Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

doi: 10.3791/52686 Published: May 1, 2015

Abstract

Вторжение окружающих нормальных тканей, как правило, считается признаком ключ злокачественной (в отличие от доброкачественных опухолей). Для некоторых видов рака, в частности (например, опухоли головного мозга, такие как глиобластомы и плоскоклеточного рака головы и шеи. - ПРГШ) это причиной тяжелой заболеваемости, и может быть опасным для жизни даже в отсутствие отдаленных метастазов. Кроме того, рак, которые рецидив после лечения, к сожалению, часто присутствует с более агрессивным фенотипа. Таким образом, существует возможность для целевой процесс вторжения в создании новых методов лечения, которые могли бы служить дополнением к стандартным антипролиферативным агентов. До сих пор эта стратегия не была затруднена из-за отсутствия надежных, воспроизводимых анализов, пригодных для детального анализа вторжения и для скрининга лекарственных средств. Здесь мы предлагаем простой способ микро-плиты (на основе форме, самоорганизации 3D сфероидов опухоли), которая имеет большой потенциал для такой ГТУумирает. Мы примером анализа платформу, используя человеческую линию клеток глиобластомы, а также модели, где ПРГШ развитие резистентности против целевой рецептор эпидермального фактора роста (EGFR ингибиторов) связано с повышенной потенциала матрицы-инвазивным. Мы также предоставляем две альтернативные методы полуавтоматической количественной: один с использованием изображений цитометр и второй, который просто требует стандартного микроскопа и изображения захват с цифрового анализа изображений.

Introduction

Классическая развитие противоопухолевый препарат в основном сосредоточены на использовании в пробирке клеточных анализов для выявления цитотоксических агентов, которые ингибируют пролиферацию опухолевых клеток и / или способствуют запрограммированной смерти клеток (апоптоза). В последнее время усилия были направлены на достижение целевых методов лечения с развитием ингибиторов лежащих в основе молекулярных причин распространения злокачественных клеток. Несмотря на впечатляющие результаты, такие агенты часто связаны с быстрым развитием лекарственной устойчивости. Учитывая, что это инвазивных и метастатический потенциал опухолевых клеток, что является ответственным за большинство случаев смерти от рака, и что рецидив болезни, часто представляет собой более агрессивный фенотип, логично также учитывать дополняют друг друга в пробирке экспериментальных моделях 1,2, чтобы идентифицировать новые агенты, которые ингибируют эти дополнительные ключевые признаки "" рака.

Во злокачественной прогрессии, опухолевые клетки приобретаютВозможность для вторжения в окружающие ткани и / или распространению в отдаленные органы (метастазирование). Раковые клетки проникают в базальную мембрану с образованием invadopodia 3,4. Эти структуры обогащенный актиновых филаментов, определенных адгезионных белков и протеиназы и несут коллективную ответственность за подвижности опухолевых клеток и деградации внеклеточного матрикса (ЕСМ) 5. Invadopodia расширить в ECM и, как полагают, важны для вторжения опухолевых клеток, а также в Экстравазационным сосудистых каналов, облегчая гематогенным (или) распространение лимфатической и метастазирование.

Современные методы стандартные для оценки опухолевых клеток вторжение в пробирке включают следующее. Transwell основе или Бойденом камеры анализы 2,6, где одноклеточных суспензий высевают на верхней части фильтра, покрытого толстым слоем ECM полученных белков. Затем клетки вторгнуться и двигаться в нижнюю камеру в ответ на химио-аттрактантов. Обычно используется ECMбелки типа коллагена, или базальная мембрана, как матрица (ВММ, например, Матригель, полученный из опухоли EHS 7), который имитирует естественный состав базальных мембран.

В качестве альтернативы, основанной на фильтре Boyden камерного типа анализов 8, клетки могут быть посеяны на верхней части ECM гель (к которому может быть добавлен фибробласты), где они образуют монослой, а затем по отдельности или в совокупности вторжение в гель. Вторжение может быть измерена в терминах числа вторжения клеток и / или пройденное расстояние от поверхности геля 9. Опухолевые клетки также могут быть полностью погружены в матрицу либо в виде суспензии отдельных клеток или сфероидов - обычно размещены между двумя слоями ECM Гель позволяет клеткам вторжение из массы опухоли в окружающую матрицу 2,6,10,11.

Трехмерная (3D) опухоли сфероид вторжение анализа, описанного здесь обеспечивает быстрое, автоматизированы системы вторжения, используя highlу воспроизводимым, стандартизованный метод 12 в формате 96-луночного планшета с одним сфероида на лунку. БММ добавляют непосредственно в каждую лунку, чтобы обеспечить полутвердой матрице, в которую опухолевые клетки проникают из тела сфероида. Степень инвазии опухолевых клеток контролируется с интервалом в течение 72 - 96 часов. Этот метод имеет следующие преимущества по сравнению с существующими вторжения анализов в пробирке, упомянутых выше: опухолевые клетки организованы в 3D структуры имитируя микрорегион опухоли или микро-метастазы; опухолевые сфероиды высокой воспроизводимостью по размеру; Вторжение анализ выполняется на месте в той же пластинке, как развитие опухоли сфероида, без необходимости перемещать их для вторичных пластин; Метод, в сочетании с новейшими технологиями автоматизированного анализа изображений, позволяет как высокое содержание и высокая пропускная способность анализа вторжения опухолевых клеток.

Анализ изображений проводят с помощью визуализации цитометра, который сканирует 96-луночногоплита течение 10 мин. При использовании приложения слияния, степень и скорость вторжения достигнуто либо путем одиночных клеток или путем распространения кластеров клеток из опухолевых сфероидов и проникают в матрицу может быть измерена в динамической моде. Для меньшей пропускной способности, альтернативный метод для анализа изображений представлена ​​на основе использования инвертированного микроскопа и стандартной обработки изображений.

Protocol

1. Генерация воспроизводимо Sized опухолевых сфероидов

  1. Мойка опухолевых клеток монослоев фосфатным буферным раствором (PBS; 5 мл в течение 25 см 2 или 8 - 10 мл на 75 см 2 колбу), добавить диссоциации клеток фермент (1 мл на 25 см 2 или 2 мл в течение 75 см 2 колбу) и инкубируют клетки при 37 ° С в течение 2 - 5 мин.
  2. Проверка открепления клеток под микроскопом и нейтрализовать диссоциации клеток фермент с полной среде роста (5 мл на 25 см 2 или 8 мл на 75 см 2 колбу).
  3. Центрифуга клеточной суспензии при 500 мкг в течение 5 мин.
  4. Удалить супернатант, нажмите трубку и повторно приостанавливать осадок клеток в 1 мл полной среды роста с использованием пипетки P1000. Это должно привести к суспензии отдельных клеток без кластеров клеток.
  5. Граф клеток с использованием гемоцитометра и разбавленной клеточной суспензии, чтобы получить 0,5 - 2 х 10 4 клеток / мл (необходимо оптимальное плотность клеток, которые будут определены для каждой линии клеток в Order получить опухолевые сфероиды 300 - 500 мкм, диаметр 4 дней после посева клеток 12,13).
  6. Передача клеточной суспензии в стерильную резервуара и, используя многоканальную пипетку, обойтись 200 мкл / лунку в сверхнизкой крепления (ULA) 96-луночных круглодонных планшетах 12.
  7. Передача пластины инкубаторе (37 ° С, 5% СО 2, 95% влажности). Четыре дня спустя, визуально подтвердить образование сфероид опухоли и приступить к 3D вторжения анализа.

2. 3D опухоли Сфероид Вторжение Пробирной

  1. Оттепель BMM на льду.
  2. Хранить набор стерильные наконечники пипеток с фильтром для Р10, Р200 и P1000 пипетки и стерильные пробирки (1,5 мл объема или больше в зависимости от общего объема, необходимого) при -20 ° С.
  3. Поместите 96-луночные планшеты, содержащие ULA 4-дневных сфероидов на льду.
  4. Используя многоканальную пипетку, аккуратно удалите 100 мкл / лунку среды роста от сфероида пластин. Для этого шага угла советы по направлению к INside стенка U-образным дном лунок, избегая контакта с нижней части скважины и расположение сфероидов; свести к минимуму нарушение сфероидов.
  5. Использование ледяной советы, передавать BMM к ледяной труб. Для цитокин-индуцированный вторжения или оценочных исследований препарат, добавить реагенты (в 2х конечная концентрация) в СМЛ с использованием ледяной советы. Например, можно использовать эпидермальный фактор роста (EGF), чтобы стимулировать нашествие плоскоклеточный клеток карциномы лицензия CAL S и R. Все хорошо перемешать, вращая нежно, избегая образования пузырьков.
  6. Аккуратно внесите 100 мкл СМЛ в U-нижней скважины, направленный кончик к внутренней стенке колодца. Этот шаг является самым важным, как, для оптимального анализа изображений, сфероиды должны оставаться в центре скважины 12.
  7. Повторите шаг 2.6 для всех требуемых скважин, позволяющих 5 - 6 репликантов / состояние. При необходимости изменить в свеже-охлажденного наконечника.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При более опытный, dispenSE ВММ с помощью многоканальной пипетки.
  8. Использование стерильной иглой, удалить пузырьки, если они присутствуют.
    1. Использование микроскопа, визуально проверить, что сфероиды в центральном положении. Если нет, центрифуги пластины при 300 х г в течение 3 мин при 4 ° С. Это будет гарантировать, что сферические расположены в центре каждой лунке.
  9. Передача пластину инкубаторе при 37 ° С и позволяют БММ затвердеть.
  10. 1 час спустя, с помощью многоканальной пипетки, осторожно добавить 100 мкл / лунку полной среды роста. Для цитокин-индуцированной вторжение или оценки лекарственных средств исследований, включают в себя цитокины или ингибиторов в среде (1x конечной концентрации). Кроме того, если реагенты не были добавлены к СМЛ в шаге 2.5, добавить их в среде в этой точке (3x желаемой конечной концентрации).

3. Автоматизированная Image Acquisition

  1. Сканирование пластины на цитометром (спецификацию см таблицу оборудования и материалов) на интервалах ГНАrting время от нуля (t0 = день вторжения анализа создана, сразу после этапа 2.10 до 72 ч, или 96 ч для более медленных вторжения опухолевых клеточных линий.
  2. Выберите приложение "Слияние".
  3. Убедитесь, что сфероид находится в фокусе и, при необходимости, отрегулировать вручную и зафиксировать "Фокус смещены.
  4. В разделе "сэмплирования настройки», выберите сканирования одной центральное поле зрения (FOV). После того ВММ, опухолевые сфероиды должен был жить в центральном положении, таким образом, нет необходимости сканировать весь колодец.
  5. В программном обеспечении, определить скважины для сканирования, выделив их на тарелке карте. Нажмите на "Начать проверку".
    ПРИМЕЧАНИЕ: сканирование автоматически сохраняются и могут быть просмотрены позднее в автономном режиме.

4. Автоматизированный анализ изображения

  1. Выберите приложение "слияния".
  2. В вкладке "Анализ", отрегулируйте ApplicНастройки вания (например, "точность": низкий, нормальный, высокий, "пороговая интенсивность": 1 - 15) для получения точного сегментирования вокруг сфероида, в том числе клеточных процессов и invadopodia проходящих в СМЛ (рисунок 1). Настройте параметры для каждой линии опухолевых клеток и / или в различные моменты времени. В '' слияния приложений меры% площади, покрытой а вторгшимися клеток, в выбранном поле зрения.
  3. Убедитесь, что настройки анализа являются подходящими (то есть, сегментация является точной) для других сфероидов в пластине, нажав на несколько различных скважин. Если сегментация не точно очертить сфероид, настроить параметры программы в дальнейшем.
  4. Нажмите на кнопку "Пуск анализ.
  5. На вкладке «Результаты», проверить несколько скважин, чтобы проверить качество анализа. Экспорт "Ну уровня данных" в программе электронных таблиц.
  6. Repeaт анализ для всех временных точках. Рассчитайте среднее% слияния для повторных лунок и участок вторжения (%) против слияния время в виде гистограммы, используя научную графиков и статистического программного обеспечения выбора.

5. Руководство Image Acquisition

  1. Запись изображения для каждого сфероида опухоли с интервалом, начиная с Т = 0 до 72 - 96 ч, в зависимости от скорости вторжения в клеточной линии в вопросе, с использованием инвертированного микроскопа (для 96-луночного планшета это занимает около 20 - 30 мин). Используйте цель 10X. Использование цели 4X при вторжению область слишком велика, чтобы быть полностью захвачен в поле зрения 10Х.
  2. Сохранить каждое отдельное изображение приобретенные.
  3. Для калибровки принять образы этап масштабной сетки (1 мм), используя обе цели 10X и 4X (и сохранять изображения).

6. Руководство Анализ изображения

  1. Откройте этап картографической сетки изображения в анализа изображений программное обеспечение выбора.
  2. Введите Graticule измерения, единицы (мкм), цели используется (10X или 4X) и выполнить калибровку. Этот шаг необходим только один раз. Для последующего анализа изображений, просто перезагрузить необходимые параметры калибровки.
  3. Откройте для анализа изображений вторжения и выберите параметры калибровки в зависимости от объектива микроскопа (10X или 4X) используется для получения изображения.
    1. Кроме того, импорт изображения, полученные на визуализации цитометрии (шаг 3) и проанализировать вручную, как описано для изображений, полученных с помощью инвертированного микроскопа (см результаты, показанные на рисунке 3 и рисунке 4).
  4. Измерьте площадь, покрытую сфероидов.
    1. В программном обеспечении, используемом здесь представительных результатов (спецификацию см таблицу оборудования и материалов), перейдите в "меру" и выберите "Count / размер". Выберите "Файл", затем "Загрузить настройки" и выберите предварительно определенную ASSAу настройки. Затем выберите 'Count'. Сфероид, то следует точно сегментирован.
    2. Кроме перейдите в "Edit", затем "Ничья / Слияние объектов", чтобы открыть окно "Волшебная палочка / след". Используйте курсор палочка нажать на изображение сфероида и получить сегментацию. Выберите «следы» (в окне «волшебную палочку»), чтобы вручную выделить сфероид с помощью мыши.
  5. Экспорт измерения различных параметров (площадь, диаметр, периметр и т.д.) в таблицу. Запись на таблицу релевантные данные изображения (например, количество и относительная момент времени).
  6. Участок средней площади повторных сфероидов (вторжения) в зависимости от времени, используя научную графиков и статистического программного обеспечения. Кроме того, рассчитать изменение сфероида области на каждый момент времени, по отношению к области при Т = 0. Тогда участок вторжение (% t0) в зависимости от времени в качестве линейного грател.

Representative Results

3D опухоли сфероида вторжения оценивается с использованием простой, воспроизводимый автоматизированный способ схематически показано на рисунке 1: воспроизводимо размера опухолевых сфероидов получены путем посева клеток в ULA 96-луночных круглодонных планшетах. 4 дней сфероидов после инициации встроены в СМЛ. Это обеспечивает полутвердой структуру, в которую опухолевые клетки проникают и распространяются из сфероида. Сфероиды, расположенный в центре на базе каждую лунку и инвазии в СМЛ легко контролировать с интервалом, начиная с Т = 0 до 72 - 96 ч с использованием изображений цитометра. Это может обеспечить полностью автоматизированный анализ изображения.

Примеры различных типов инвазию раковых клеток показаны на рисунках 2 -. 4 высоко злокачественной человек глиобластома (GBM) клеточной линии U-87 мг, образует плотную, сферическую 3D структуру и используется здесь для иллюстрации опухоли головного мозга, в котором локальная вторжение ключ опасным для жизниособенность. После того, как встроенный в СМЛ, клетки U-87 МГ сфероидов распространяются с типичной "звездообразования" вторжение рисунка 12. Опухолевые клетки в радиальном направлении в матрицу, в которой они поддерживают 3-мерную форму. Процесс следует в течение 72 ч, как показано на рисунке 2 для U-87 мг сфероидов, когда степень инвазии опухолевых клеток, деталей этих клеточных процессов и invadopodia проходящих в СМЛ ясно видно. Полностью автоматизированные анализа изображения используется изображение цитометра обеспечивает точное количественное определение опухолевых клеток вторжения с течением времени. Количественное на фиг.2, получены, как показано на рисунке 1, где автоматизированного анализа производит сегментирование вокруг клеточных выступов, простирающихся в СМЛ с U-87 мг сфероида тела. Обратите внимание, что для этой клеточной линии, сфероид тела опухоли исключается из измерения проникновения области.

Иная картина в INVASион отображается плоскоклеточного головы и шеи клеточных линий рака человека. CAL S и R CAL изогенны но CAL S чувствителен к, и лицензия R устойчивы к EGFR тирозин киназ ингибиторов 14. При отсутствии EGF, ни клеточной линии захвачена в BMM (фиг.3), однако, как было увеличено содержание EGF (2,5 нг / мл), сфероиды представляется, "зародыш". При более высоких концентрациях EGF (40 и 80 нг / мл) степени вторжения была уменьшена. Это согласуется с классической колоколообразной зависимости от дозы к EGF в плане вторжения, что уже сообщалось ранее 15. В 20 нг / мл EGF, палец, как выступы, экструдированные из основного корпуса лицензия R сфероидов, пока CAL S клеток были менее инвазивными после 72 ч (рис 3). Этот перепад вторжение было очевидно 48 ч после сфероиды были помещены в BMM (содержащей 20 нг / мл EGF в течение максимального различия между клеточными линиями) И самый большой после 72 часов (Рисунок 4). Эти изображения были получены с помощью быстро изображений цитометра, а для U-87 MG. Тем не менее, в этом случае, чтобы проиллюстрировать альтернативный метод, степень инвазии количественно вручную с помощью программного обеспечения для анализа изображений автономного и представлены графически (Рисунки 3 и 4). Эти результаты иллюстрируют различие между фенотипической лекарственной чувствительностью и резистентными клетками, которые могут быть использованы для скрининга соединений, которые специфически противодействуют устойчивых, инвазивного фенотипа наркотиков.

Фигура 1
Рисунок 1. Схема обзор 3D опухоли сфероида вторжения анализа. Рабочий процесс показывает шаги метод предполагает в том числе представительных образов U-87 MG глиобластомы сфероидов только после встраивания в СМЛ (верхнюю панель; Т = 0) и после вторжения в ВММ (нижней панели; Т = 72 ч) и без сегментации, который измеряет площадь, покрытую вторжения клеток. Бар = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Время-курс U-87 MG глиобластомы сфероида вторжения в ВММ. U-87 MG сфероида 3D вторжения в СМЛ контролировали и количественно до 72 часов с использованием изображений цитометра. () Типичные изображения и (В) количественная оценка Вторжение опухолевых клеток показаны. Бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Re 3 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
Рисунок 3. CAL R (устойчивы) и CAL S (чувствителен) опухоли сфероида вторжения. (А) Типичные изображения и (Б) ручное определение количества EGF дозозависимым CAL R и S CAL опухоли сфероида вторжения показаны. Бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4. Клетки CAL R (резистентные) сфероидов более агрессивны, чем CAL S (чувствительные) опухолевых сфероидов при размещении в BММ. ​​При стимуляции EGF CAL R опухолевые сфероиды показывают более выраженную, чем вторжение CAL S. (A) Типичные изображения и (В) ручного количественное вторжения показаны. Бар = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Discussion

Эти две модели опухоли, описанные здесь, (глиобластомы и ПРГШ) были специально выбраны для иллюстрации нашего анализа 3D, как они клинически значимых локально инвазивного рака с неудовлетворенной потребности в эффективных методов лечения 12. После медикаментозного лечения, оценки в пробирке изменений фармакодинамических (PD) биомаркеров может быть выполнена легко вестерн-блоттинга или иммунологических лизатов после использования специальных коммерчески доступных реагентов, чтобы позволить восстановление клеток от СМЛ и / или иммунофлуоресцентного анализа вторжения опухолевых сфероидов по вся Крепление окрашивание.

Это вторжение анализ является полезным методом для быстрого и воспроизводимого оценки вторжения опухолевых клеток в полутвердой среде и, следовательно, особенно подходит для будущего в пробирке скрининга наркотиков. Раковые клетки проникают в матрицу в 3D, как они распространяются от "микро-опухоль», в лице сфероида опухоли, а также расширить в extracellulAR-матрица, как окружающая среда. Истинный трехмерность анализа проявляется в морфологии клеток, который отличается от плоской, прилипшего морфологии клетки предполагать при перемещении на твердой подложке. Степень инвазии легко количественно с использованием либо изображений цитометра, позволяя автоматизированную считывания или с помощью стандартного микроскопа в сочетании с программным обеспечением обработки изображений. Кроме того, этот способ пригоден для флуоресцентных изображений 13 (например, с клеточных линий, экспрессирующих флуоресцентные белки или предварительно меченных флуоресцентными красителями).

Метод прост в исполнении, с той лишь критической стадии, представленной добавлением СМЛ, когда существует риск нарушения центральное положение сфероида в U-образную форму и. Это может привести к неоптимальной анализа изображений, с сфероидов в различных фокальных плоскостях. Поэтому очень важно, чтобы добавить BMM осторожно и медленно, чтобы каждый хорошо. После того ВММ целесообразно проверить плитупод микроскопом и, если локализация считается неприемлемым, это может быть исправлено путем осторожного центрифугирования. С опытом, это редко. Несмотря на то, этот метод является надежным и очень воспроизводимые, в-экспериментальное изменение может произойти с различными партиями СМЛ. Чтобы избежать этого, желательно, чтобы приобрести достаточное BMM из одной партии, чтобы завершить цикл исследований.

Ограничением метода (как и для любых таких анализов) является трудность в различении инвазии и пролиферации, который опухолевые клетки, скорее всего пройти во время проведения анализа кадра. Хотя время удвоения клеток может быть принято во внимание, или ингибиторы клеточного цикла, такие как цитохалазином D введена, она не так легко контролировать или четко различать эти два различных аспектов прогрессирования опухоли, особенно для быстрорастущих опухолевых клетках, и для тех, кто имеют более "обширный", а не инфильтративный, вторжение шаблон. По этой причинеон предположил, что параллельно 3D анализ роста осуществляется для оценки конкретных последствий любых тормозных или стимулирующих агентов. Если исследования отклика осторожность дозы выполняются, то можно выбрать концентрации, которые минимизируют воздействие на пролиферацию. Например, мы показали, что ингибитор HSP90 17-AAG ингибирует U-87 мг 3D опухоли сфероид вторжение уже через 24 часа и при концентрациях ниже концентрации ингибирования 3D рост на 50% (GI 50) 12.

С другой стороны, значение этого теста по сравнению с другими анализов стандартное инвазии (например, фильтровать на основе анализов или вторжения одиночных клеток в 3D матриксе 1), является то, что опухолевые клетки проникают в окружающую матрицу из сфероида, который напоминает " микро-опухоль "или" микро-метастазы ", и, следовательно, принимает во внимание важные аспекты патофизиологии опухолевой массы. Метод, который мы представляем предоставляет информацию околлективное поведение опухолевых клеток, когда изначально, оставляя сфероидов, а также индивидуально, когда отдельные клетки достигают более отдаленные регионы СМЛ. Кроме того, клетки в опухоли сфероидов могут возникнуть гипоксия и питательных веществ лишения, которые, через изменения в экспрессии генов, может способствовать миграции и инвазии; такие функции отсутствуют в 2D анализов. Более того, все это доступно в формате высокой пропускной посредством использования конкретных 96-а и новейших технологий обработки изображений, что позволяет более сложным 3D анализа, чтобы быть легко использован в проверке целевого и лекарственных препаратов.

Метод, который мы представляем могут разместиться дополнительные приложения, чтобы удовлетворить дополнительные аспекты вторжения опухолевых клеток. В частности, дополнительные сложности могут быть предусмотрены путем добавления клетках-хозяевах, таких как фибробласты и / или эндотелиальных клеток, в самой сфероида или окружающей матрицы. Это также может быть изменен, не только с точки зрения жесткости (за счет использования различных COncentrations из СМЛ), но и с точки зрения состава (путем добавления других компонентов, зависящих от конкретной ткани / органа принятой модели опухоли: например, тенасцином для рака мозга 16 и коллагена для рака молочной железы 17).

Аналогичное установка (генерация сфероидов и изображений) могут также быть приспособлены для оценки тканевой инвазии в 3D, где опухолевые сфероиды совместно культивировали с эмбриональных телец, напоминающих сложную ткань 12 или с другими органоидам соты (например, астроциты для глиомы 18 или склеп культуры для желудочно-кишечного тракта рака), но требуется дальнейшая работа для автоматизированного анализа изображений.

Disclosures

Все авторы заявляют никакого конкурирующего конфликт интересов.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134, (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57, (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8, (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147, (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15, (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205, (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34, (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5, (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49, (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7, (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354, (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155, (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12, (6), 453-463 (2010).
Трехмерная (3D) опухоли Сфероид Вторжение Пробирной
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).More

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter