Este protocolo descreve o isolamento de células de satélite a partir de músculos da cabeça branquiométrico de um rato 9 semanas de idade. Os músculos são originários de diferentes arco branquial. Subsequentemente, as células satélites são cultivadas em um revestimento local de tamanho milímetros para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a expansão e passagem em células de satélite.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
Cerca de 1: 500 a 1: 1.000 recém-nascidos apresentam uma fissura envolvendo o lábio e / ou palato (CLP); assim, esta é a malformação congênita mais comum em humanos uma. Os músculos do palato mole são essenciais para o funcionamento do palato mole durante a fala, deglutição e sucção. Se uma fenda do palato mole está presente, estes músculos são anormalmente inserido na extremidade posterior do osso palatino.
O palato mole move para cima e para baixo durante a fala, impedindo que o ar escape através do nariz. Crianças com uma fenda no palato não têm essa função de controle, resultando em um fenômeno conhecido como disfunção velofaríngea 2,3. Embora os protocolos de tratamento são variáveis, a reparação cirúrgica do palato mole tem lugar na primeira infância (6-36 meses de idade) 4. Os músculos anormalmente inseridos do palato mole pode ser corrigido cirurgicamente 5-7, no entanto, disfunção velopharyngeal persistir em 7% a 30%dos pacientes 2,3,8-10.
A capacidade do músculo esquelético para regenerar-se através da acção de células satélites (SCS) está bem estabelecida 11,12. Após a lesão muscular, SCs são activados e migram para o local da lesão. Eles então proliferar, diferenciar, e se fundem para formar novas fibras musculares ou reparar danificado os 13. Quiescentes SCs expressam o fator de transcrição Pax7 14,15, enquanto a sua progênie, os mioblastos proliferação, adicionalmente expressar o fator de determinação miogênica 1 (MyoD) 16. Mioblastos diferenciadores começam a expressar miogenina (MyoG) 17. A diferenciação terminal de mioblastos é marcada pela formação de miofibras, e a expressão de proteínas específicas de músculo, tais como cadeia pesada de miosina (MyHC) 16,18.
Recentemente, várias estratégias têm sido utilizadas em medicina regenerativa para melhorar a regeneração do músculo dos músculos do membro 19-23. Estudos específicos sobremúsculos da cabeça branquiométrico também são importantes, pois foi demonstrado recentemente que eles diferem de outros músculos em vários aspectos 24. Em contraste com os músculos dos membros, tem sido sugerido que os músculos da cabeça branquiométrico contêm menos SCs 25, regenerar mais lento, e tecido conjuntivo mais fibrosa é formada após a lesão 26 Além disso, a proliferação de músculos SCs cabeça branquiométrico também expressar outros factores de transcrição. Por exemplo, Tcf21, um fator de transcrição para a formação muscular craniofacial é fortemente expresso na regeneração de músculos da cabeça, mas dificilmente na regeneração de músculos dos membros 25. Os músculos do palato mole de pacientes CLP são geralmente menores e menos bem organizada em comparação com músculos palatinos normais 27,28. Fibras lentas e rápidas estão presentes nos músculos do palato mole, mas as fibras lentas são mais abundantes. Em contraste, os músculos fissura contêm uma maior proporção de fibras rápidas e também uma fonte capilar reduzidaem comparação com os músculos do palato mole normais 29-31. Fibras rápidas são mais propensas a contração induzida por lesão 31-33. O pobre suprimento capilar de acompanhamento também pode promover a fibrose 34,35. Todos estes aspectos podem contribuir para o mau regeneração dos músculos moles do palato após o fecho cirúrgico fenda 36. Em vista disso, um protocolo para o isolamento e caracterização de músculo cabeça branquiométrico SCs é crucial. Isto proporciona a possibilidade de estudar a biologia dos músculos SC cabeça branquiométrico. Além disso, novas terapias com base em engenharia de tecidos podem ser desenvolvidos para promover a regeneração muscular após a cirurgia em CRE e outras condições comprometedoras da área craniofacial.
Em geral, SCs pode ser obtido após dissociação do tecido muscular 14. Picar, digestão enzimática e trituração geralmente são obrigados a liberar SCs de seu nicho. SCs pode ser purificado por meio de pré-plaqueamento em placas não revestidas 14,37,38, fractionation em Percoll 39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética 41-43. Aqui nós apresentamos um novo protocolo econômico e rápido para o isolamento de células satélites de músculos da cabeça branquiométrico de ratos adultos jovens. Este protocolo baseia-se num manuscrito anterior 14 e especificamente adaptado para pequenas amostras de tecido. O isolamento de SCs de músculos representativos provenientes do 1 º, 2 º e 4 º arcos branquiais são descritos. Após o isolamento, baixo número de células satélites são cultivadas em gel matriz extracelular manchas de tamanho milímetro para estudar a sua diferenciação. Esta abordagem evita a necessidade para a expansão e passaging de SCs.
SCs de diferentes músculos da cabeça branquiométrico foram isolados a partir de um de 9 semanas de idade de ratos Wistar e cultivadas directamente em manchas de gel de matriz extracelular sem a expansão e passagem em antes. Após o isolamento, as células foram contadas e semeadas à mesma densidade celular. Para o isolamento paralela de três músculos diferentes, este método leva cerca de 4 horas. Para evitar a contaminação da cultura, um passo crítico é a rápida lavagem em álcool a 70% após a dissecação dos músculos.
Durante SC isolamento é importante para cortar o tecido muscular em pequenos pedaços (cerca de 2 mm), mas evitar o excesso de picagem pois isso irá resultar num rendimento de célula pequena por causa de danos celulares. Além disso, a duração da digestão enzimática deve ser verificado cuidadosamente sob o microscópio para evitar mais danos. O objectivo da digestão é de dissociar as miofibras. Uma vez que mais de 90% das células isoladas expressam Pax7, não é necessária mais purificação (Figuras 6-8).Isto evita passos de purificação adicionais em outros métodos, tais como pré-plaqueamento em placas não revestidas 14,37,38, fraccionamento em Percoll 39,40, célula ou fluorescent- ou triagem magnética 41,43. Por trituração é essencial induzir cisalhamento entre os fragmentos de tecido e a abertura da ponta da pipeta como este permite que a libertação mecânica do SC. Se a trituração com uma pipeta 10 ml (dentro de ponta diâmetro: 1 mm), é difícil, de 5 ml (dentro ponta diâmetro: 2 mm) pipeta pode ser utilizada pela primeira vez. Alternativamente, pipetas de Pasteur de vidro pode ser cortado no diâmetro desejado e ser utilizado. Este método é simples, eficiente e permite o isolamento em simultâneo de SC a partir de diferentes amostras do músculo.
As placas de cultura para SCS também pode ser revestida com gelatina ou colagénio, mas os nossos estudos anteriores mostram que o gel de matriz extracelular é muito melhor para a manutenção do potencial miogénica de colagénio 38. As manchas extracelulares da matriz de geltamanho milímetros (10 ul / S de 2 mm ou 20 ul de E / S 4 mm) permite o estudo da proliferação e diferenciação de SCS com um número limitado de células. Para o ensaio de diferenciação de cerca de 8 a 20 vezes menos células são necessários em comparação com uma placa de 24 poços (Ø 15,6 milímetros), e cerca de 80 a 200 vezes menos comparado até 35 mm pratos Petri (Ø 35 mm) 14,38.
Desde gel de matriz extracelular é caro, este método também é mais eficiente em termos de custos. Além disso, as lâminas de câmara pode ser substituído por cobertura de plástico desliza para reduzir ainda mais os custos. Para a preparação do gel matriz extracelular acaba de secagem durante a noite das lâminas de câmaras é essencial. À medida que as manchas de gel de matriz extracelulares são transparentes, é necessário marcar os pontos no lado inferior utilizando iluminação traseira. As câmaras de slides são fixados em uma placa de Petri para a manipulação fácil. A expansão adicional de cultura de células não é necessário, o que oferece a possibilidade de estudar o SCs de smalLER músculos ou amostras musculares pequenos. Alternativamente, por exemplo, para PCR ou músculo constrói se são necessários mais células, as SCs de isolados de fresco pode ser primeiro expandida em frascos T75, tal como indicado acima.
SCs isolado utilizando este protocolo, não são adequados para a purificação adicional com a citometria de fluxo imediatamente após o isolamento. A digestão com pronase provoca extensa digestão de antigénios da superfície 14. De soro de cavalo e soro fetal bovino que são utilizados para a cultura de células tem de primeiro ser adequadamente caracterizados, antes do isolamento, como diferentes números de lote diferencialmente afectada mioblastos proliferação e diferenciação.
Nos últimos anos, há um crescente interesse nos músculos derivados dos arcos branquiais e da mesoderme da cabeça (por exemplo, os músculos extra-oculares) 24. Tem sido claramente demonstrado que músculos da cabeça e dos membros possuem propriedades altamente diferentes. Músculo masséter de animais velhos parece retain sua capacidade regenerativa, em comparação com os músculos dos membros 25,26. SCs dos músculos extra-oculares possuem uma robusta capacidade de proliferação e diferenciação comparável ao SCs de músculos da cabeça, e mostrar um potencial maior do que o enxerto muscular de membros SCs 24.
A composição de distribuição do tipo de fibra e miosina varia entre os grupos musculares e também entre as espécies. Músculos originários a partir do primeiro arco branquial em humanos contêm fibras tanto lentas e rápidas (IIA e IIX subtipos), myosins neonatais e myosins típicos para o desenvolvimento de músculo cardíaco. Em roedores estes músculos contêm cerca de 95% IIA fibras rápidas miosina e IIb) 44-46. Estudos sobre os músculos aviário mostram que a SCS a partir de diferentes tipos de fibras musculares variar em capacidade de diferenciação. SCs de fibras rápidas única diferenciar em fibras musculares rápidas, enquanto SCs de fibras lentas podem se diferenciar em ambos os tipos de fibras 47. Além disso, a percentagem de CT no músculo rápidofibras é menor do que na fibras musculares lentas 48,49. Isto indica que a distribuição do tipo de fibra deve ser tida em conta para os estudos sobre os músculos na área craniofacial. Similar aos músculos fenda palatina, o LVP em roedores contém quase exclusivamente fibras rápidas 50. Por essa razão, SCs da LVP são adequados para estudos pré-clínicos no campo da fenda palatina.
Este protocolo oferece novas possibilidades para estudar SCs derivadas de músculos da cabeça branquiométrico ou outros músculos menores ou amostras de músculos menores. Isto irá facilitar o desenvolvimento de novas terapias para melhorar a regeneração dos músculos da região maxilofacial em condições tais como fenda palatina mas também em outras condições que afectam os músculos menores.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |