Denne protokol beskriver anvendelsen af højfrekvente ultralyd (HFUS) til billeddannelse mus cervikal lymfeknuder. Denne teknik optimerer visualisering og kvantificering af livmoderhalskræft lymfeknude morfologi, volumen og blodgennemstrømningen. Image-vejledt biopsi af cervikale lymfeknuder og forarbejdning af lymfeknuder væv til histologisk evaluering også vist.
Højfrekvent ultralyd (HFUS) er almindeligt anvendt som en ikke-invasiv metode til billeddannelse interne anatomiske strukturer i eksperimentelle små dyresystemer. HFUS har evnen til at detektere strukturer så små som 30 um, en egenskab, der er blevet anvendt til visualisering overfladiske lymfeknuder hos gnavere i lysstyrke (B) -tilstand. Kombinere power Doppler med B-mode scanning muliggør måling kredsløbssygdomme blodgennemstrømningen i lymfeknuder og andre organer. Mens HFUS er anvendt til lymfeknude-billeddannelse i en række muse modelsystemer, har en detaljeret protokol beskriver HFUS billeddannelse og karakterisering af de cervikale lymfeknuder i mus ikke blevet rapporteret. Her viser vi, at HFUS kan være indrettet til at detektere og karakterisere cervikale lymfeknuder i mus. Kombineret B-mode og magt dopplerbilledbehandling kan anvendes til at påvise stigninger i blodgennemstrømningen i immunologisk forstørrede livmoderhalsen noder. Vi beskriver også anvendelsen af B-mode imaging at foretage fine nål biopsier af cervikal lymfe ingendes at hente lymfevævet til histologisk analyse. Endelig software-aided trin beskrives til at beregne ændringer i lymfeknude volumen og til at visualisere ændringer i lymfeknude morfologi følgende billede genopbygning. Evnen til visuelt at overvåge ændringer i cervikal lymfeknude biologi over tid giver en enkel og effektiv teknik til ikke-invasiv overvågning af cervikale lymfeknude ændringer i prækliniske musemodeller for mundhulen sygdom.
Lymfedrænage af interstitiel vævsvæske er den vigtigste metode til udbredelse til smitsomme mikroorganismer og kræft opstår i mundtlig og maxillofacial region 1,2. Klinisk evaluering af cervikale lymfeknuder er en almindelig diagnostisk praksis anvendt til at bestemme tilstedeværelsen eller progression af sygdomme, der stammer i mundhulen. Dette understreger vigtigheden af de indsamler cervikale lymfeknuder som værdifulde anatomiske steder til oral sygdomsdiagnose 3. Flere specialiserede imaging metoder er klinisk anvendes til at identificere syge cervikale lymfeknuder. Disse omfatter positron emission tomografi (PET), computertomografi (CT) og magnetisk resonans (MR). Mens meget værdifuldt, disse metoder alle kræve omfattende patient forberedelse, højt specialiseret udstyr og / eller kemisk infusion i cirkulationen for at aktivere eller forbedre den billeddannende proces.
Sonografisk imaging (ultralyd, US) er en almindeligt anvendt teknik, der anvendes til at image cervikale lymfeknuder præsenterer sig med lymfadenopati skyldes infektion eller metastatisk involvering 4-6. USA er ofte kombineret med PET-CT og MR scanning for at give en samlet repræsentation af patientens lymfeknude status, hjælper til at bestemme tumor iscenesættelse og nødvendighed for kirurgisk excision 7. Den ikke-invasive karakter af USA har også iboende fordele i forhold til andre billeddannende modaliteter, herunder brugervenlighed, lave omkostninger, minimal ubehag for patienten og forberedelse. Den overfladiske subkutane placering fleste cervikale lymfeknuder tillader USA at lede minimalt invasive fine nål aspiration biopsier med øget præcision, forbedre diagnostiske nøjagtighed 8.
Kommerciel højfrekvente (HF) USA giver detaljeret opløsning af interne anatomiske strukturer til 30 um 9. Anvendelse af transducere spænder fra 22 til 70 MHz, er HFUS blevet let påføres til en række eksperimentelle gnavere for at muliggøre real-time imaging af indre organer in vivo.; HFUS er blevet tilpasset til visualisering af tumordannelse i konventionel lysstyrke (B) -tilstand, samt med en række generelle og specialiserede kontrastforbedring agents9. Brug af magt Doppler med HFUS giver mulighed for at overvåge blodgennemstrømningen i musetumorer, så en samlet vurdering af angiogen perfusion i levende mus 10,11. HFUS er blevet anvendt til at visualisere syge mus lymfeknuder i hovedlegemet hulrum, hvilket viser parallel anvendelighed af denne teknologi til klinisk praksis. Navnlig, inflammatoriske og metastatiske visceral lymfeknudeceller ændringer er blevet observeret i musemodeller for cancer, der huser bryst 12,13, pancreas 14, kolorektal 15 og lunge 16 tumorer, samt fibrøse histocytomas 17, og en gammel musemodel for erhvervet hydronefrose 18 . Disse eksempler størkne værdien af HFUS som et kraftfuldt efterforskningsredskab for tumorinduceret lymfadenopati i en bred vifte af rodent systemer.
Adskillige modeller af bakteriel infektion 19,20 og hoved og hals pladecellecarcinom (HNSCC) 21,22 er blevet udviklet til at studere disse sygdomme i den prækliniske indstilling. I modsætning til mennesker, mus indeholder tre cervikale lymfeknuder, der undersøgelse lymfeknuder fra mundhulen væv (mandibular, submandibulære mandibular og overfladisk parotideale 23). Vi har for nylig rapporteret anvendelsen af HFUS at kortlægge placeringen og morfologien af disse lymfeknuder, overvåge ændringer i lymfeknude volumen og blodgennemstrømningen i et carcinogen-induceret musemodel for HNSCC 24. Her giver vi en detaljeret protokol for brug af HFUS til at identificere, billedbehandling og analyse cervikale lymfeknuder i levende mus. Denne protokol viser også muligheden for at benytte HFUS at gennemføre image- vejledt fin nål biopsi af forstørret mus cervikale lymfeknuder, så histologiske overvågning af ændringer i livmoderhalsen lymfeknude indhold og patologier end time i det samme dyr. Denne protokol kan let tilpasses til at muliggøre detaljeret undersøgelse af cervikale lymfeknude patologier resulterende fra enhver invasiv mundhulen sygdom i mus.
Den beskrevne protokol muliggør visualisering og in situ evaluering af murine cervikale lymfeknuder anvender ikke-invasiv HFUS billeddannelse. Brugen af B-mode og magt dopplerbilledbehandling at visualisere livmoderhalskræft lymfeknude morfologi, volumen og lymfeknude blodgennemstrømning giver en eksperimentel analyse af prækliniske mus modelsystemer svarende til den, der anvendes til karakterisering af cervikale patient knuder i klinisk praksis. Evnen til at overvåge cervial lymfeknuder via fin nål biopsi giver også en nyttig teknik til påvisning immuncellepopulationer ændringer og tilstedeværelsen af udenlandske celletyper eller bakterier under oral cavity sygdomsfrie inducerede lymphadenopathies i mus. Den brugervenlighed og lave omkostninger forbundet med HFUS muliggør hurtig screening af cervikale lymfeknude-status i en lang række dyremodeller.
Et afgørende skridt i denne protokol er den første vellykkede identifikation af de cervikale lymfeknuder i HFUS billeder. Vores anlæg har et sortiment af HFUS transducers som beskrevet, så vi har brugt dem til at opnå billederne højeste kvalitet. Men hvis transducerne vi beskriver ikke er tilgængelige, er det muligt at tilpasse billeddannelse ved hjælp af andre transducere. Til dette formål, justere billedet dybde og bredde til at opnå en tilstrækkelig billede er alt hvad der kræves. Resolution af sådanne billeder kan variere, men det bør stadig være muligt at opnå billeder af høj kvalitet ved at bruge HFUS. Vartegn i mundhulen og skjoldbruskkirtlen Imaging vil i høj grad hjælpe med at orientere brugeren til den rigtige region, hvor lymfeknuder er lokaliseret. Den karakteristiske ovalformede hypoekkoisk natur og overfladisk placering tæt på hudens overflade tillader hurtig bekræftende identifikation af de cervikale lymfeknuder i den korrekte halsregionen. Mens alle tre knuder kan være synlige i et enkelt billedplanet (figur 3B), er typisk en eller to knudepunkter fanget under billedbehandling. Kan udføres mindre justeringer af transducerposition at sønderriveER anderledes billeddannelse planes synlig, hvilket tillader visualisering af alle knuder på en enkelt side af halsen.
Mens vi har fundet den beskrevne teknik pålideligt til at identificere cervikale lymfeknuder, der er særlige begrænsninger for billedbehandling og biopsi teknik. Den overfladiske muse cervikal lymfeknuder giver overdreven mobilitet når selv svagt tryk påføres på huden via transduceren hovedet. Dette kan modvirkes ved langsomt at anvende transduceren hovedet ind i ultralyd gel på musen halsen indtil skelsættende billederne er identificeret. Lymfeknude mobilitet kan også komplicere fin nål biopsi, især når du bruger transducere i højere opløsning (50 MHz) rækkevidde. Centreret billeder af lymfeknuder til biopsi er typisk skubbet ud af synsfeltet som følge af den kraft, biopsinålen nødvendig for at punktere den overliggende hud og kapsel. Dette kan afhjælpes ved off-center positionering af lymfeknude i den retning af nålen indrejse,er plads til at lymfeknude at blive skubbet på tværs, men stadig forbliver inden for synsfeltet under biopsi. Det er vores erfaring, lymfeknuder> 10 mm 3 er meget vanskelige at biopsi, og er ofte skubbet af nålen frem gennemtrænges under nålen fremføring. Således er biopsi bedst forbeholdt forstørrede lymfeknuder hvor størrelsen er> 10 mm 3 for at sikre tilstrækkelig node target størrelse og stabilitet inden for den cervikale region. Desuden kan biopsi materiale ikke indeholder tilstrækkelige celleantal til procedurer, hvor større celleantal er nødvendige (fx flowcytometri).
HFUS har været anvendt med succes visualisere ortotopisk HNSCC tumorer 25, og har potentiale til at overvåge cervikal node metastase i mus med orale tumorer 24. Foruden ultralyd, har bioluminescens imaging også blevet anvendt til at visualisere orthotopisk oral tumordannelse og cervikal lymfeknudemetastase med levende mus 26,27. Som en alterntiv tilgang, bioluminescens imaging har en klar fordel i forhold HFUS i at kunne direkte kvantificere tumorprogression og metastatisk byrde over tid i det samme dyr. Mens uvæsentlige, bioluminescens billeddannelse er ikke i stand til at måle mange af de parametre, visualiseret ved HFUS, herunder lymfeknude morfologi, nodal volumener eller blodgennemstrømning. Bioluminescens imaging kræver også specialiserede mørke kasser til at opretholde mus under billedbehandling, hvilket gør denne teknik uegnet for tilpasning til fin nål biopsi.
Endvidere bioluminescens billeddannelse kræver produktionen af tumorceller, der stabilt udtrykker luciferaseenzymet, giver denne teknik kun anvendes i tilfælde af ortotopisk xenotransplantater med luciferase-transficerede tumorceller hos immunkompromitterede mus, eller med inducerbare vævsspecifikke transgene systemer, der begrænser luciferaseekspression i en spatio-temporal måde specifik for vævet af tumoroprindelse. I modsætning hertil kan HFUS være used sammenholdt med bioluminescens billeder i disse modeller, samt være i stand til at afbilde cervikale lymfeknuder i modeller for kræftfremkaldende-induceret orale tumorer i mus med komplette immunforsvar 28,29. Mens HFUS kan være mere tilpasses de fleste musemodeller af kræft i mundhulen, den kombinerede oplysninger, der kan fås fra bioluminescens og HFUS billeddannelse i systemer, hvor tumorceller udtrykker luciferase kan give et mere fuldstændigt billede af livmoderhalskræft lymfeknude involvering end både imaging modalitet alene.
Evnen til at identificere og påvise muse cervikale lymfeknuder i realtid giver mulighed for denne teknik, der skal anvendes i de fleste modeller af oral sygdom, der resulterer i inflammatorisk lymfadenopati, hvor dyret kan holdes i en omvendt stilling under kortvarig anæstesi. Påvisning af lymfeknudemetastase eller bakteriel infektion og den samtidige virkning på lymfeknude morfologi i levende dyr viser en signifikant fordel i forhold til traditionelle metoderder kræver lymfeknuder fjernes fra døde dyr til histologisk bearbejdning. Kombinere HFUS med fin nål biopsi giver et organ til udførelse af rutinemæssig patologisk analyse af cervikale lymfeknuder, svarende til hvad der foregår i klinikken, tilvejebringe en forbedret fremgangsmåde til overvågning af sygdommens progression i de fleste nuværende musemodeller for mundhulen sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Dorothy D. Radford Endowment fond fra West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Brugen af West Virginia University dyremodeller og Imaging Facility (AMIF) og mikroskopi Imaging Facility (MIF) (støttet af Mary Babb Randolph Cancer Center og NIH tilskud P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 og S10 RR026378) er taknemmeligt anerkendt.
Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
Depilatory Cream | Carter Products | ||
Cotton swabs | General Supply | ||
Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
Water | General Supply | ||
Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
27G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |