Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Tre-Dimensional (3D) Tumor Sfæroide Invasion Assay

doi: 10.3791/52686 Published: May 1, 2015

Abstract

Invasion af omgivende normale væv anses generelt for at være et centralt kendetegn for ondartet (i modsætning til godartede) tumorer. For nogle kræftformer i særdeleshed (f.eks hjernetumorer såsom glioblastoma multiforme og pladecellecarcinom i hoved og hals -. SCCHN) er en årsag til alvorlig sygelighed og kan være livstruende, selv i fravær af fjerne metastaser. Desuden cancere, som har fået tilbagefald efter behandling desværre ofte til stede med en mere aggressiv fænotype. Derfor er der en mulighed for at målrette processen med invasion at tilvejebringe nye terapier som kan være komplementær til standard anti-proliferative midler. Indtil nu har denne strategi været hæmmet af manglen på robuste, reproducerbare assays er egnede til en detaljeret analyse af invasion og for narkotika screening. Her giver vi en simpel mikro-plade-metoden (baseret på uniform, selvsamlende 3D tumor kugler), som har et stort potentiale for en sådan studør. Vi eksemplificere assay platform ved hjælp af en human glioblastoma-cellelinie og også en SCCHN model, hvor udviklingen af ​​resistens over for målrettede epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) hæmmere er forbundet med forøget matrix-invasiv potentiale. Vi tilbyder også to alternative metoder til halvautomatisk kvantificering: én ved hjælp af en imaging cytometer og en anden, som blot kræver standard mikroskopi og billedoptagelse med digital billedanalyse.

Introduction

Klassisk udvikling anticancerlægemiddel er i vid udstrækning fokuseret på anvendelsen af in vitro celle-baserede assays til screening for cytotoksiske midler, der inhiberer tumor celleproliferation og / eller fremme programmeret celledød (apoptose). For nylig er indsatsen bevæget sig i retning målrettede terapier med udviklingen af ​​inhibitorer af de underliggende molekylære årsager til malign celleproliferation. Til trods for nogle bemærkelsesværdige resultater, er sådanne midler ofte forbundet med den hurtige udvikling af lægemiddelresistens. Da det er den invasive og metastatiske potentiale af tumorceller, der er ansvarlig for hovedparten af kræftdødsfald, og at recidiverende sygdom ofte en mere aggressiv fænotype, er det logisk også at overveje yderligere in vitro eksperimentelle modeller 1,2 for at identificere hidtil ukendte agenter, der vil hæmme disse ekstra nøgle 'kendetegnende "af kræft.

Under malign progression erhverve tumorcellerevnen til at invadere omgivende væv og / eller spredning i fjerntliggende organer (metastase). Cancerceller trænger gennem basalmembranen ved dannelsen af invadopodia 3,4. Disse strukturer er beriget med actinfilamenter, specifikke adhæsionsproteiner og proteinaser og er kollektivt ansvarlige for tumorcellemotilitet og nedbrydning af den ekstracellulære matrix (ECM) 5. Invadopodia strække sig ind i ECM og menes at være vigtige for tumorcelleinvasion og også ekstravasation i vaskulære kanaler, lette hematogene (eller lymfe) udbredelse og metastase.

Aktuelle standardmetoder til vurdering tumorcelleinvasion in vitro omfatter følgende. Transwell-baserede eller Boyden kammer assays 2,6 hvor enkeltcelle-suspensioner podes på toppen af et filter belagt med et tykt lag af ECM-afledte proteiner. Celler derefter invadere og flytte ind i det nedre kammer som reaktion på en kemo-attraktant. Almindeligt anvendte ECMproteiner er type I collagen eller en basalmembran-lignende matrix (BMM, f.eks Matrigel, fra EHS tumor 7), som efterligner den naturlige sammensætning af basalmembraner.

Som et alternativ til de filterbaseret Boyden kammer assays 8 kan celler podes på toppen af et ECM-gel (som kan tilsættes fibroblaster), hvor de danner et monolag og derefter individuelt eller kollektivt invadere ind i gelen. Kan måles invasion i form af antallet af invaderende celler og / eller distance rejste fra gelen overflade 9. Tumorceller kan også helt indlejret i en matrix, enten som en enkelt celle suspension eller som sfæroider - sædvanligvis anbragt mellem to lag af gel-ECM tillader celler at invadere ud af tumormassen i det omgivende 2,6,10,11 matrix.

Den tredimensionale (3D) tumor klumpformet invasion assay beskrevet her tilvejebringer en hurtig, automatiserbar invasion under anvendelse af en highly reproducerbar og standardiseret metode 12 i en 96-brønds plade-format med en klumpformet per brønd. BMM tilsættes direkte til hver brønd for at give en halvfast matrice, hvori tumorceller invaderer fra klumpformet kroppen. Omfanget af tumorcelleinvasion overvåges med mellemrum over en periode på 72-96 timer. Denne fremgangsmåde tilvejebringer de følgende fordele i forhold til de nuværende in vitro invasion assays nævnt ovenfor: tumorcellerne er organiseret i en 3D-struktur efterligner en tumor mikro-region eller en mikro-metastase; tumor sfæroider er meget reproducerbar størrelse; invasionen assayet udføres in situ i den samme plade som tumor klumpformet udvikling, uden at det er nødvendigt at flytte dem til sekundære plader; fremgangsmåden, kombineret med de nyeste teknologier automatiseret billedanalyse, giver både høje indhold og high throughput analyser af tumorcelleinvasion.

Billedet analyse udføres under anvendelse af et billeddannende cytometer, som scanner en 96-brøndsplade inden for 10 min. Ved at bruge sammenløbet ansøgning, omfanget og hastigheden for invasion opnås enten ved enkelte celler eller ved celleklynger breder sig ud fra tumor sfæroider og invaderende ind i matrixen kan måles på en dynamisk måde. For lavere gennemløb, er en alternativ metode til billedanalyse præsenteret, baseret på brugen af ​​et omvendt mikroskop og standard imaging software.

Protocol

1. Generering af reproducerbart Sized Tumor Sfæroider

  1. Vask tumor cellemonolag med phosphatbufret saltvand (PBS, 5 ml til en 25 cm2 eller 8: - 10 ml for et 75 cm2 kolbe), add celledissociering enzym (1 ml til en 25 cm2 eller 2 ml til en 75 cm 2 kolbe), og der inkuberes celler ved 37 ° C i 2 - 5 min.
  2. Check celle løsrivelse under et mikroskop og neutralisere celle dissociation enzym med komplet vækstmedium (5 ml for et 25 cm2 eller 8 ml til en 75 cm2 kolbe).
  3. Centrifuge cellesuspension ved 500 x g i 5 min.
  4. Fjern supernatanten, tryk på røret og re-suspendere cellepelleten i 1 ml komplet vækstmedium ved hjælp af en P1000 pipette. Dette forventes at give en enkelt cellesuspension uden celleklynger.
  5. Tæl celler ved hjælp af et hæmocytometer og fortyndes cellesuspensionen at opnå 0,5-2 x 10 4 celler / ml (optimal celledensitet skal bestemmes for hver celle linie i order at opnå tumor sfæroider af 300-500 um diameter 4 dage efter celle såning 12,13).
  6. Overfør cellesuspensionen til et sterilt reservoir og ved hjælp af en multikanalpipette, dispensere 200 pi / brønd i ultralav binding (ULA) 96-brønds rundbundede plader 12.
  7. Overføre pladerne til en inkubator (37 ° C, 5% CO2, 95% fugtighed). Fire dage senere, visuelt bekræfte tumor klumpformet dannelse og fortsætte med 3D-invasion analysen.

2. 3D Tumor Sfæroide Invasion Assay

  1. Tø BMM på is.
  2. Hold et sæt sterile filter tips til P10, P200 og P1000 pipetter og sterile rør (1,5 ml volumen eller større, afhængigt af den samlede påkrævede volumen) ved -20 ° C.
  3. Placer Ula 96-brønds plader indeholdende 4 dage gamle sfæroider på is.
  4. Hjælp af en multikanalpipette, fjern forsigtigt 100 pl / brønd af vækstmedium fra de sfæroide plader. For dette trin vinkel spidserne mod inside væg af U-bundede brønde, undgå kontakt med bunden af ​​brønden og placeringen af ​​de sfæroider; minimere forstyrrelse af sfæroiderne.
  5. Ved hjælp af iskolde tips, overføre BMM til iskolde rør. For cytokininduceret invasion eller til evaluering narkotika undersøgelser, tilføjer reagenser (ved 2x den endelige koncentration) til BMM hjælp iskolde tips. For eksempel bruger epidermal vækstfaktor (EGF) til at stimulere invasionen af CAL S og CAL R skællede carcinomceller. Bland godt ved hvirvlende forsigtigt, undgå dannelsen af ​​bobler.
  6. Blidt dispensere 100 pi BMM ind i U-bund godt, sigter spidsen mod indersiden brøndens væg. Dette trin er den mest kritiske såsom for optimal billedanalyse, skal sfæroider forblive i centrum af brønden 12.
  7. Gentag trin 2.6 for alle de påkrævede brønde, der tillader 5 - 6 gentagelser / tilstand. Hvis det er nødvendigt, skifte til en frisk kølet spids.
    BEMÆRK: Når mere erfarne, dispenSE BMM hjælp af en multikanalpipette.
  8. Anvendelse af en steril nål, fjerne bobler, hvis til stede.
    1. Ved hjælp af et mikroskop, visuelt kontrollere, at spheroids er i en central position. Hvis ikke, centrifugeres pladen ved 300 x g i 3 minutter ved 4 ° C. Dette vil sikre, sfæroider centralt er placeret i hver brønd.
  9. Overføre pladen til en inkubator ved 37 ° C og lade BMM at størkne.
  10. 1 time senere ved hjælp af en multikanalpipette, forsigtigt tilsættes 100 gl / brønd af komplet vækstmedium. For cytokin-induceret invasion eller evaluering narkotika undersøgelser, omfatter cytokiner eller inhibitorer i mediet (1x slutkoncentration). Alternativt, hvis reagenser ikke blev tilsat til BMM i trin 2.5, føje dem til mediet på dette sted (3x den ønskede slutkoncentration).

3. Automatiseret Image Acquisition

  1. Scan plader på cytometret (for specifikationer se tabel af udstyr og materialer) med mellemrum starting fra tid nul (t0 = dag i invasionen assay sat op, umiddelbart efter trin 2.10 op til 72 timer, eller 96 timer for langsommere invaderende tumorcellelinjer.
  2. Vælg "Confluence 'ansøgning.
  3. Kontroller at klumpformet er i fokus, og, hvis det er nødvendigt, justeres manuelt og løse "Focus off-set«.
  4. Under 'Sampling indstillinger', skal du vælge at scanne én central synsfelt (FOV). Efter BMM Desuden bør tumor spheroids være forblevet i en central position, og dermed er der ingen grund til at scanne hele godt.
  5. I softwaren, definerer de brønde, der skal scannes ved at fremhæve dem på pladen kort. Klik på 'Start scan ".
    BEMÆRK: scanningen gemmes automatisk og kan gennemgås senere off-line.

4. Automatiseret Image Analysis

  1. Vælg 'Confluence' ansøgning.
  2. I fanen 'Analysis', juster APPLICation indstillinger (f.eks "præcision": lav, normal, høj, "intensitet tærskel": 1 - 15) for at frembringe en præcis segmentering omkring klumpformet, herunder celle-processer og invadopodia strækker sig ind i BMM (se figur 1). Juster indstillingerne for hver tumor cellelinie og / eller på forskellige tidspunkter. Den "Confluence 'ansøgning måler% af brønden areal dækket af de invaderende celler, i den valgte FOV.
  3. Kontrollér, at indstillingerne for analyse er passende (dvs. segmentering er nøjagtig) for andre spheroids i pladen ved at klikke på et par forskellige brønde. Hvis segmentering ikke præcist skitsere en klumpformet, justere indstillingerne programmets yderligere.
  4. Klik på 'Start analyse «.
  5. På fanen 'resultater', tjek flere brønde til at kontrollere analysen kvalitet. Export "Nå niveau data« til et regnearksprogram.
  6. Repeat analyse for alle tidspunkter. Beregn den gennemsnitlige% sammenløb for replikatbrønde og plot invasion (% konfluens) mod tiden i et søjlediagram, der anvender videnskabelige graftegning og statistisk software af valg.

5. Manuel Image Acquisition

  1. Optage et billede for hver tumor sfæroide med intervaller startende fra t = 0 op til 72-96 timer, afhængigt af hastigheden af ​​invasionen af ​​cellelinjen pågældende, under anvendelse af et omvendt mikroskop (for en 96-brønds plade dette tager ca. 20 - 30 min). Brug en 10X objektiv. Brug en 4X objektiv, når et invaderede område er for stort til at blive helt fanget i 10X synsfelt.
  2. Gemme hvert enkelt billede erhvervet.
  3. Til kalibrering, tage billeder af en scene stregglasset (1 mm) ved hjælp af både 10X og 4X mål (og gemme billeder).

6. Manuel billedanalyse

  1. Åbne fase stregglasset billeder ind i billedanalyse-software af valg.
  2. Indtast Greaticule målinger enhederne (pm), de mål, der anvendes (10X eller 4X), og udføre kalibreringen. Dette trin er kun nødvendigt en gang. Til efterfølgende billedanalyse, blot genindlæse de nødvendige indstillinger kalibrering.
  3. Åbn invasion assay billederne og vælge indstillingerne kalibrering afhængigt af mikroskop mål (10X eller 4X), der anvendes til at opnå billeder.
    1. Alternativt importere billeder opnået på et billeddannende cytometer (trin 3) og analysere manuelt, som beskrevet for billeder opnået under anvendelse af et omvendt mikroskop (se resultaterne vist i figur 3 og figur 4).
  4. Mål det område, sfæroiderne.
    1. I softwaren her anvendes til Repræsentative resultater (for specifikationer se tabel af udstyr og materialer), gå til 'Mål' og vælg 'Count / størrelse «. Valgte derefter 'Indlæs indstillinger' 'Filer' og vælg forudbestemt ASSAy indstillinger. Så vælg 'Count ". Sfæroiden bør derefter nøjagtigt segmenteret.
    2. Alternativt gå til 'Rediger' og derefter 'Tegn / Flet objekter' at åbne 'Magic Wand / Trace' vindue. Brug staven cursoren til at klikke på klumpformet billedet og få segmentering. Vælg 'Trace "(i" Magic Wand "vindue) for manuelt at skitsere klumpformet bruge en mus.
  5. Eksport målinger af forskellige parametre (område, diameter, perimeter etc.) til et regneark. Optag på regnearket relevante billedinformation (f.eks godt nummer, relative tidspunkt).
  6. Plot den gennemsnitlige areal replikater spheroids (invasion) versus tid ved hjælp af videnskabelige graftegning og statistisk software. Alternativt beregne ændringen i klumpformet område ved hvert tidspunkt i forhold til området ved t = 0. Derefter plot invasion (% t0) mod tiden som en lineær graph.

Representative Results

3D tumor klumpformet invasion vurderes hjælp af en simpel, reproducerbar, automatiseret metode skematisk illustreret i Figur 1: reproducerbart størrelse tumor sfæroider opnås ved udpladning celler i ULA 96-brønds rundbundede plader. 4 dage efter initiering sfæroider er indlejret i BMM. Dette tilvejebringer en halvfast struktur, hvori tumorceller invadere og spredes ud af sfæroide. Sfæroider er placeret centralt i bunden af ​​hver brønd og invasion i BMM let overvåges med intervaller startende fra t = 0 op til 72-96 timer under anvendelse af et billeddannende cytometer. Dette kan tilvejebringe fuldt automatiseret billedanalyse.

Eksempler på forskellige typer af kræft celle invasion er illustreret i figur 2 -. 4 Den stærkt malign human glioblastoma multiforme (GBM) cellelinje U-87 MG, danner en tæt, kugleformet 3D-struktur og bruges her til at eksemplificere hjernetumorer, hvor lokale invasion er et centralt livstruendefunktion. Når indlejret i BMM, celler fra U-87 MG sfæroider spredt med en typisk "starburst" invasion mønster 12. Tumorceller radialt strækker sig ind i matrix, hvori de opretholder en 3-dimensional form. Processen er fulgt over en periode på 72 timer som vist i figur 2 for U-87 MG sfæroider, når omfanget af tumorcelleinvasion, med angivelse af de cellulære processer og invadopodia strækker sig ind i BMM fremgår klart. Fuldt automatiseret billedanalyse under anvendelse af et billede cytometer muliggør nøjagtig kvantificering af invasion tumorcellen over tid. Kvantificeringen i figur 2 opnås som vist i figur 1, hvor den automatiserede analyse producerer segmentering omkring cellen fremspring strækker sig ind i BMM fra U-87 MG klumpformet krop. Bemærk, at for denne cellelinie tumoren klumpformet organ udelukket fra målingen af ​​den invaderede område.

En anden mønster af invasion blev vist af menneskelige skællede hoved og hals kræft cellelinjer. CAL S og CAL R er isogene men CAL S er følsom over for, og CAL R resistente over for EGFR tyrosinkinaseinhibitorer 14. I fravær af EGF, hverken cellelinie invaderet i BMM (figur 3) imidlertid som koncentrationen af EGF blev forøget (til 2,5 ng / ml), sfæroiderne tilsyneladende »bud«. Ved de højere koncentrationer af EGF (40 og 80 ng / ml) graden af ​​invasion blev reduceret. Dette er i overensstemmelse med den klassiske klokkeformet dosisrespons til EGF i form af invasion, der tidligere er blevet rapporteret 15. I 20 ng / ml EGF, finger-lignende fremspring ekstruderet fra hoveddelen af CAL R spheroids mens CAL S celler mindre invasiv efter 72 timer (figur 3). Denne differentielle invasion var tydelig 48 timer efter sfæroider blev anbragt i BMM (indeholdende 20 ng / ml EGF for maksimal forskel mellem cellelinier) Og størst efter 72 timer (figur 4). Disse billeder blev erhvervet hurtigt ved hjælp af en imaging cytometer, som for U-87 MG. Men i dette tilfælde, for at eksemplificere en alternativ metode, blev graden af invasion kvantificeret manuelt med enkeltstående billedanalyse-software og præsenteres grafisk (figur 3 og 4). Disse resultater illustrerer en fænotypisk forskel mellem lægemiddel-sensitive og resistente celler, der kunne bruges til at screene for forbindelser, som specifikt vil antagoniserer det drug-resistente, invasiv fænotype.

Figur 1
Figur 1. Skematisk oversigt over 3D tumor klumpformet invasion assay. Arbejdsgangen viser de trin involverer fremgangsmåden herunder repræsentative billeder af U-87 MG glioblastom sfæroider lige efter indlejring i BMM (toppanel; t = 0) og efter invasionen ind BMM (nederste panel, t = 72 timer) med og uden segmentering, der måler det område, de invaderende celler. Bar = 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. Tidsforløb af U-87 MG glioblastom klumpformet invasion ind BMM. U-87 MG sfæroide 3D ​​invasion ind BMM blev overvåget og kvantificeret op til 72 timer under anvendelse af et billeddannende cytometer. (A) Repræsentative billeder og (B) kvantificering af tumorcelleinvasion er vist. Bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

re 3 "src =" / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
Figur 3. CAL R (resistent) og CAL S (følsomme) tumor klumpformet invasion. (A) Repræsentative billeder og (B) manuel kvantificering af EGF dosisafhængig CAL R og CAL S tumor klumpformet invasion er vist. Bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. Celler fra CAL R (resistente) spheroids er mere indgribende end CAL S (følsomme) tumor spheroids når de placeres i BMM. Ved EGF stimulation CAL R tumor kugler viser en mere udtalt invasion end CAL S. (A) Repræsentative billeder og (B) manuel kvantificering af invasion er vist. Bar = 500 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De to tumormodeller beskrevet her (glioblastoma og SCCHN) blev specifikt udvalgt til at eksemplificere vores 3D assay som de er klinisk relevante lokalt invasive cancere med et uopfyldt behov for effektive behandlinger 12. Efter lægemiddelbehandling, vurdering af in vitro farmakodynamiske (PD) biomarkør ændringer kan udføres nemt ved western blot eller immunoassays af lysater efter anvendelse af specifikke kommercielt tilgængelige reagenser for at tillade cellerestitueringen fra BMM og / eller immunofluorescens-analyse af invaderende tumor sfæroider ved hele mount farvning.

Denne invasion assay er en nyttig teknik til hurtig og reproducerbar bedømmelse af tumorcelleinvasion i et halvfast medium, og derfor særligt egnet til fremtidig in vitro drug screening. Kræftceller invadere matrixen i en 3D måde som de spredes ud fra et "mikro-tumor", repræsenteret ved tumoren klumpformet, og strækker sig ind i en extracellular matrix-lignende miljø. Den sande tredimensionalitet af assayet er tydelig i cellemorfologi, som er forskellig fra den flade, vedhængende morfologi celler antager, når de flytter på et fast substrat. Graden af ​​invasion er let kvantificeres under anvendelse af enten et billeddannende cytometeret, giver en automatiseret udlæsning, eller ved anvendelse af en standard mikroskop i kombination med imaging software. Desuden er denne metode er egnet til fluorescerende billeddannelse 13 (for eksempel med cellelinjer, der udtrykker fluorescerende proteiner eller pre-mærket med fluorescerende farvestoffer).

Fremgangsmåden er enkel at udføre med den eneste kritiske trin repræsenteret ved tilsætning af BMM, når der er risiko for at forstyrre den centrale position af klumpformet i det U-formede godt. Dette kan resultere i suboptimal billedanalyse, med sfæroider i forskellige fokale planer. Det er derfor afgørende at tilføje BMM forsigtigt og langsomt til hver brønd. Efter BMM tilsætning er det tilrådeligt at tjekke pladenunder et mikroskop, og hvis lokalisering anses uacceptabel, kan dette afhjælpes ved forsigtig centrifugering. Med erfaring, det er sjældent nødvendigt. Mens denne metode er robust og meget reproducerbar, kunne inter-eksperimentel variation forekomme med forskellige batches af BMM. For at undgå dette, er det tilrådeligt at købe tilstrækkelig BMM fra en enkelt batch for at fuldføre en række undersøgelser.

En begrænsning af fremgangsmåden (som for sådanne assays) er vanskeligheden ved at skelne mellem invasion og proliferation, som tumorcellerne sandsynligvis undergår under analysen tidsramme. Selv om der kan tages fordoblingstiden af ​​celler i betragtning, eller celle cyklus inhibitorer, såsom cytochalasin D indført, er det ikke let at kontrollere eller klar sondring mellem disse to forskellige aspekter af tumorprogression, især for hurtigt voksende tumorceller og for dem, have en mere "ekspansiv", snarere end infiltrativ, invasion mønster. Af denne grundforeslås det, at en parallel 3D vækst assay udført for at vurdere virkninger af eventuelle inhiberende eller stimulerende midler. Hvis omhyggelig dosis-respons undersøgelser udføres, kan det være muligt at vælge koncentrationer, der minimerer virkningerne på proliferation. For eksempel har vi vist, at HSP90 inhibitor 17-AAG inhiberer U-87 MG 3D tumor klumpformet invasion allerede ved 24 timer og ved koncentrationer under den koncentration, der hæmmer 3D vækst med 50% (GI 50) 12.

På den anden side, betydningen af dette assay sammenlignet med andre standard invasion assays (f.eks filter baseret assays eller invasion af enkelte celler i 3D matricer 1), er, at tumorceller invaderer ind i den omgivende matrix fra klumpformet, der ligner en " mikro-tumor "eller en" mikro-metastaser ", og derfor tager højde vigtige aspekter af patofysiologien af ​​en tumor masse. Den metode, vi præsenterer giver oplysninger omkollektive adfærd af tumorceller, når oprindeligt forlader sfæroiderne, og også individuelt, når enkelte celler nå fjernere regioner i BMM. Derudover kan celler i tumor spheroids opleve hypoxi og næringsstoffer afsavn som gennem ændringer i genekspression, kan fremme migration og invasion; disse elementer er fraværende i 2D assays. Desuden alt dette er tilgængelig i en high-throughput format ved anvendelse af specifikke 96-brønds plader og den seneste imaging teknologi, hvilket tillader en mere kompleks 3D assay til nemt bruges i målvalidering og lægemiddelforskning.

Fremgangsmåden præsenterer vi kan rumme yderligere ansøgninger at behandle yderligere aspekter af tumorcelleinvasion. Især kan ekstra kompleksitet overvejes ved tilsætning af værtsceller, såsom fibroblaster og / eller endotelceller, i sfæroid selv eller den omgivende matrix. Dette kan også modificeres, ikke blot med hensyn til stivhed (ved anvendelse af forskellige concentrations af BMM), men også i form af sammensætning (ved tilsætning af andre komponenter er afhængige af specifikke væv / organ vedtagne tumor model: f.eks tenascin for hjerne kræft 16 og kollagen til brystcarcinom 17).

En lignende konfiguration (generering af sfæroider og billeddannelse) kan også tilpasses til at vurdere vævsinvasion i 3D, hvor tumor sfæroider dyrkes sammen med embryoide legemer ligner en kompleks væv 12 eller med andre cellespecifikke organoids (f.eks astrocytter til gliom 18 eller krypt kulturer til gastrointestinale kræftformer), men yderligere arbejde er påkrævet for at gøre det muligt for automatiseret billedanalyse.

Disclosures

Alle forfattere erklære nogen konkurrerende interessekonflikt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134, (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57, (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8, (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147, (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15, (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205, (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34, (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5, (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49, (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7, (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354, (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155, (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12, (6), 453-463 (2010).
Tre-Dimensional (3D) Tumor Sfæroide Invasion Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).More

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter