Bu protokol, 9 haftalık farenin branchiomeric merkez kas uydu hücreleri izolasyonunu anlatmaktadır. kaslar, farklı brankiyal kemerlerin kaynaklanmaktadır. Daha sonra, uydu hücreleri farklılaşma çalışma milimetre boyutta bir Noktası kaplama üzerinde kültürlenmiştir. Bu yaklaşım, uydu hücrelerinin genişleme ve pasajlanmasını önler.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
Yaklaşık 1: 500-1: 1000 yenidoğan dudak ve / veya damak (CLP) içeren yarık gösterirler; Böylece bu insanlarda 1 en sık doğumsal anomalidir. yumuşak damak kasları konuşma, yutma ve emme sırasında yumuşak damak işleyişi için kritik öneme sahiptir. Yumuşak damak yarık varsa, bu kaslar anormal damak kemiğinin arka ucuna yerleştirilir.
yumuşak damak burundan kaçmak için havanın önlenmesi, konuşması sırasında yukarı ve aşağı hareket eder. Damakta bir yarık olan çocuklar velofaringeal disfonksiyonu 2,3 olarak bilinen bir fenomen sonuçlanan bu kontrol fonksiyonu yoktur. Tedavi protokolleri değişken olmasına rağmen, yumuşak damağın cerrahi onarımı erken çocukluk (yaş 6-36 ay) 4 gerçekleşir. yumuşak damak anormal eklenen kasları cerrahi 5-7 düzeltilebilir, ancak velofaringeal disfonksiyon% 30% 7 devamHastaların 2,3,8-10 evi.
Uydu hücreleri (SCS) aksiyonu sayesinde yeniden oluşturmak için iskelet kası kabiliyeti de 11,12 kurulur. Kas hasarı üzerine, SCs aktive edilir ve yaralanma yerinde göç ederler. Daha sonra, çoğalırlar farklılaştırmak ve yeni myofibers veya onarım hasarlı olanları 13 oluşturmak için sigorta. Onların soyu, çoğalan miyoblastlar, ayrıca miyojenik belirleme faktörü 1 (MyoD) 16 ifade ederken hareketsiz SC'ler, transkripsiyon faktörü Pax7 14,15 ifade eder. Farklılaşan miyoblastlar 17 (MyoG) myogenin ifade başlar. miyoblastların terminal farklılaşma myofibers oluşumu ve bu miyozin ağır zincir (MyHC) 16,18 kas özel proteinlerin ekspresyonu ile işaretlenir.
Son zamanlarda, çeşitli stratejiler bacak kasları 19-23 kas rejenerasyonu arttırmak için rejeneratif tıpta kullanılmaktadır. Üzerine özel çalışmalarSon zamanlarda onlar çeşitli yönleriyle 24 diğer kasların farklı olduğu gösterilmiştir çünkü branchiomeric baş kasları da önemlidir. Bacak kaslarının aksine, bu branchiomeric kası az SC'ler 25 içeren yavaş yeniden, daha lifli bir bağ dokusu, aynı zamanda, diğer transkripsiyon faktörlerini ifade branchiomeric kafası kaslardan SC'ler çoğalan Buna ek olarak, yaralanma 26 sonrası meydana geldiği önerilmiştir. Örneğin, Tcf21 kraniofasiyel kas oluşumu için bir transkripsiyon faktörü kuvvetli baş kasları rejenere ancak pek bacak kasları 25 yenileyici olarak ifade edilir. CLP hastaların yumuşak damak kasları genellikle daha küçük ve daha az normal bir damak kasları 27,28 oranla iyi organize bulunmaktadır. Yavaş ve hızlı lifler hem yumuşak damak kasları mevcut ama yavaş lifler daha boldur. Buna karşılık, yarık kaslar da daha yüksek bir hızla liflerin oranı ve azaltılmış kılcal kaynağı ihtivaNormal yumuşak damak kasları 29-31 ile karşılaştırıldığında. Hızlı lifler daralma kaynaklı yaralanma 31-33 daha yatkındır. Ekteki kötü kılcal kaynağı da fibrozis 34,35 teşvik edebilir. Bütün bu yönleriyle cerrahi yarık kapatılması 36 sonra yumuşak damak kaslarının zayıf rejenerasyon katkıda bulunabilir. Bu göz önüne alındığında, branchiomeric baş kas SC'ler izolasyonu ve karakterizasyonu için bir protokol önemlidir. Bu branchiomeric baş kasların SC biyolojisi okumak için imkanı sağlar. Buna ek olarak, doku mühendisliği dayalı yeni tedaviler CLP ve kraniofasial alanı ödün diğer koşullarda ameliyat sonrası kas rejenerasyonu teşvik etmek geliştirilebilir.
Genel olarak, SCs kas dokusunun 14 ayırmadan sonra elde edilebilir. Kıyma, enzimatik sindirim, ve toz haline getirme genellikle niş SC'ler serbest bırakmak için gereklidir. SC'ler FR, kaplanmamış yemekler 14,37,38 ilgili ön plaka ile saflaştırılabiliractionation Percoll 39,40 tarihinde, fluorescent- veya manyetik veya hücre 41-43 sıralama. Burada genç erişkin sıçanların branchiomeric baş kasları uydu hücrelerin izolasyonu için yeni bir ekonomik ve hızlı bir protokol mevcut. Bu protokol daha önce el yazması 14 ve özellikle de küçük bir doku örnekleri için uyarlanmış dayanır. 1 st, 2 nci ve 4. branşiyal kemerlerin kaynaklanan temsili kaslar SC'ler izolasyonu açıklanmıştır. İzolasyondan sonra, uydu hücreleri düşük sayıda kendi farklılaşma çalışma milimetre büyüklüğü hücre dışı matris jel noktalar üzerinde kültürlenmiştir. Bu yaklaşım, SC'ler genişlemesi ve geçiş için gereksinimi ortadan kaldırır.
Farklı branchiomeric kafa kaslardan SC'ler önce genişleme ve Pasajlanması olmadan tek 9 haftalık Wistar sıçan ve hücre dışı matris jel noktalar doğrudan kültüre izole edilmiştir. İzolasyondan sonra, hücreler sayılmış ve aynı hücre yoğunluğunda tohumlanır. Üç farklı kas paralel izolasyonu için, bu yöntem, yaklaşık 4 saat sürer. Kültür kirlenmesini önlemek için, kritik bir adımdır kasların diseksiyonu sonrası alkol% 70 hızlı yıkama olduğunu.
SC izolasyonu sırasında küçük parçalar halinde kas dokusu (yaklaşık 2 mm) kesilmiş fakat bu, bir hücre hasarı küçük hücreli verimle sonuçlanacak şekilde çok Kıyma önlemek için önemlidir. Ayrıca, enzimatik sindirim süresi daha fazla zarar görmesini önlemek için mikroskop altında dikkatlice kontrol edilmelidir. sindirim amacı myofibers ayırmak olduğunu. İzole hücrelerin% 90'ından fazlası Pax7 ifade için, başka bir saflaştırma (Şekil 6-8) gereklidir.Bu tür Percoll 39,40 üzerinde kaplanmamış yemekleri 14,37,38 öncesi kaplama, fraksiyon gibi diğer yöntemlerle ekstra arıtma adımlarını önler, fluorescent- veya manyetik veya hücre 41,43 sıralama. Toz haline için, bu SC'ler mekanik serbest bırakılmasına izin doku parçaları ve pipet ucu açıklığı arasında kesme yaratmaması için gereklidir. (İç çapı: 1 mm), 10 ml bir pipet ile toz haline getirme durumunda zor, (İç çapı: 2 mm) 5 ml'lik bir pipetten, ilk kullanılabilir. Seçenek olarak ise, bir cam Pasteur pipet arzu edilen çapta kesilebilir ve kullanılabilir. Bu yöntem, etkili basit ve farklı kas örnekleri SC eş zamanlı izolasyonu sağlar.
SC'ler için kültür plakaları da jelatin ya da kolajen ile kaplanmış olabilir, ama daha önceki çalışmalar, hücre dışı matris jel kollajen 38 daha miyojenik potansiyelinin korunması için çok daha iyi olduğunu göstermektedir. hücre dışı matriks jel noktalarmilimetre boyutu (10 ul / Ø 2 mm veya 20 ul / Ø 4 mm) çoğalması ve hücrelerin sınırlı sayıda olan SC'ler farklılaşma çalışma sağlar. Farklılaşma deneyi için yaklaşık 8-20 kat daha az hücre, bir 24 oyuklu plaka (çap 15,6 mm) ile karşılaştırıldığında gereklidir ve daha az yaklaşık 80-200 kat 35 mm Petri kapları (çap: 35 mm) 14,38 ile karşılaştırıldığında.
Hücre dışı matris jel pahalı olduğundan, bu yöntem aynı zamanda daha maliyet-etkin olduğunu. Buna ek olarak, bölmeli lamlar plastik örtü ile ikame edilmiş olabilir daha maliyetlerini azaltmak için kayar. Hücre dışı matriks jel hazırlanması için oda slaytlar gecede kurutma esastır görür. Hücre dışı matris jel noktalar saydam olarak, aydınlatma geri kullanılarak alt tarafındaki yeri işaretlemek için gereklidir. odaları slaytlar kolay manipülasyon için bir Petri kabındaki sabittir. Daha fazla hücre kültürü genişletme Smal SCS çalışma imkanı sunduğu gerekli değildir,kasları veya küçük kas örnekleri Ler. Seçenek olarak, PCR ya da kas için, örneğin daha fazla hücre gerekli ise, yukarıda belirtildiği gibi, yeni izole edilmiş SC'ler ilk T75 şişelerinde genişletilebilir oluşturur.
SC'ler Bu protokol kullanılarak izole hemen sonra akış sitometrisi ile daha fazla saflaştırılması için uygun değildir izole edilmiştir. Pronaz ile sindirme yüzeyinin geniş sindirimi 14 antijenleri neden olur. Farklı lot numaraları farklı şekilde miyoblastlar proliferasyonunu ve farklılaşmasını etkilenen hücre kültürü için kullanılan at serumu ve fetal inek serumu ilk düzgün, izolasyondan önce, özelliği olmalıdır.
Son yıllarda, brankial kemerler ve baş mezoderm (örneğin göz dışı kaslar) 24 türetilen kasların artan bir ilgi var. Açıkça baş ve bacak kasları çok farklı özelliklere sahip olduğu gösterilmiştir. Eski hayvanlardan masseter kası yeniden görünüyorbacak kasları 25,26 ile karşılaştırıldığında onların rejeneratif kapasitesini tain. Göz dışı kaslarının gelen SC'ler kafa kaslardan SC'ler karşılaştırılabilir sağlam bir çoğalma ve farklılaşma kapasitesine sahip ve bacak kas SC'ler 24 daha büyük engraftmınt potansiyeli gösteriyor.
lif tipi dağılımı ve miyozin kompozisyonu, kas grupları arasında ve aynı zamanda türler arasında değişmektedir. İnsanlarda ilk branşiyal kemer kaynaklanan Kaslar kalp kası geliştirmek için tipik yavaş ve hızlı hem de lifler (alt tiplerini IIA ve IIX), yenidoğan miyosinler ve miyosinler içerirler. Kemirgenlerde bu kaslar yaklaşık% 95 hızlı lifler miyozin IIA ve IIb) 44-46 içerirler. Kuş kaslar üzerinde yapılan çalışmalar, farklı kas lifi türlerinden SC'ler farklılaşma kapasitesi değişir olduğunu göstermektedir. Yavaş liflerden SC'ler hem elyaf türleri 47 ayırt süre hızlı lifler SC'ler sadece hızlı kas lifleri ayırt. Buna ek olarak, hızlı bir kas SC'ler yüzdesilifler, düşük kas lifleri 48,49 daha düşüktür. Bu lif tipi dağılımı kraniofasyal alanda kasları üzerinde çalışmalar için dikkate alınması gerektiğini göstermektedir. Yarık damak kasları benzer kemirgenlerde LVP hızlı optikleri 50 neredeyse sadece içerir. Bu nedenle, LVP gelen SC'ler yarık damak alanı içindeki ön-klinik çalışmalar için uygundur.
Bu protokol branchiomeric baş kas veya diğer küçük kaslar veya daha küçük kaslar örneklerinden elde edilen SC'ler incelemek için yeni imkanlar sunuyor. Bu tür yarık damak olarak değil, aynı zamanda daha küçük kasları etkileyen diğer koşullarda şartlarda maksillofasiyal bölgedeki kasların yenilenmesini artırmak için yeni tedavilerin geliştirilmesini kolaylaştıracaktır.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |