Detta protokoll beskriver tillämpningen av högfrekvent ultraljud (HFUS) för avbildning mus livmoderhalscancer lymfkörtlar. Denna teknik optimerar visualisering och kvantifiering av cervikal lymfkörtel morfologi, volym och blodflöde. Bildstyrd biopsi av livmoderhalscancer lymfkörtlar och bearbetning av lymfa vävnad för histologisk utvärdering också visat.
Högfrekvent ultraljud (HFUS) är allmänt används som en icke-invasiv metod för att avbilda interna anatomiska strukturer i experimentella små djursystem. HFUS har förmågan att upptäcka strukturer så små som 30 pm, en egenskap som har använts för att visualisera ytliga lymfkörtlar hos gnagare i ljusstyrka (B) -läge. Kombinera power Doppler med B-mode scanning möjliggör mätning av cirkulations blodflöde i lymfkörtlar och andra organ. Medan HFUS har använts för lymfkörtel avbildning i ett antal mus modellsystem har ett detaljerat protokoll som beskriver HFUS avbildning och karakterisering av livmoderhalscancer lymfkörtlar hos möss inte rapporterats. Här visar vi att HFUS kan anpassas för att detektera och karakterisera cervikala lymfkörtlar i möss. Kombinerad B-mode och makt Doppler avbildning kan användas för att detektera ökningar av blodflödet i immunologiskt förstorade livmoderhalscancer noder. Vi beskriver också användningen av B-mode scanning att genomföra fina nålbiopsier av livmoderhalscancer lymfa intedes att hämta lymfan vävnad för histologisk analys. Slutligen mjukvarustödd steg beskrivs för att beräkna förändringar i lymfkörteln volym och för att synliggöra förändringar i lymfkörtel morfologi följande bildrekonstruktion. Möjligheten att visuellt övervaka förändringar i livmoderhalscancer lymfkörtel biologi över tiden ger en enkel och kraftfull teknik för icke-invasiv övervakning av cervical lymfkörtel förändringar i prekliniska musmodeller av munhålan sjukdom.
Lymfdränage av interstitiell vävnadsvätska är den huvudsakliga metoden för spridning av infektions mikroorganismer och cancer uppstår i oral och maxillofacial regionen 1,2. Klinisk utvärdering av livmoderhalscancer lymfkörtlar är en vanlig diagnostisk metod som används för att bestämma närvaron eller utvecklingen av sjukdomar som har sitt ursprung i munhålan. Detta understryker vikten av att samla livmoderhalscancer lymfkörtlar som värdefulla anatomiska platser för diagnos oral sjukdom 3. Flera specialiserade avbildningsmetoder är kliniskt används för att identifiera sjuka livmoderhalscancer lymfkörtlar. Dessa inkluderar positronemissionstomografi (PET), datortomografi (CT) och magnetisk resonanstomografi (MR). Medan mycket värdefullt, dessa metoder alla kräver omfattande patientförberedelse, högspecialiserad utrustning och / eller kemisk infusion i cirkulationen för att möjliggöra eller förbättra bildprocessen.
Sonografisk imaging (ultraljud, USA) är en allmänt vedertagen teknik som används för att imålders livmoderhalscancer lymfkörtlar som uppvisar lymfadenopati på grund av infektion eller metastaserande engagemang 4-6. USA kombineras ofta med PET-CT och MR-avbildning att ge en heltäckande representation av patientens lymfkörtel status, hjälpa till att bestämma tumörstadieindelning och behovet av kirurgisk excision 7. Den icke-invasiv metod har också inneboende fördelar över andra avbildningsmodaliteter, inklusive lätthet att använda, låg kostnad, minimal obehag för patienten och beredning. Den ytliga subkutana placeringen av de flesta cervikala lymfkörtlar möjliggör för USA att styra minimalt invasiva finnålsaspiration biopsier med ökad precision, förbättra diagnostiska noggrannheten 8.
Kommersiell högfrekvent (HF) USA ger detaljerad upplösning av interna anatomiska strukturer till 30 pm 9. Använda transduktorer som spänner från 22 till 70 MHz, har HFUS varit lätt tillämpas på en mängd olika experimentella gnagare system så att i realtid avbildning av inre organ in vivo.; HFUS har anpassats för visualisering av tumörbildning i konventionell ljusstyrka (B) -läge, samt med ett antal allmänna och specialiserade kontrastförstärkning agents9. Använda energidoppler med HFUS ger möjlighet att övervaka blodflödet i mustumörer, vilket gör en helhetsbedömning av angiogen perfusion i levande möss 10,11. HFUS har använts för att visualisera sjuka mus lymfkörtlar i huvudkroppshålan, visar samtidigt nytta av denna teknik för klinisk praxis. I synnerhet inflammatoriska och metastatiska visceral lymfkörtel förändringar har observerats i musmodeller av cancer som härbärgerar bröst 12,13, pankreatiska 14, kolorektal 15 och lunga 16 tumörer, liksom fibrösa histocytomas 17, och en åldrig musmodell av förvärvad hydronefros 18 . Dessa exempel stelna värdet av HFUS som ett kraftfullt undersökande verktyg för tumörinducerad lymfadenopati i en bred variation av robuckla system.
Flera modeller av bakteriell infektion 19,20 och huvud och hals skivepitelcancer (HNSCC) 21,22 har utvecklats för att studera dessa sjukdomar i preklinisk miljö. I motsats till människor, möss innehåller tre livmoderhalscancer lymfkörtlar som kart lymfa från munhålan vävnader (underkäken, submandibulär underkäken och ytliga parotis 23). Nyligen rapporterade vi användning av HFUS att kartlägga läget och morfologi av dessa lymfkörtlar, övervakning av förändringar i lymfkörtel volymen och blodflödet i ett cancerframkallande-inducerad musmodell av HNSCC 24. Här ger vi ett detaljerat protokoll för användning av HFUS för att identifiera, bildbehandling och analys av livmoderhalscancer lymfkörtlar i levande möss. Detta protokoll visar också möjligheten att använda HFUS att genomföra image- guidad fin nål biopsi av förstorad mus livmoderhalscancer lymfkörtlar, vilket gör histologiska övervakning av förändringar i livmoderhalscancer lymfkörtel innehåll och sjukdomar över time i samma djur. Detta protokoll kan lätt anpassas för att möjliggöra detaljerad studie av cervical lymfkörtel patologier resulterande från någon invasiv munhålan sjukdom i möss.
Den beskrivna protokollet möjliggör visualisering och in situ utvärdering av murina livmoderhalscancer lymfkörtlar med hjälp av icke-invasiv HFUS avbildning. Användningen av B-mode och makt Doppler imaging att visualisera livmoderhalscancer lymfkörtel morfologi, ger volym och lymfkörtel blodflöde för en experimentell analys av prekliniska mus modellsystem som liknar det som användes för karakterisering av livmoderhalscancer patienter noder i klinisk praxis. Förmågan att övervaka cervial lymfkörtlar via Finnålspunktion ger också en användbar teknik för att detektera immunceller förändringar och närvaron av utländska celltyper eller bakterier under munhålan sjukdoms inducerade lymphadenopathies hos möss. Den enkel användning och låg kostnad i samband med HFUS möjliggör snabb screening av cervikala lymfkörtlar status i en mängd olika djurmodeller.
Ett kritiskt steg i detta protokoll är den första framgång i att identifiera de cervikala lymfkörtlar i HFUS bilder. Vår anläggning har ett sortiment av HFUS transducers som beskrivits, så vi har använt dem för att få bilder med högsta kvalitet. Men om omvandlarna vi beskriver inte är tillgängliga, är det möjligt att anpassa den avbildning med andra givare. För detta ändamål, justering av bildens djup och bredd för att erhålla en adekvat bild är allt som erfordras. Upplösning av sådana bilder kan variera, men det bör ändå vara möjligt att få högkvalitativa bilder med hjälp av HFUS. Landmärken Imaging i munhålan och sköldkörteln kommer att kraftigt underlätta orientering användaren till rätt region där lymfkörtlarna är lokaliserade. Den karakteristiska ovala, hypoechoic natur och ytliga läge nära hudytan möjliggör snabb bekräftande identifiering av livmoderhalscancer lymfkörtlar i rätt halsregionen. Även om alla tre noder kan vara synliga i ett enda avbildningsplanet (figur 3B), är typiskt en eller två noder fångas under avbildning. Smärre justeringar av givarens position kan utföras för att rämnaER annorlunda avbildning hyvlar synlig, vilket möjliggör visualisering av alla noder på en enda sida av halsen.
Medan vi har hittat den beskrivna tekniken tillförlitlig för att identifiera cervikala lymfkörtlar, det finns särskilda begränsningar för bildbehandling och biopsi teknik. Den ytliga naturen hos mus livmoderhalscancer lymfkörtlar ger överdriven rörlighet när även svagt tryck appliceras på huden via givarhuvudet. Detta kan motverkas genom att långsamt applicera givarhuvudet in i ultraljud gel på musen halsen tills landmärket bilderna identifieras. Lymfkörtel rörlighet kan också komplicera fin nål biopsi, speciellt när man använder givare i högre upplösning (50 MHz) området. Centrerade bilder av lymfkörtlar för biopsi typiskt tryckas ut ur synfältet på grund av kraften från biopsinål som behövs för att punktera den överliggande huden och kapsel. Detta kan avhjälpas genom att den excentriskt positionering av lymfkörteln i den riktning av nålens inträde,ge utrymme för lymfkörteln att skjutas över men fortfarande förbli inom synfältet under biopsi. Enligt vår erfarenhet, lymfkörtlar> 10 mm 3 är mycket svåra att biopsi, och är ofta trycks av nålen snarare än penetreras under nål avancemang. Således är biopsi bäst reserveras för förstorade lymfkörtlar där storleken är> 10 mm 3 för att säkerställa tillräcklig nod mål storlek och stabilitet inom halsregionen. Dessutom kan biopsimaterialet inte innehåller tillräckligt cellantal för förfaranden där det krävs större cellantal (t.ex. flödescytometri).
HFUS har använts för att framgångsrikt visualisera orthotopic HNSCC tumörer 25, och har potential att övervaka cervical nod metastaser i möss med orala tumörer 24. Förutom ultraljud, har bioluminescens avbildning också använts för att visualisera orthotopic orala tumörbildning och livmoderhalscancer lymfkörtel metastas i levande möss 26,27. Som en Alterntivt tillvägagångssätt har mareld imaging en klar fördel jämfört med HFUS i att kunna direkt kvantifiera tumörprogression och metastaserande börda över tiden i samma djur. Medan onekligen bra, är mareld avbildning inte att mäta många av de parametrar som visualiseras genom HFUS, inklusive lymfkörtel morfologi, nodala volymer eller blodflödet. Bioluminescence avbildning kräver också specialiserade mörka rutor för att upprätthålla möss under avbildning, vilket gör denna teknik olämplig för anpassning för fin nål biopsi.
Dessutom kräver produktionen av tumörceller som stabilt uttrycker luciferasenzymet, vilket gör att denna teknik kan användas endast i fall av orthotopic xenografter med luciferas-transfekterade tumörceller i nedsatt immunförsvar möss, eller med inducerbara vävnadsspecifika transgena system som begränsar luciferasuttryck mareld avbildning i en spatiotemporala sätt specifikt för vävnaden av tumörursprung. I motsats härtill kan HFUS vara used i samband med mareld bilder i dessa modeller, samt vara i stånd att avbilda cervikala lymfkörtlar i modeller för cancerframkallande-inducerad orala tumörer hos möss med kompletta immunsystem 28,29. Medan HFUS kan vara mer anpassningsbar till de flesta musmodeller för cancer i munhålan, den kombinerade information som kan erhållas från mareld och HFUS avbildning i system där tumörceller uttrycker luciferas kan ge en mer fullständig bild av livmoderhalscancer lymfknutor än antingen avbildningsmodalitet ensam.
Förmågan att identifiera och upptäcka mus livmoderhalscancer lymfkörtlar i realtid möjliggör denna teknik för att användas i de flesta modeller av oral sjukdom som leder till inflammatorisk lymfadenopati där djuret kan hållas i en inverterad position under kortsiktiga anestesi. Upptäckt av lymfkörtel metastaser eller bakteriell infektion och samtidig påverkan på lymfkörtel morfologi i levande djur utgör en betydande fördel jämfört med traditionella metodersom kräver lymfkörtlar tas bort från döda djur för histologisk bearbetning. Kombinera HFUS med fin nål biopsi kan ett medel för att utföra rutin patologisk analys av cervical lymfkörtlar, som liknar det som bedrivs på kliniken, vilket ger en förbättrad metod för att övervaka sjukdomsprogression i de flesta nuvarande musmodeller av munhålan sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Dorothy D. Radford Endowment fonden från West Virginia University Mary Babb Randolph Cancer Center. Användningen av West Virginia University djurmodeller och Imaging Facility (AMIF) och mikroskopi Imaging Facility (MIF) (stöds av Mary Babb Randolph Cancer Center och NIH bidrag P20 RR16440, P30 RR032138 / GM103488 och S10 RR026378) är tacksamma.
Vevo2100 High Resolution Micro-ultrasound Imaging System, with integrated software Version 1.6.0 | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11945 | |
Power Dopper Mode and 3D Mode | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11952; VS-11484 | |
Vevo compact anesthesia system | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | ||
Vevo integrated rail system including 3D motor and micromanipulator for injections | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | SA-11983 | |
Thermasonic Gel Warmer | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | Optional | |
Transducers – MS-550D (Broadband frequency: 22 MHz – 55 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-11960 | Referred to as 40 MHz Transducer |
Transducers – MS-700 (Broadband frequency: 30 MHz – 70 MHz) | VisualSonics, Toronto, Ontario, Canada | VS-12026 | Referred to as 50 MHz Transducer |
Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 07-888-1663 | |
Electrode gel | Parker Laboratories | 174-1525 | |
Tape | Medical Arts Press | 174-153000 | |
Depilatory Cream | Carter Products | ||
Cotton swabs | General Supply | ||
Gauze | Fisher Scientific | 22-037-907 | |
Water | General Supply | ||
Lubricating gel | Parker Laboratories | 57-05 | |
Ultrasound gel | Parker Laboratories | 01-50 | |
Microcentrifuge tube rack | General Supply | Used to raise mouse platform for optimal biopsy position | |
27G ½ inch needle with 1 ml syringe | Fisher Scientific | 14-826-87 | |
ThinPrep PreservCyt Solution | Hologic | 70097-002 | Refered to as biopsy media |
Microcentrifuge tubes | General Supply | ||
Thinprep 2000 processor | Cytyc, Marlborough, MA | Blue Filter | |
Olympus AX70 Provis Microscope | Olympus, Center Valley, PA |