Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki

doi: 10.3791/52686 Published: May 1, 2015

Abstract

Tümörler (iyi huylu karşıt olarak), normal dokuların Invasion genel malign önemli bir özelliğidir olarak kabul edilir. Özellikle bazı kanserler için (. Örneğin, bu tür glioblastoma multiforme ve baş skuamöz hücreli karsinom ve boyun gibi beyin tümörleri - SCCHN) şiddetli bir morbidite nedenidir ve yaşamı tehdit eden uzak metastaz yokluğunda bile olabilir. Buna ek olarak, relaps kanserleri, ne yazık ki sık sık, bu daha agresif bir fenotip ile işleme tabi. Bu nedenle, standart anti-proliferatif ajanlar tamamlayıcı olabilir yeni tedavilerin sağlamak işgali sürecini hedef için bir fırsat var. Şimdiye kadar, bu strateji işgalinin ayrıntılı bir analiz için ve ilaç taraması için uygun, sağlam, tekrarlanabilir testlerinin olmaması engel olmuştur. Burada basit bir mikro-plaka yöntemi sağlayan (üniforma dayalı, kendinden montaj 3D tümör parçacıklarının) bu tür stu için büyük bir potansiyele sahipölür. Ayrıca, bir insan glioblastoma hücre çizgisi ve hedeflenen epidermal büyüme faktörü reseptörü (EGFR) engelleyicilerine karşı direnç gelişimi geliştirilmiş matris invaziv potansiyeli ile ilişkili bir SCCHN modeli kullanılarak analiz platformu örnekler. Sitometresi bir görüntüleme kullanarak tek ve basit bir dijital görüntü analizi ile standart mikroskopi ve görüntü yakalama gerektiren ikinci bir: Biz de yarı otomatik ölçümü iki alternatif yöntemler sağlar.

Introduction

Klasik kanser ilaç geliştirme, tümör hücresi çoğalmasını inhibe eden ve / veya programlanmış hücre ölümünü (apoptoz) teşvik sitotoksik maddelerin taranması için in vitro hücre-esaslı tahliller kullanımı büyük ölçüde odaklanmıştır. Daha yakın zamanlarda, çabalar habis hücre çoğalması yatan moleküler nedenlerinin inhibitörlerinin gelişimi ile hedefli tedavilerin doğru taşındı. Bazı muhteşem sonuçlara rağmen, bu tür maddeler genellikle ilaç direnci hızla gelişmesi ile ilişkilidir. Kanser ölümlerinin çoğundan sorumludur tümör hücrelerinin invaziv ve metastatik potansiyeli olduğunu ve nüks hastalık genellikle, bu in vitro deneysel modellerde romanı tanımlamak için 1,2 tamamlayıcı dikkate almak da mantıklı bir daha agresif fenotip sunduğu göz önüne alındığında bu kanser ek anahtar 'işaretlerinden' inhibe edecek ajanlar.

Habis ilerlemesi esnasında, tümör hücrelerinin eldeçevreleyen doku işgal ve / veya uzak organlara (metastaz) yayılabilir yeteneği. Kanser hücreleri invadopodia 3,4 oluşumu ile bazal membran nüfuz eder. Bu yapılar, aktin filamentler, belirli bir yapışma proteinleri ve proteinaz ile zenginleştirilir ve toplu tümör hücre motilitesi ve hücre dışı matrisi (ECM) 5 degradasyonundan sorumlu olan. Invadopodia ECM içine uzanır ve tümör hücre istilası için önemli olduğu ve aynı zamanda kan yoluyla (ya da lenfatik) yayılması ve metastazının kolaylaştıran, vasküler kanallara ekstravazasyonu inanılmaktadır.

Mevcut standart metotlar şunlardır, in vitro olarak tümör hücresi istilasını değerlendirmek. Transwell tabanlı veya Boyden haznesi deneyleri, tek hücre süspansiyonları, ECM-türevli proteinler kalın bir tabaka ile kaplanmış bir filtre üzerine ekilir 2,6. Hücreler daha sonra, istila ve kemo-cezbedici yanıt olarak alt bölme içine hareket eder. Yaygın kullanılan ECMproteinler tip I kollajenin, ya da temel zarların doğal bileşimi benzer (EHS tümöründen 7 türetilen BMM, örneğin, Matrigel), bir bazal membran benzeri bir matris.

Filtre tabanlı Boyden odasının tipi deneyleri 8 bir alternatif olarak, hücreler jel içine işgal ayrı ayrı veya topluca, sonra, bir tek tabaka ve biçim (fibroblastlar ilave edilebilir olduğu) bir ECM jel üzerine tohumlanabilir. Invasion jel yüzeyi 9 gitti işgal hücreler ve / veya mesafe sayısı cinsinden ölçülebilir. Genellikle hücreleri çevreleyen matris 2,6,10,11, tümör kütle üzerinden işgal etmeye izin ECM Jel- iki katman arasına yerleştirilen - Tümör hücreleri, aynı zamanda, bir matris içine ya tek bir hücre süspansiyonu olarak ya da küresel cisimler olarak gömülebilir.

Burada tarif edilen üç boyutlu (3D), tümör istilası küremsi tahlil bir highli kullanılarak hızlı, otomatikleştirilebilir istilası sistemi sağlarOyuk başına bir sfero sahip 96 oyuklu bir plaka formatında y tekrarlanabilir, standart bir yöntem 12. BMM tümör hücreleri, sferoid vücuttan işgal içine, bir yarı-katı bir matris sağlamak üzere her bir oyuğa, doğrudan ilave edilir. 96 saat - tümör hücresi istilasını derecesi 72 arasında bir süre boyunca aralıklarla izlenir. Bu yöntem, yukarıda belirtilen mevcut in vitro invazyon tahlilleri aşağıdaki avantajları sağlar: hücre, bir tümör mikro-bölge veya mikro-metastazı taklit 3D yapı halinde organize tümör; Tümör sferoidler boyutunda yüksek oranda tekrarlanabilir; işgali tahlil ikincil plakalara taşımak gerek kalmadan, tümör sfero geliştirme gibi aynı tabakta in situ yapılır; otomatik bir görüntü analiz son teknolojileri ile bir araya yöntem olup, her ikisi de yüksek oranda sağlar ve yüksek verimli, tümör hücresi istilasını analiz eder.

Görüntü analizi bir 96-yuvalı tarar sitometresi görüntüleme kullanılarak gerçekleştirilir10 dakika içinde plaka. Kesişme uygulamasını kullanarak, kapsamı ve istila oranı tek hücre ya da hücre kümeleri, tümör kürelerinden yayılan ve dinamik bir şekilde ölçülebilir matris içine işgal yoluyla elde. Düşük hacmi, görüntü analizi için alternatif bir yöntem, bir ters mikroskop ve standart görüntüleme yazılımının kullanılması göre sunulmuştur.

Protocol

Yeniden üretilebilir Ölçekli Tümör küremsi 1. Üretim

  1. Fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkayın, tümör hücre mono tabakaları (PBS; 25 cm2 veya 8 5 ml - 75 cm2 şişe için 10 ml), hücre ayrışma enzim (ekleme, bir 75 cm, 25 cm 2 için ise 1 ml ya da 2 ml'lik 5 dakika - 2 37 ° C'de 2 şişe) ve inkübe hücreleri.
  2. Mikroskop altında hücre ayrışması kontrol edin ve (75 cm 2 şişe için 25 cm, 2 veya 8 ml 5 ml) içinde tam bir büyüme ortamı ile hücre ayrışma enzimi etkisiz hale getirir.
  3. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleyin hücre süspansiyonu.
  4. Süpernatantı tüp dokunun ve P1000 pipet kullanarak tam büyüme ortamı 1 ml hücre pelet yeniden askıya. Bu, hücre kümeleri olmadan tek bir hücre süspansiyonu elde edilmelidir.
  5. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayın ve elde edilmesi için hücre süspansiyonu seyreltik 0,5-2 x 10 4 hücre / ml (optimum hücre yoğunluğu o, her bir hücre hattı için tespit edilmesi gerekmektedir) hücre 12,13 tohumlama sonra 500 mikron çaplı 4 gün - Sarf 300 tümör sferoidler elde etmek.
  6. De ultra düşük eki (ULA), 96-gözlü yuvarlak tabanlı plakalarda 12 içine / steril rezervuara hücre süspansiyonu aktarın ve bir çok kanallı pipet kullanarak 200 ul dağıtın.
  7. Bir inkübatör (37 ° C,% 5 CO2,% 95 nem) plakaları aktarın. Dört gün sonra, görsel tümör oluşumunu sfero onaylamak ve 3D işgali tahlil devam edin.

2. 3D Tümör Sfero Invasion Deneyi

  1. Buz üzerinde BMM çözülme.
  2. P10 için steril filtre ipuçları bir dizi tutun, P200 ve P1000 pipetler ve steril tüpler (1.5 ml hacim gerekli toplam hacmine bağlı olarak veya daha büyük) -20 ° C'de.
  3. Buz üzerinde 4-günlük sferoidler içeren ULA, 96 gözlü levhalar yerleştirin.
  4. Bir çok kanallı pipet kullanarak, yavaşça küremsi plakalardan büyüme ortamı içinde 100 ul / yuva çıkarın. Bu adım açısı için i yönünde ipuçlarıoyuk ve parçacıklarının konumu alt tarafı ile teması önleyen U tabanlı kuyu nside duvarı; sferoidlerin rahatsızlığı en aza indirmek.
  5. Buz soğukluğunda ipuçları kullanılarak, buzla soğutulmuş tüpler BMM aktarın. Ilaç değerlendirme çalışmaları sitokin kaynaklı işgali için veya, buz ipuçlarını kullanarak BMM için (2x nihai konsantrasyon) reaktifler ekleyin. Örneğin, CAL, S ve R, CAL skuamöz karsinom hücreleri istila uyarmak için, epidermal büyüme faktörü (EGF) kullanımı. Yavaşça dönen kabarcık oluşumunu kaçınarak iyice karıştırın.
  6. Hafifçe de iç duvarına doğru ucu amaçlayan U tabanlı kuyuya BMM 100 ul dağıtmak. Uygun görüntü analizi için, küremsi oyuk 12 merkezinde kalmalıdır, bu adım çok kritiktir.
  7. 6 çoğaltır / durumu - 5 sağlayarak gerekli tüm kuyuları, için yineleyin 2.6. Gerekirse, taze soğutulmuş ucu değiştirin.
    NOT: Daha deneyimli, dispenBir çok kanallı pipet kullanarak se BMM.
  8. Varsa steril bir iğne kullanarak, kabarcıkları.
    1. Bir mikroskop kullanarak, görsel sferoidleri merkezi bir konumda olduklarını kontrol edin. Eğer değilse, 4 ° C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj plaka. Bu sferoidler merkezi de her yer sağlayacaktır.
  9. 37 ° C'de bir kuluçka plaka transferi ve BMM katılaşmaya sağlar.
  10. 1 saat sonra, çok kanallı bir pipet kullanılarak, yavaşça 100 ul / tam büyüme ortamında kuyusunu ekleyin. Sitokinle indüklenen invazyonu veya ilaç değerlendirme çalışmaları için, ortam içinde adı geçen sitokin veya inhibitörleri (nihai konsantrasyon 1 x) içerir. Reaktifler adım 2.5 BMM ilave değil, alternatif olarak, (arzu edilen nihai konsantrasyonu 3x) bu noktada ortama ekleyin.

3. Otomatik Resim Alma

  1. Sitometresindeki Tarama plakalar aralıklarla sta de (özellikler için Ekipman ve Malzemeleri Tabloya bakınız)Hemen 72 saat ya da daha yavaş işgalci tümör hücre hatları için 96 saat kadar adım 2.10 sonra sıfır (t0 = kurmak işgali testinin gün zaman rting.
  2. 'Kavşak' uygulamayı seçin.
  3. Sfero odakta olduğunu kontrol edin ve gerekirse elle ayarlamak ve 'off-set Odak' düzeltin.
  4. (FOV) bir merkezi alan tarama seçeneğini 'Örnekleme ayarlara' altında. BMM ilave işleminden sonra, tümör sferoidler böylece tüm kuyu taramak için bir ihtiyaç vardır, merkezi bir konumda kalmıştır olmalıdır.
  5. Yazılımda, kuyular plaka harita üzerinde vurgulayarak taranacak tanımlar. 'Taramasını başlat' üzerine tıklayın.
    NOT: Tarama otomatik olarak kaydedilir ve daha sonra off-line gözden geçirilebilir.

4. Otomatik Görüntü Analizi

  1. 'Izdiham' uygulamasını seçin.
  2. 'Analiz' sekmesinde, Applic ayarlamaktirme ayarları (örneğin, "hassas": düşük, normal, yüksek; "yoğunluk eşiği": 1-15) BMM (Şekil 1) içine uzanan hücre süreçleri ve invadopodia dahil sfero etrafında kesin segmentasyon, üretmek. Her bir tümör hücre hattı için ve / veya çeşitli zaman noktalarında ayarları yapılır. 'Izdiham' uygulaması tedbirleri seçilmiş FOV içinde, işgalci hücreleri kapsadığı kuyu alanının%.
  3. Analiz ayarları birkaç farklı kuyuların tıklayarak plaka diğer sferoitlerin (yani, segmentasyon doğru) uygun olup olmadığını kontrol edin. Segmentasyon doğru bir sfero anahat etmezse, ayrıca uygulama ayarlarını yapın.
  4. 'Analizini başla' üzerine tıklayın.
  5. 'Sonuçlar' sekmesinde, analiz kalitesini doğrulamak için birden fazla kuyu kontrol edin. Bir elektronik tablo programı İhracat 'Eh düzeyinde veri'.
  6. Repeatüm zaman noktalarında t analizi. Bilimsel grafik ve seçim istatistiksel yazılımı kullanarak çoğaltmak kuyu ve bir çubuk grafik zamana karşı komplo işgali (% izdiham), ortalama% izdiham hesaplayın.

5. Manuel Görüntü Alma

  1. T = 0 72 başlangıç ​​aralıklarla her tümör sfero için bir görüntü kaydetmek - 96 saat, bu yaklaşık 20 alan bir 96-delikli plaka için bir ters mikroskop (kullanarak, söz konusu hücre çizgisi, istilası hızına bağlı olarak - 30 dakika). 10X objektif kullanarak. Bir işgal alanı tamamen görüş 10X alanı içinde çekilecek çok büyük olduğunda 4X hedefi kullanın.
  2. Edinilen her görüntü kaydetme.
  3. Kalibrasyon için, hem 10X ve 4X hedeflerini kullanarak bir sahne graticule (1 mm) görüntülerini almak (ve görüntüleri kaydetmek).

6. Manuel Görüntü Analizi

  1. Seçim görüntü analizi yazılımı içine sahne graticule görüntüleri açın.
  2. Grat girinicule ölçümler, birimler (um), hedefleri kullanılan (10X veya 4X) ve kalibrasyonu yapın. Bu adım sadece bir kez gereklidir. Sonraki görüntü analizi için, sadece gerekli kalibrasyon ayarlarını yükleyin.
  3. Işgali tahlil görüntüleri açın ve mikroskop objektif (10X veya 4X) bağlı kalibrasyon ayarları seçmek görüntüler elde etmek için kullanılır.
    1. Içbükey bir mikroskop kullanarak elde edilen görüntüler için tarif edildiği gibi (Şekil 3 ve Şekil 4'te gösterilen sonuçlar), alternatif olarak, alma ve görüntüler (aşama 3) sitometresi bir görüntüleme elde elle analiz eder.
  4. Sferoidler kapsadığı alanı ölçün.
    1. (Özellikleri Ekipman ve Malzeme Tablo bakın) Temsilcisi Sonuçlar Burada kullanılan yazılımlar, 'Tedbir' gidin ve seçmek ise '/ boyutunu Kont'. 'Dosya' ardından 'Load ayarları' seçti ve önceden belirlenmiş assa seçiny ayarlar. Ardından 'Kont' seçin. sfero sonra doğru parçalı edilmelidir.
    2. Alternatif 'Sihirli Değnek / Trace' penceresini açmak için 'Nesneleri Birleştirme / çizin' ardından 'Düzenle' gidin. Sfero resmin üzerine tıklayın ve segmentasyon elde etmek için değnek imleci kullanın. Elle fareyi kullanarak sfero anahat ('Sihirli Değnek' penceresinde) 'İz' seçeneğini seçin.
  5. Bir e-tabloya farklı parametreler (alan, çap, çevre vs.) İhracat ölçümleri. Tablo üzerinde Tutanak ilgili görüntü bilgisi (örneğin, iyi sayı, nispi zaman noktası).
  6. Bilimsel grafik ve istatistiksel yazılımı kullanarak zamana karşı çoğaltmak sferoidler (işgali) ortalama alanını çiziniz. Seçenek olarak ise, t alanına göre her zaman noktasında küremsi bölgede değişim hesaplamak = 0 sonra olaylar istilası (% t0) doğrusal gra olarak zamana karşıph.

Representative Results

3B, tümör istilası küremsi şematik olarak Şekil 1 'de gösterilen basit ve tekrarlanabilir, otomatik bir yöntem kullanılarak tayin edilmiştir: tekrarlanabilir boyutlu tümör sferoidler ULA 96-gözenekli yuvarlak tabanlı plakalara hücreleri kaplama ile elde edilir. 4 gün sonrası inisiyasyon sferoidler BMM içine gömülürler. Bu tümör hücreleri istila eder ve sfero yayılmış içine bir yarı-katı bir yapı sağlar. Sitometresi görüntüleme kullanarak 96 saat - sferoidler BMM içine her bir taban ve istila merkezi bir konumda yer almaktadır kolay t = 0 72 için başlangıç ​​aralıklarda izlenmektedir. Bu tamamen otomatik bir görüntü analiz ortaya koyar.

Kanser hücresi yayılımını tamamen farklı tiplerinin örnekleri, Şekil 2 'de gösterilmiştir -. 4 yüksek malin insan glioblastoma multiforme (GBM) hücre çizgisi, U-87 mg, sıkı, küresel 3D yapısı oluşturur ve beyin tümörleri örnek için kullanılan yerel hangi işgali önemli bir yaşamı tehdit eden birözellik. Bir kez BMM gömülü, tipik bir "dolup taşan" istilası deseni 12 ile yayıldı U-87 MG sferoidler hücreleri. Tümör hücreleri, radyal olarak bir 3-boyutlu bir şekli muhafaza içinde matris içine uzanır. BMM içine uzanan hücresel süreçlerin ayrıntılarını ve invadopodia tümör hücresi istilasını ölçüde, açık bir şekilde belirgin olan, U-87 mg sferoidler için, Şekil 2'de gösterildiği gibi, işlem 72 saat arasında bir süre boyunca takip edilir. Tam zamanla tümör hücre istilası hassas kantitatif sağlar sitometresi bir görüntü ile görüntü analizi otomatik. otomatik analiz U 87 mg sferoid gövdeden BMM içine uzanan cep uzantıların etrafında segmentasyon üreten Şekil 1 'de gösterildiği gibi, Şekil 2' de miktar elde edilir. Bu hücre kuşağı için tümör küremsi bağışıklık tepki alanının ölçülmesi dışında olduğunu not edin.

Invas farklı bir deseniyon insan skuamöz baş ve boyun kanseri hücre hatları tarafından sergilendi. CAL S ve CAL R izojenik ama CAL S duyarlıdır ve EGFR tirozin kinaz inhibitörleri 14 dirençli CAL R. EGF yokluğunda, ne de hücre çizgisi BMM (Şekil 3) EGF konsantrasyonu artış gibi, ancak (2.5 ng / ml), sferoidler 'tomurcuk' görünür işgal. EGF (40 ve 80 ng / ml) istila derecesi daha yüksek konsantrasyonlarında indirgendi. Bu, daha önce 15 bildirilmiştir istilası açısından EGF'nin klasik, çan şekilli doz tepki ile tutarlıdır. 20 ng / ml EGF, CAL S hücreleri iken CAL R sferoitlerin ana gövdesinden ekstrüde parmak şeklinde çıkıntılar 72 saat (Şekil 3) sonra daha az invazif idi. Sferoidler hücre hatları arasında maksimum fark için 20 ng / ml EGF içeren BMM (konuldu sonra bu ayırıcı istilası 48 saat açıktı) Ve 72 saat sonra en yüksek (Şekil 4). Bu görüntüler U-87 MG gibi, sitometresinin bir görüntüleme kullanarak hızla elde edilmiştir. Bununla birlikte, bu durumda, alternatif bir yöntem örneklemek için, istila derecesi, tek başına görüntü analizi yazılımını kullanarak elle ölçüldü ve grafik olarak sunulmuştur (Şekiller 3 ve 4). Bu sonuçlar, spesifik ilaca dirençli, invaziv fenotip antagonize edecek bileşiklerin taranması için yararlanılabilir ilaç-duyarlı ve dirençli hücreler arasında, bir fenotipik fark gösterilmektedir.

Şekil 1,
3D tümör sfero işgali tahlil 1. şematik bir bakış Şekil. İş akışı sadece BMM içine gömme sonra yöntem U-87, MG glioblastoma sferoitlerin temsili görüntüler dahil olmak üzere içerir adımları gösterir (üst paneli t = 0) ve işgalden sonra BMM içine; ve işgalci hücreleri kapsadığı alan ölçen segmentasyon olmadan (alt panel t 72 saat =). Bar = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Ve BMM. U-87, U-MG içine 87 MG glioblastoma sfero işgali Şekil 2. Zaman kurs BMM içine 3D işgali izlenir ve sitometresi bir görüntüleme kullanarak 72 saat kadar ölçüldü sfero. (A) Temsilcisi görüntüleri ve (B) kantitatif Tümör hücre istilası gösterilmiştir. Bar = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

3 re "src =" / files / ftp_upload / 52686 / 52686fig3.jpg "/>
(Dirençli) Şekil 3. CAL R ve S CAL (duyarlı) tümör sfero işgali. (A) Temsilcisi görüntüleri ve (B) EGF doza bağımlı CAL R ve S CAL tümör sfero işgali manuel ölçümü gösterilmektedir. Bar = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
B yerleştirildiğinde Şekil 4. CAL R hücreler (dirençli) sferoidler CAL S (duyarlı) tümör sferoitlerin daha invazivEGF stimülasyon CAL R tümör sferoidler bir CAL S daha belirgin işgali. (A) Temsilcisi görüntüleri ve (B) işgali manuel miktarının göstermek üzerine MM. Gösterilmiştir. Bar = 500 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Discussion

Burada açıklanan iki tümör modelleri (glioblastoma ve SCCHN) özel klinik olarak etkili tedaviler 12 karşılanmamış bir ihtiyacı olan uygun lokal invaziv kanserler gibi bizim 3D tahlil örneklemek üzere seçildi. Ilaç tedavisi, in vitro farmakodinamik (PD) biyobelirteç değişikliklerin değerlendirilmesi BMM ve / veya bütün tümör parçacıklarının istila immünofloresan analizi hücre kurtarma izin vermek için belirli bir ticari olarak temin edilebilen reaktifler kullanımından sonra Western blot ya lizatların bağışıklık ile kolayca gerçekleştirilebilir aşağıdakı montaj boyama.

Bu işgal tahlil bir yararlı olan bir yarı katı ortam içine tümör hücresi istilasını hızlı ve yeniden üretilebilir bir değerlendirme için bir teknik ve in vitro ilaç tarama gelecek için, bu nedenle özellikle uygundur. Kanser hücreleri tümör sfero tarafından temsil edilen bir "mikro-tümör", dışarı yayıldı gibi bir 3D şekilde matris işgal ve bir extracellul içine uzatmakar matris gibi bir ortam. deneyinin gerçek üç boyutluluk, katı bir substrat üzerinde hareket ederken hücreler kabul düz, yapışkan morfolojisi farklı hücre morfolojisi, belirgindir. istila derecesi kolay ya da görüntüleme yazılımı ile kombinasyon halinde, standart bir mikroskop kullanılarak otomatik bir okumasını sağlayan sitometresi görüntüleme kullanılarak ölçülür. Ayrıca, bu yöntem, uygun bir flüoresan görüntüleme 13 (floresan proteinleri veya ifade eden hücre çizgileri, örneğin floresan boyalar ile birlikte, önceden etiketlenmiş).

küremsi arasında merkezi bir konuma rahatsız riski olduğu zaman bir yöntem BMM eklenmesiyle ile temsil edilen sadece kritik bir aşama ile gerçekleştirmek için basit bir de U-şeklindedir. Bu farklı odak düzlemlerinde sferoidlerle, optimal görüntü analizi ile sonuçlanabilir. O her oyuğa dikkatlice ve yavaşça BMM eklemek nedenle önemlidir. BMM ek sonra plaka kontrol edilmesi tavsiye ediliryerelleştirme kabul edilemez ise mikroskop altında ve bu nazik santrifüj çözülebilir. Tecrübesi ile, bu nadiren gereklidir. Bu yöntem dayanıklı ve yeniden üretilebilen iken arası deney varyasyonu BMM farklı gruplar ile oluşabilir. Bunu önlemek için, bu çalışma bir dizi tamamlamak için tek bir toplu yeterli BMM satın almak için tavsiye edilir.

Yöntemin bir sınırlama (herhangi bir tür deneylerde olduğu gibi), tümör hücrelerinin muhtemelen deney zaman dilimi içinde tabi yayılmasını ve çoğalmasını, ayırt edilmesinin güçlüğüdür. Hücrelerin iki katına çıkma süresi dikkate alındığında, ya da sitokalasin D gibi hücre döngüsü önleyicileri dahil edilebilir, ancak bu kontrol etmek ya da açık bir şekilde, özellikle hızlı büyüyen tümör hücreleri için ve bu tümör ilerlemesi, bu iki farklı açıdan birbirinden ayırt etmek kolay olmadığı bir daha "geniş" yerine infiltrasyon, işgal desen var. Bu nedenleBu paralel bir 3D büyüme deneyi herhangi bir inhibitör ya da uyarıcı maddelerin spesifik etkisini değerlendirmek için gerçekleştirilmektedir önerilmektedir. Dikkatli doz yanıt çalışmalar yapılmaktadır, bu çoğalması üzerindeki etkilerini en aza indirmek konsantrasyonları seçmek mümkün olabilir. Mesela HSP90 17-AAG% 50 (GI 50) 12 3D büyümesini inhibe etmek 24 saat sonra ve konsantrasyon altındaki konsantrasyonlarda önce, U-87 mg 3D tümör küremsi invazyonu inhibe inhibitörü olduğunu göstermiştir.

Öte yandan, bu deneyde önemi diğer standart invazyon tahlilleri (örneğin, filtre dayalı tahliller ya da 3 boyutlu matrislerle 1 içine tek hücrelerin istila) ile karşılaştırıldığında, tümör hücrelerinin benzer olduğunu, sfero çevreleyen matris içine işgal olduğunu " Bu nedenle mikro tümör "ya da bir" mikro-metastaz "ve tümör kitlesi patofizyolojisinde hesabı önemli yönlerini içine alır. Sunduğumuz yöntem hakkında bilgi verirBaşlangıçta sferoitleri bırakarak, hem de bireysel olarak, tek hücreler BMM daha uzak bölgelere ulaştığında tümör hücrelerinin, kolektif davranış. Ayrıca, tümör küremsi içinde hücreler hipoksi ve besin yoksunluğu yaşayabilirsiniz ki, gen ifadesi değişiklikler yoluyla, göç ve işgali teşvik edebilir; Bu tür özellikler 2D deneylerde yoktur. Ayrıca, tüm bu daha karmaşık bir 3D deney kolay hedef doğrulama ve ilaç keşfi kullanılmak üzere izin, belirli bir 96 oyuklu plakalar kullanılarak yüksek verimli bir format ve son görüntüleme tekniği mevcuttur.

Sunduğumuz yöntem tümör hücresi invazyonu ek yönlerini ele ileri uygulamalar barındırabilir. Özellikle, karmaşıklık sfero kendisi ve saran matris içine, fibroblastlar ve / veya endotel hücreleri gibi konakçı hücreler, ilavesiyle düşünülebilir. Bu aynı zamanda, sertlik bakımından (çeşitli ortak kullanımı ile değil, değiştirilebilirBMM ncentrations) değil, aynı zamanda bileşim açısından (kabul tümör modelinde özel doku / organ göre diğer bileşenlerin eklenmesiyle: Meme karsinomu 17) beyin kanserleri 16 ve kollajen örneğin, tenasin.

(Sferoitlerin ve görüntüleme) yol benzer bir düzenleme, aynı zamanda, tümör sferoidler ya da diğer hücre spesifik organoids (örneğin, astrositler ile kompleks doku 12 benzeyen embriyoid organları ile birlikte kültürlenir 3D, doku istilası değerlendirmek için adapte edilebilir glioma 18 veya kript gastrointestinal kanserler için kültürler), ancak daha fazla çalışma otomatik görüntü analizi etkinleştirmek için gereklidir.

Disclosures

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması rakip beyan ederim.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Corning Matrigel basement membrane matrix Corning 354234 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Cultrex basement membrane extract, PathClear Trevigen 3432-005-01 Keep at 4 °C to prevent solidification and dispense using cooled pipette tips
Ultra-low attachment 96-well plate Corning 7007
EGF Miltenyi Biotec 130-093-825 Add 100 μl 1% BSA (w/v) in water to 100 μg EGF. To 25 μl of this, add 4,975 μl RHB-A medium to give a 5 μg/ml working stock. Aliquot and store at -20 °C
RHB-A medium Stem Cells Inc. SCS-SF-NB-01 For diluting EGF
DMEM GIBCO 31966-021 Warm in 37 °C water bath before use
Fetal bovine serum Biosera 1001/500 Heat at 56 °C to inactivate complement before use
TrypLE GIBCO 12605 Cell dissociation solution
Celigo cytometer Nexcelom Bioscience n/a Specialist equipment for image capture and analysis. Manual image capture by microscopy and independent image analysis software is an alternative
IX70 inverted microscope Olympus n/a Used with camera for manual image capture
Retiga Exi Fast 1394 digital camera Qimaging n/a Attached to microscope for manual image capture
Image-Pro Plus 7.0 Media Cybernetics n/a Software used to control camera and microscope for manual image capture
Image-Pro Analyzer 7.0 Media Cybernetics n/a Stand-alone image analysis software for manual measurment of spheroid size
Excel 2010 Microsoft n/a Scientific graphing and statistical software
Prism 6.0 GraphPad n/a Scientific graphing and statistical software

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Astashkina, A., Mann, B., Grainger, D. W. A critical evaluation of in vitro cell culture models for high-throughput drug screening and toxicity. Pharmacology & therapeutics. 134, (1), 82-106 (2012).
  2. Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Two-Dimensional vs. Three-Dimensional In Vitro Tumor Migration and Invasion Assays. Methods and Protocols. 986, 227-252 (2013).
  3. Hwang, Y. S., Park, K. K., Chung, W. Y. Invadopodia formation in oral squamous cell carcinoma: the role of epidermal growth factor receptor signalling. Arch. Oral. Biol. 57, (4), 335-343 (2012).
  4. Wang, S., et al. Study on invadopodia formation for lung carcinoma invasion with a microfluidic 3D culture device. PLoS One. 8, (2), e56448 (2013).
  5. Friedl, P., Alexander, S. Cancer invasion and the microenvironment: plasticity and reciprocity. Cell. 147, (5), 992-1009 (2011).
  6. Brekhman, V., Neufeld, G. A novel asymmetric 3D in-vitro assay for the study of tumor cell invasion. BMC Cancer. 9, 415 (2009).
  7. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Semin. Cancer Biol. 15, (5), 378-386 (2005).
  8. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).
  9. Nystrom, M. L., et al. Development of a quantitative method to analyse tumour cell invasion in organotypic culture. The Journal of pathology. 205, (4), 468-475 (2005).
  10. Deisboeck, T. S., et al. Pattern of self-organization in tumour systems: complex growth dynamics in a novel brain tumour spheroid model. Cell Prolif. 34, (2), 115-134 (2001).
  11. Harma, V., et al. A comprehensive panel of three-dimensional models for studies of prostate cancer growth, invasion and drug responses. PLoS One. 5, (5), e10431 (2010).
  12. Vinci, M., et al. Advances in establishment and analysis of three-dimensional tumor spheroid-based functional assays for target validation and drug evaluation. BMC Biol. 10, 29 (2012).
  13. Vinci, M., Zimmermann, M., Box, C., Eccles, S. Tumor spheroid-based migration assays for evaluation of therapeutic agents. Methods and Protocols. 253-266 (2013).
  14. Box, C., et al. A novel serum protein signature associated with resistance to epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitors in head and neck squamous cell carcinoma. Eur. J. Cancer. 49, (11), 2512-2521 (2013).
  15. Khajah, M. A., Al Saleh, S., Mathew, S., M, P., Luqmani, Y. A. Differential effect of growth factors on invasion and proliferation of endocrine resistant breast cancer cells. PLoS One. 7, (7), e41847 (2012).
  16. Brosicke, N., van Landeghem, F. K., Scheffler, B., Faissner, A. Tenascin-C is expressed by human glioma in vivo and shows a strong association with tumor blood vessels. Cell and tissue research. 354, (2), 409-430 (2013).
  17. Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155, (7), 1639-1651 (2013).
  18. Molina, J. R., Hayashi, Y., Stephens, C., Georgescu, M. M. Invasive glioblastoma cells acquire stemness and increased Akt activation. Neoplasia. 12, (6), 453-463 (2010).
Üç boyutlu (3D) Tümör Sfero Yayılması deneyindeki
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).More

Vinci, M., Box, C., Eccles, S. A. Three-Dimensional (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay. J. Vis. Exp. (99), e52686, doi:10.3791/52686 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter