria dos casos. Muitos órgãos possuem gradientes de concentração fisiologicamente relevantes de substâncias e oxigênio dissolvido. No entanto, essas condições altamente regulamentados e otimizados estão em clara oposição aos gradientes de difusão incontroláveis em torno dos tecidos em condições in vitro, o que leva a um ambiente altamente instável e limitar o desenvolvimento celular 3. Deste modo, mais estável e mais especialmente quantificáveis em condições in vitro são necessários para manter as células viáveis e diferenciada ao longo de períodos de tempo prolongados. Sistemas de irrigação sanguínea, onde os componentes do meio são regularmente removidos e substituídos, são muitas vezes melhor caracterizado e controlável do que as culturas estáticas referentes à envolvente directa de tecidos. Em condições estáticas, gradientes de difusão de secreções celulares e nutrientes do meio de culturapode cercar as células cultivadas 3. Introduzindo bem caracterizados vazões médias em torno dos tecidos permitem que as secreções celulares para misturar com o meio rico através de perfusão. Isto permite a geração de micro-ambientes celulares definidas, assegurando um fenótipo celular estável e a expressão da enzima metabolizadora durante todo o período de ensaio 4.
Desenvolvimentos recentes no chip de múltiplos órgãos (MOC) à base de sistemas de combinar os benefícios de um fluxo médio controlada em torno de engenharia dos tecidos com as pequenas exigências de médio e massa celular de biorreatores em microescala, levando a uma diminuição da quantidade de substância necessária durante o teste. Vários sistemas microfluídicos para cultura de tecidos foram descritas até agora 5,6. Rácios dos tecidos para o fluido dentro destes sistemas desempenham um papel especialmente importante na simulação de crosstalk celular fisiologicamente relevante. No entanto, devido a limitações técnicas, como o uso de bombas e reservatórios externos de mídia, the global circulando volume de mídia na maioria dos sistemas é muito grande em comparação com os volumes de tecidos. O grupo de Shuler et al., Foram os primeiros a desenvolver um sistema que garanta tempos de residência adequados de substâncias no interior dos compartimentos de cultura de células e in vivo relevantes tecido-para-fluido rácios de 7,8. Isto foi conseguido dimensionando o reservatório externo para baixo para uma placa de 96 poços, também representando o compartimento "outros tecidos". A fim de minimizar o volume de mídia que circula dentro da nossa plataforma MOC, integramos uma micropump peristáltica on-chip, eliminando a necessidade de circuitos de mídia externa. Este micropump é capaz de operar o sistema em um número selecionável das velocidades de fluxo de mídia e as taxas de tensão de cisalhamento 9. Um sistema de canais de microfluidos de 500 mm de largura e 100 mm de altura interliga dois espaços de cultura de tecidos padronizados, cada um tendo o tamanho de um único poço de uma placa de 96 poços. Aderindo aos tamanhos de padrão da indústria bem placas permite a integração de tecido modelos já existentes produzidos no formato transwell. Além disso, a posição vertical de inserções Transwell de cultura de células é ajustável, permitindo o cultivo de modelos de tecido, que não somente são directamente expostos ao fluxo do fluido, mas também pode ser levantado e protegido contra a corrente subjacente. Da mesma forma, as culturas interface ar-líquido são viáveis utilizando este sistema.
A plataforma MOC é fabricada a partir de uma camada de polidimetilsiloxano (PDMS) 2 mm de altura e uma lâmina de microscópio de vidro com uma área de 75 x 25 mm 2, que está permanentemente ligada por baixo de oxidação de plasma à pressão para formar o circuito de microfluidos estanque a fluidos. A camada de PDMS contendo os respectivos canais e compartimentos de cultura de células é produzido por litografia macia padrão e réplica moldagem 9. O projeto de microfluídica do MOC usado durante este estudo consistiu de dois circuitos microfluídicos separados por chip, cada um segurando duas células cultura compartimentos interligados por um sistema de canal de 100 mm de altura. Isto permitiu que o desempenho de dois co-culturas de dois tecidos individuais utilizando um chip de múltiplos órgãos. Frequências de bombeamento foram ajustados para produzir vazões médias de 40 mL / min.
Este projeto MOC de dois tecido fornecido a capacidade de co-cultura um esferóide fígado e uma biópsia de pele em espaços de cultura, embora estejam em um circuito de mídia combinados sob condições de fluxo fisiológicas. Células diferenciadas HepaRG foram agregadas com células estreladas hepáticas humanas (HHSteC) na proporção de 24: 1, para formar esferóides homogéneas. Esta proporção foi encontrado para ser óptima, tal como observado em experiências anteriores 10, embora, quase o dobro do número de hepatócitos foram usadas em comparação com a situação in vivo. A pele foi cultivada a uma interface ar-líquido no interior de uma inserção de cultura de células Transwell, permitindo, assim, a exposição à substância tópica. Estes modelos de tecido foram co-cultivadas durante 28 days no MOC para demonstrar a abrangência deste sistema. Além disso, o circuito de microfluidos canal dos chips foi totalmente coberta com células endoteliais microvasculares dérmicas humanas (HDMEC) para simular mais de perto o sistema vascular.
A plataforma MOC descrito aqui representa uma ferramenta estável e poderoso para o cultivo de tecidos de várias origens em condições de fluxo médio dinâmicas ao longo de períodos prolongados de cultura 10,16. Neste exemplo, a plataforma foi usado para cultivar as células primárias (HDMEC), os equivalentes de tecido gerados a partir de uma linha celular do fígado (agregados), e uma co-cultura do referido tecido com uma biópsia. O MOC foi capaz de sustentar a co-cultura de três tecido para até 28 dias em um circuito médio combinado. Para o melhor conhecimento dos autores, esta é a primeira vez que uma co-cultura de multi-tecido, incluindo biopsias, as células primárias e as linhas de células foi realizada ao longo de quatro semanas.
Uma das principais desvantagens dos sistemas de microfluidos é a afinidade de moléculas pequenas para aderir ao material da superfície do circuito de fluido. Como a superfície para razão de volume é especialmente elevada em sistemas de microfluidos, este efeito torna-se ainda mais pronunciada 17 </sup>. A cobertura HDMEC estável dos canais, introduzida aqui, pode actuar como uma barreira biológica prevenir a adesão de moléculas para o MOC. Além disso, pode servir como um recipiente para hemocompat�el circulação de sangue total, impedindo a coagulação do sangue. No entanto, a utilização de sangue completo, como um meio de substituição não é viável, não foi ainda conseguida uma vascularização completa dos equivalentes a órgão. Trabalho sobre a vascularização de tecidos in vitro -generated existente é promissor e orienta o caminho para outros estudos 18,19.
É bem sabido que os hepatócitos tendem a perder suas funções específicas do fígado ao longo do tempo sob estática bidimensionais cultura in vitro tem 20. Enzimas metabolizantes, tais como a família do citocromo P450, são de especial importância se o metabolismo de um determinado fármaco está a ser estudado. O citocromo P450 3A4, uma enzima relacionada com a biotransformação de xenobióticos muitos, e citocromo P450 7A, which está envolvida na síntese de ácidos biliares, foram expressos em fígado agregados cultivadas na MOC ao longo de 14 dias. Isto indica a preservação de um fenótipo metabolicamente activa, permitindo os estudos de metabolismo de drogas. O aumento da taxa de produção de albumina de agregados em comparação com o MOC culturas estáticas é uma indicação adicional para as condições de cultura adequadas. As taxas de produção de albumina observadas durante este estudo foram comparáveis ou mesmo superiores aos valores reportados anteriormente obtidos por chips microfluídicos, incluindo células HepG2 21-23, no entanto, os valores não atingem os de culturas de hepatócitos primários humanos 24. Além disso, o sistema MOC, na sua disposição temporária, não permitem uma separação separada da bílis. Células nas estruturas polarizadas e formaram agregados canalículos-like biliares, como mostrado por MRP-2 coloração. No entanto, esses canalículos não estavam ligados a um canal técnico cobrança da bile. Esta mistura não-fisiológicoing da bile com o compartimento de sangue tem de ser abordada em um redesign futuro do sistema.
O ajuste das características de fluxo é de grande importância 25, especialmente no que diz respeito aos tecidos sensíveis a forças de cisalhamento, tal como o fígado. A quantidade de tensão de cisalhamento percebida pelo tecido pode ser modificado de duas maneiras: em primeiro lugar, a pressão de ar utilizado para empurrar para baixo as membranas da bomba pode ser reduzido, diminuindo os valores de pico de tensão de cisalhamento no sistema. Em segundo lugar, os tecidos podem ser incorporados em camadas de uma matriz extracelular ou cultivados em inserções de cultura Transwell. O último proteger os tecidos subjacentes da corrente com uma membrana porosa. Esses ajustes devem ser realizados de forma individual para cada equivalente de órgão antes do início do experimento MOC. Numa operação pulsátil de 2,4 Hz, por exemplo, o que corresponde a uma actividade elevada, mas ainda fisiológico, coração de 144 batimentos / min em humanos, a tensão de cisalhamento medido nocanais do circuito de microvascular atinge cerca de 25 dines / cm 2. Isto corresponde a uma tensão de corte fisiológicas na extremidade superior da escala na microvasculatura e é, portanto, bem aplicável para ensaios, incluindo uma endotelização dos canais. No entanto, como a disposição de microfluidos actual do sistema MOC apresentado consiste em apenas um circuito de meios de comunicação que liga os dois compartimentos de órgãos, uma taxa de tensão de cisalhamento e velocidade de bombagem tem de ser escolhida para todo o sistema. Portanto, um ajuste exato de características de fluxo para as necessidades de cada órgão único nem sempre é viável.
Além disso, cuidado deve ser tomado no ajustamento das células para o meio comum. As células são cultivadas em MOC num circuito combinado meios, por conseguinte, qualquer meio de cultura de células individual pode ser utilizada para cada modelo de tecido, como é o padrão para a cultura celular in vitro. A formulação de mídia combinado mínimo precisa ser definido de antemão e tcélulas ele precisa ser ajustada gradualmente a esta nova mídia. Um procedimento de ajuste de 80% / 20% para novos meios de idade por dois dias, em seguida 50% / 50%, seguido de 20% / 80%, e uma troca completa sempre levou a uma viabilidade celular razoável e funcionalidade de culturas de nossas mãos.
O layout microfluídicos atual do sistema MOC permite que o co-cultura de até três tecidos. A co-cultura de pelo menos dez a órgãos mais importantes do corpo humano é necessário para alcançar a homeostase. Portanto, o sistema apresentado é capaz de prever as interacções específicas de tecido e tecido, mas não a verdadeira resposta sistémica a uma substância. Prevê-se um maior desenvolvimento do MOC para incluir mais cavidades de órgãos. Além disso, a validade do sistema é para ser mostrado utilizando um conjunto de compostos de referência. De preferência, os compostos que falharam durante ensaios clínicos (tais como troglitazona) estão a ser testados quanto ao seu desempenho na MOC. Considerando que, uma verdadeira validação desses sistemas complexos ainda é impedida by a falta de padronização relativo biomarcadores e parâmetros para avaliação funcional, coletando mais dados sobre o desempenho toxicológicas deste e sistemas semelhantes irá ampliar a sua fiabilidade e área de aplicação.
The authors have nothing to disclose.
O trabalho foi financiado pelo Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa, GO-Bio Grant No. 0.315.569.
Name of Material/ Equipment | Company | Comments/Description | |
HepaRG cells | Biopredic International | undifferentiated cells | |
HHSteC | ScienCell Research Laboratories | cells and all culture supplements | |
HepaRG Medium | Sigma-Aldrich | William's Medium E 10% FCS 100 U/ml penicillin 100 µg/ml streptomycin 5 µg/ml human insulin 2 mM L-glutamine 5 x 10-5 M hydrocortisone hemisuccinate | |
HDMEC Medium | PromoCell | Endothelial Cell Growth Medium MV2 with Supplement-Pack MV2 and 1% penicillin-streptomycin | |
Dimethyl sulfoxide | Carl Roth | add 2% to HepaRG media | |
Trypsin/EDTA | Biowest | ||
Trypsininhibitor | Carl Roth | ||
MAXYMum Recovery Tips | Corning | 1000 µl Pipet Tips Wide Bore | |
384-Well Hanging Drop Plate | 3D Biomatrix | Perfecta 3D 384-Well Hanging Drop Plate | |
Tissue culture flasks | Corning | 75 cm2 | |
Ultra-low attachment plate | Corning | 24-well | |
Transwell cell culture inserts | Corning | 96-well unit, 0.4 µm pore size | |
Deep well plates | Corning | 96-well, 1 ml | |
Biopsy punch | Stusche | 4.5 mm | |
Glass microscope slide | Menzel | footprint of 75 x 25mm | |
Polydimethylsiloxane | Dow Corning | Sylgard 184 | |
Silicon rubber additive | Wacker Chemie | Wacker Primer G790 | |
Tubes for air pressure | SMC Pneumatik GmbH | Polyurethan-Schlauch, metrisch | |
Alumin ELISA | Bethyl Laboratories | Human Albumin ELISA Quantitation Set | |
Lactate dehydrogenase assay | Stanbio Laboratory | LDH Liqui-UV kit | |
Alexa Fluor 594 acetylated LDL | Invitrogen | 1 mg/ml |