Denne protokol beskriver isoleringen af satellit celler fra branchiomeric hoved muskler en 9 uger gammel rotte. Musklerne stammer fra forskellige Branchialfodder buer. Efterfølgende satellit-celler dyrkes på en plet belægning af millimeter størrelse at studere deres differentiering. Denne fremgangsmåde undgår udvidelse og passage af satellit celler.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
Ca. 1: 500 til 1: 1.000 nyfødte udviser en spalte involverer læbe og / eller ganen (CLP); således dette er den mest almindelige medfødte misdannelser hos mennesker 1. Musklerne i den bløde gane er kritiske for driften af den bløde gane under tale, synke og sutte. Hvis en kløft af den bløde gane er til stede, er disse muskler unormalt indsat i den bageste ende af palatinale knogle.
Den bløde gane bevæger sig op og ned under tale, forhindrer luft at undslippe gennem næsen. Børn med en kløft i ganen ikke har denne kontrolfunktion resulterer i et fænomen kendt som velopharyngeal dysfunktion 2,3. Selvom behandlingsprotokoller er variable, kirurgisk reparation af den bløde gane finder sted i den tidlige barndom (6-36 måneder gamle) 4. De unormalt indsatte muskler af bløde gane kan korrigeres kirurgisk 5-7, der dog stadig er velopharyngeal dysfunktion i 7% til 30%af patienterne 2,3,8-10.
Evnen af skeletmuskulaturen regenerere gennem virkningen af satellit celler (SCS) er veletableret 11,12. Ved muskel skade, er SCs aktiveret og migrere til skadestedet. Derefter formere sig, differentiere og smelte at danne nye myofibre eller reparere beskadigede dem 13. Hvilende SC'er ekspres transkriptionsfaktoren Pax7 14,15, medens deres afkom, de prolifererende myoblaster, desuden udtrykke den myogene bestemmelse faktor 1 (MyoD) 16. Differentiering myoblaster begynder at udtrykke myogenin (MyoG) 17. Den terminale differentiering af myoblaster er præget af dannelsen af myofibre, og ekspressionen af muskel-specifikke proteiner, såsom myosin tung kæde (MyHC) 16,18.
For nylig er flere strategier været anvendt i regenerativ medicin at forbedre muskel regenerering af lemmer muskler 19-23. Specifikke undersøgelser afbranchiomeric hoved muskler er også vigtigt, fordi det blev for nylig vist, at de adskiller sig fra andre muskler i flere aspekter 24. I modsætning til lemmer muskler, er det blevet foreslået, at branchiomeric hoved muskler indeholder færre SC'er 25, regenerere langsommere og mere fibrøst bindevæv dannes efter skade 26 Desuden prolifererende SC'er fra branchiomeric hoved muskler også udtrykke andre transkriptionsfaktorer. For eksempel er Tcf21, en transkriptionsfaktor for kraniofaciale muskeldannelse stærkt udtrykt i regenererende hoved muskler, men næppe i regenererende lemmer muskler 25. Musklerne i den bløde gane af CLP patienter er som regel mindre og mindre velorganiseret forhold til normale palatale muskler 27,28. Langsomme og hurtige fibre er begge til stede i den bløde gane muskler, men de langsomme fibre er mere rigelige. I modsætning hertil spaltede muskler indeholde en højere andel af hurtige fibre og også en reduceret kapillær forsyningsammenlignet med normale bløde gane muskler 29-31. Hurtige fibre er mere tilbøjelige til sammentrækning-induceret beskadigelse 31-33. Den medfølgende dårlige kapillære udbuddet kan også fremme fibrose 34,35. Alle disse aspekter kan bidrage til de fattige regenerering af bløde gane muskler efter kirurgisk kløft lukning 36. I lyset af dette, en protokol til isolering og karakterisering af branchiomeric hoved muskel SC'er er afgørende. Dette giver mulighed for at studere SC biologi branchiomeric hoved muskler. Derudover kan nye behandlinger baseret på tissue engineering udvikles til at fremme muskel regenerering efter kirurgi i CLP og andre tilstande forværre de kraniofaciale område.
Generelt kan SC'er opnås efter dissociering af muskelvæv 14. Hakning, enzymatisk nedbrydning, og findeling er generelt forpligtet til at frigive SC'er fra deres niche. SC'er kan renses ved præ-plating på ikke-coatede skåle 14,37,38, fractionation på Percoll 39,40 eller fluorescent- eller magnetisk cellesortering 41-43. Her præsenterer vi en ny økonomisk og hurtig protokol til isolering af satellit celler fra branchiomeric hoved muskler af unge voksne rotter. Denne protokol er baseret på en tidligere manuskript 14 og er specielt indrettet til små vævsprøver. Isoleringen af SC'er fra repræsentative muskler oprindelse fra 1., 2., og 4. Branchialfodder buer er beskrevet. Efter isolering, lavt antal satellit-celler dyrkes på ekstracellulære matrix gel pletter af millimeter størrelse for at studere deres differentiering. Denne fremgangsmåde undgår kravet om udvidelse og passage af SC'er.
SC'er fra forskellige branchiomeric hoved muskler blev isoleret fra en 9 uger gammel Wistar rotte og dyrket direkte på ekstracellulær matrix gel spots uden forudgående ekspansion og passage. Efter isolering blev cellerne talt og podet ved samme celledensitet. For parallel isolation af tre forskellige muskler, denne metode tager omkring 4 timer. For at undgå kontaminering kultur, et kritisk trin er den hurtige vask i alkohol 70% efter dissektion af musklerne.
Under SC isolation er det vigtigt at skære muskelvæv i små stykker (ca. 2 mm), men undgå for meget hakning da dette vil resultere i en lille celle udbytte på grund af cellebeskadigelse. Desuden skal varigheden af den enzymatiske fordøjelse kontrolleres omhyggeligt under mikroskop for at undgå yderligere beskadigelse. Formålet med fordøjelsen er at dissociere myofibre. Da over 90% af de isolerede celler udtrykker Pax7, er yderligere oprensning påkrævet (figur 6-8).Derved undgår ekstra oprensningstrin i andre metoder såsom pre-plating på ubestrøget retter 14,37,38, fraktionering på Percoll 39,40 eller fluorescent- eller magnetisk cellesortering 41,43. For triturering er det vigtigt at inducere forskydning mellem væv fragmenter og åbningen af pipettespidsen da dette giver den mekaniske frigørelse af SCS. Hvis findeling med en 10 ml pipette (indvendig diameter tip: 1 mm) er svært, en 5 ml (indvendig diameter tip: 2 mm) kan pipette anvendes først. Alternativt kan glas Pasteur-pipetter skæres i den ønskede diameter og anvendes. Denne metode er enkel, effektiv og tillader den samtidige isolation af SC fra forskellige muskelgrupper prøver.
Dyrkningspladerne til SCS kan også overtrækkes med gelatine eller collagen, men vores tidligere undersøgelser viser, at ekstracellulær matrix gel er langt bedre for opretholdelse af den myogene potentiale end collagen 38. De ekstracellulære matrix gel pletter afmillimeter størrelse (10 pl / Ø 2 mm eller 20 pl / Ø 4 mm) tillader studiet af proliferation og differentiering af SC'er med et begrænset antal celler. For differentieringen assayet ca. 8 til 20 gange færre celler er påkrævet i forhold til en 24-brønds plade (Ø 15,6 mm), og ca. 80 til 200 gange færre sammenlignet med 35 mm petriskåle (Ø 35 mm) 14,38.
Eftersom ekstracellulær matrix gel er dyre, er denne metode også mere omkostningseffektiv. Desuden kan de kammerskiver erstattes af plastik dækglas for yderligere at reducere omkostningerne. Til fremstilling af den ekstracellulære matrix gel blev natten over tørring af kammerskiver er afgørende. Som de ekstracellulære matrix gel spots er gennemsigtige, er det nødvendigt at markere pletter ved den nederste side ved anvendelse tilbage belysning. Kamrene objektglas er fastgjort i en petriskål til nem manipulation. Yderligere cellekultur ekspansion er ikke nødvendig, hvilket giver mulighed for at studere SCS smLer muskler eller små muskelgrupper prøver. Alternativt, fx til PCR eller muskel-konstruktioner hvis flere celler er nødvendige, kan de frisk isolerede SC'er først blive udvidet i T75-kolber som anført ovenfor.
SC'er isoleret under anvendelse af denne protokol er ikke egnede til yderligere oprensning med flowcytometri straks efter isolering. Fordøjelsen med pronase forårsager omfattende fordøjelse af overfladeantigener 14. Hesteserum og føtalt bovint serum, der anvendes til cellekultur skal først ordentligt karakteriseret før isolation, som forskellige partinumre differentielt påvirket myoblaster proliferation og differentiering.
I de seneste år, er der en voksende interesse i musklerne afledt Branchialfedderne buer og hovedet mesoderm (f.eks ekstraokulære muskler) 24. Det er blevet tydeligt demonstreret, at hoved og lemmer muskler besidder meget forskellige egenskaber. Kæbemuskel fra gamle dyr synes at reTain deres regenerationsevne sammenlignet med lemmer muskler 25,26. SC'er fra ekstraokulære muskler besidder en robust proliferation og differentiering kapacitet sammenlignes med SC'er fra hoved muskler, og viser et større potentiale end indpodning lemmemuskel SC'er 24.
Den fibertype fordeling og myosin sammensætning varierer mellem muskelgrupper og også mellem arter. Muskler oprindelse fra den første brankiebue hos mennesker indeholder både langsomme og hurtige fibre (undertyper IIA og IIx), neonatale myosiner og myosiner typiske for udvikling hjertemuskel. I gnavere disse muskler indeholder omkring 95% hurtige fibre myosin IIa og IIb) 44-46. Undersøgelser af aviær muskler viser, at SC'er fra forskellige muskel fibertyper varierer i differentiering kapacitet. SC'er fra hurtige fibre kun differentiere til hurtige muskelfibre, mens SC'er fra langsomme fibre kan differentiere ind i begge fibertyper 47. Derudover var procentdelen af SCs i hurtig muskelfibre er lavere end i langsomme muskelfibre 48,49. Dette indikerer, at der skal tages fiber typen fordeling hensyn til undersøgelser på muskler i kraniofacial område. Svarende til ganespalte muskler, LVP hos gnavere indeholder næsten udelukkende hurtige fibre 50. Derfor, SC'er fra LVP er egnede til prækliniske undersøgelser på området ganespalte.
Denne protokol giver nye muligheder for at studere SC'er afledt branchiomeric hoved muskler eller andre mindre muskler eller mindre muskler prøver. Dette vil fremme udviklingen af nye behandlingsformer til at forbedre regenerering af muskler i maxillofacial område i forhold såsom ganespalte, men også i andre forhold, der påvirker mindre muskler.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |