Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

Isolering og karakterisering af satellit-celler fra rotte Hoved Branchiomeric Muskler

doi: 10.3791/52802 Published: July 20, 2015

ERRATUM NOTICE

Summary

Denne protokol beskriver isoleringen af ​​satellit celler fra branchiomeric hoved muskler en 9 uger gammel rotte. Musklerne stammer fra forskellige Branchialfodder buer. Efterfølgende satellit-celler dyrkes på en plet belægning af millimeter størrelse at studere deres differentiering. Denne fremgangsmåde undgår udvidelse og passage af satellit celler.

Introduction

Ca. 1: 500 til 1: 1.000 nyfødte udviser en spalte involverer læbe og / eller ganen (CLP); således dette er den mest almindelige medfødte misdannelser hos mennesker 1. Musklerne i den bløde gane er kritiske for driften af ​​den bløde gane under tale, synke og sutte. Hvis en kløft af den bløde gane er til stede, er disse muskler unormalt indsat i den bageste ende af palatinale knogle.

Den bløde gane bevæger sig op og ned under tale, forhindrer luft at undslippe gennem næsen. Børn med en kløft i ganen ikke har denne kontrolfunktion resulterer i et fænomen kendt som velopharyngeal dysfunktion 2,3. Selvom behandlingsprotokoller er variable, kirurgisk reparation af den bløde gane finder sted i den tidlige barndom (6-36 måneder gamle) 4. De unormalt indsatte muskler af bløde gane kan korrigeres kirurgisk 5-7, der dog stadig er velopharyngeal dysfunktion i 7% til 30%af patienterne 2,3,8-10.

Evnen af skeletmuskulaturen regenerere gennem virkningen af satellit celler (SCS) er veletableret 11,12. Ved muskel skade, er SCs aktiveret og migrere til skadestedet. Derefter formere sig, differentiere og smelte at danne nye myofibre eller reparere beskadigede dem 13. Hvilende SC'er ekspres transkriptionsfaktoren Pax7 14,15, medens deres afkom, de prolifererende myoblaster, desuden udtrykke den myogene bestemmelse faktor 1 (MyoD) 16. Differentiering myoblaster begynder at udtrykke myogenin (MyoG) 17. Den terminale differentiering af myoblaster er præget af dannelsen af myofibre, og ekspressionen af muskel-specifikke proteiner, såsom myosin tung kæde (MyHC) 16,18.

For nylig er flere strategier været anvendt i regenerativ medicin at forbedre muskel regenerering af lemmer muskler 19-23. Specifikke undersøgelser afbranchiomeric hoved muskler er også vigtigt, fordi det blev for nylig vist, at de adskiller sig fra andre muskler i flere aspekter 24. I modsætning til lemmer muskler, er det blevet foreslået, at branchiomeric hoved muskler indeholder færre SC'er 25, regenerere langsommere og mere fibrøst bindevæv dannes efter skade 26 Desuden prolifererende SC'er fra branchiomeric hoved muskler også udtrykke andre transkriptionsfaktorer. For eksempel er Tcf21, en ​​transkriptionsfaktor for kraniofaciale muskeldannelse stærkt udtrykt i regenererende hoved muskler, men næppe i regenererende lemmer muskler 25. Musklerne i den bløde gane af CLP patienter er som regel mindre og mindre velorganiseret forhold til normale palatale muskler 27,28. Langsomme og hurtige fibre er begge til stede i den bløde gane muskler, men de langsomme fibre er mere rigelige. I modsætning hertil spaltede muskler indeholde en højere andel af hurtige fibre og også en reduceret kapillær forsyningsammenlignet med normale bløde gane muskler 29-31. Hurtige fibre er mere tilbøjelige til sammentrækning-induceret beskadigelse 31-33. Den medfølgende dårlige kapillære udbuddet kan også fremme fibrose 34,35. Alle disse aspekter kan bidrage til de fattige regenerering af bløde gane muskler efter kirurgisk kløft lukning 36. I lyset af dette, en protokol til isolering og karakterisering af branchiomeric hoved muskel SC'er er afgørende. Dette giver mulighed for at studere SC biologi branchiomeric hoved muskler. Derudover kan nye behandlinger baseret på tissue engineering udvikles til at fremme muskel regenerering efter kirurgi i CLP og andre tilstande forværre de kraniofaciale område.

Generelt kan SC'er opnås efter dissociering af muskelvæv 14. Hakning, enzymatisk nedbrydning, og findeling er generelt forpligtet til at frigive SC'er fra deres niche. SC'er kan renses ved præ-plating på ikke-coatede skåle 14,37,38, fractionation på Percoll 39,40 eller fluorescent- eller magnetisk cellesortering 41-43. Her præsenterer vi en ny økonomisk og hurtig protokol til isolering af satellit celler fra branchiomeric hoved muskler af unge voksne rotter. Denne protokol er baseret på en tidligere manuskript 14 og er specielt indrettet til små vævsprøver. Isoleringen af SC'er fra repræsentative muskler oprindelse fra 1., 2., og 4. Branchialfodder buer er beskrevet. Efter isolering, lavt antal satellit-celler dyrkes på ekstracellulære matrix gel pletter af millimeter størrelse for at studere deres differentiering. Denne fremgangsmåde undgår kravet om udvidelse og passage af SC'er.

Protocol

Alle eksperimenter beskrevet heri blev godkendt af den lokale bestyrelse for dyreforsøg fra Radboud University Nijmegen i overensstemmelse med hollandske love og regler (RU-december 2013 til 205).

1. ekstracellulære matrix Gel Steder

  1. Udfør følgende trin en dag før isolation:
    1. Tø en alikvot ekstracellulær matrix gel (100 pl) ved 4 ° C i mindst 1,5 time. Fortynd 1:10 i Dulbeccos modificerede Eagles medium; med 4.500 mg / l glucose, 4 mM L-glutamin og 110 mg / ml natriumpyruvat (DMEM). Holde den ekstracellulære matrix gel ved 4 ° C på alle tidspunkter. Bemærk: Pludselige temperaturændringer vil resultere i ujævn belægning og krystal formation.
    2. Holde den fortyndede ekstracellulære matrix gelopløsning på is i 15 minutter.
    3. Pre-chill en 20 pi mikropipette i 10 min.
    4. Put 8-brønds kammerobjektglas i en 100 mm petriskål og overføre skålen på en kold overflade (fx en fryser pack) i 10 minutter.
    5. Brug forkølet mikropipette til at sætte en dråbe 10 pi ekstracellulær matrix gel i hver brønd. Hold petriskålen på den kolde overflade i mindst en anden 7 min (figur 1A).
    6. Helt at fjerne den resterende ekstracellulære matrix gel (figur 1B), og tør brøndene ved 37 ° C natten over.

2. Dissektion af chef Muskler (kæbemuskler, Digastric og Levator Veli Palatini)

  1. Før dissektion, forberede 50 ml phosphatpufret saltvand (PBS) suppleret med 2% penicillin-streptomycin (P / S). Hold på is.
  2. Efter aflivning af en ung voksen rotte (9 uger) med CO 2 / O 2, halshugge hovedet og fjerne huden fra hovedet. Overfør hovedet til iskoldt PBS suppleret med 2% P / S i en 50 ml rør.
  3. Kæbemuskel (afledt fra 1. brankiebue)
    1. Placer hovedet med den ene side op på en silicone pad og fix med subkutan needles (figur 2A).
    2. Identificer ørespytkirtlen og facial nerve (figur 2A). Udsætte den dybe fascia dækker kirtel. Skær fascia og fjern kirtlen hjælp dissektion saks. Identificere den ydre øregang. Trace ansigtets nerve fra stylomastoid foramen og fjern forsigtigt de tidsmæssige, zygomatic og buccale grene med en skalpel klinge No. 15.
    3. Frigør den overfladiske leder af kæbemuskel ved at fjerne fascia. Identificer både overfladiske og dybe lederne af kæbemuskel. Spore den overfladiske hoved, indtil dens tykke tendinous aponeurosis indsat i kindbenet proces med maxilla.
    4. Adskil senen fra dens oprindelse på zygomatic proces med en lige pincet. Skær den med en skalpel nr 15 eller dissektion saks og forsigtigt liv det (Figur 2B).
    5. Dissekere overfladiske hoved kæbemuskler indtil dens indsættelse ved den vinkel og ringere halvdel af than sideflade ramus af underkæben med en skalpel No. 15 (figur 2C). Nu, helt at fjerne musklen.
  4. Posterior bugen af musklen kan kæbe (afledt af 2. brankiebue)
    1. Placer hovedet i liggende stilling på silicone pad og fix med kanyler (figur 3A).
    2. Fjern spæk overliggende både sublingual og submandibulære kirtler. Dernæst fjerner overfladiske fascia og kirtler hjælp dissektion saks. Expose kan kæbe muskel (forreste og bageste mave).
    3. Hold den forreste senen af den bageste maven med en straight pincet, klippe det, og dissekere den omhyggeligt, indtil sin oprindelse i tympaniske bulla (figur 3B). Gør det samme på den kontralaterale side.
  5. Levator veli Palatini muskel (afledt fra det 4. brankiebue)
    1. Efter dissektion af den bageste mave kan kæbe muskler, Lokalisere stylohyoid muskler, træk den sideværts, og fjern forsigtigt det (figur 4A).
    2. Lokalisere senen af levator veli Palatini der indsætter ved den tympaniske bulla (figur 4A). Dissekere den omhyggeligt og skære det på begge sider.
    3. Se efter luftrøret og spiserøret, der kører bagved. Løft spiserøret, og udsætte svælget, strubehovedet og den bløde gane.
    4. Lokalisere det område af den bløde gane, hvor levator veli Palatini er indsat og skære det løs (figur 4B).
      Bemærk: Direkte efter dissektion, fjern forsigtigt sener og bindevæv fra hver muskel under stereomikroskop. Nedsænkes alle prøver hurtigt i ethanol 70%, og overføre dem til iskoldt PBS suppleret 2% P / S i en 15 ml rør.

3. Isolering af satellit celler

  1. Udfør følgende forberedelse trin til SC isolation fra 3 grupper af muskler:
    1. Forbered 7,5 ml 0,1% pronase i DMEM. Opløsningen filtreres gennem et 0,22 um filter. Pre-opvarme opløsningen ved 37 ° C i et vandbad i 10 minutter før isolation.
    2. Forbered 35 ml DMEM suppleret med 10% hesteserum (HS) og 1% P / S. Også præ-varme ved 37 ° C i et vandbad.
    3. Forbered 15 ml dyrkningsmedium, som består af DMEM suppleret med 20% føtalt bovint serum (FBS), 10% HS, 1% P / S og 1% kylling embryo ekstrakt (CEE). Pre-varme ved 37 ° C i et vandbad.
    4. Pre-coat seks plastik pipetter (10 ml) med HS og tørre i mindst 10 minutter før brug.
  2. I kulturen hætte, overføre hver muskel i en brønd af en 6-brønds plade. Under anvendelse af de dissektion saks, klippe musklen i små stykker på ca. 2 mm. Pas på ikke at hakke vævet for meget.
  3. Tilsættes forsigtigt 2,5 ml 0,1% pronase-opløsning til hver brønd og inkuberes ved 37 ° C i 60 minutter. Ryst forsigtigt pladen efter 20, 40 og 60 min. Bemærk: Den nøjagtige duration af inkubationen afhænger af faktorer som alder og stamme af dyrene.
  4. Overvåg under mikroskop. Kontroller muskel fragmenter og stoppe den enzymatiske fordøjelse når fibrene bundter få løsnet udseende (figur 5).
  5. Tilsættes 2,5 ml DMEM suppleret med 10% HS og 1% P / S. Overførsel til en 15 ml rør og centrifugeres rørene ved 400 xg i 5 min. Kassér supernatanten ved dekantering.
  6. Tilsæt 5 ml DMEM suppleret med 10% HS og 1% P / S. Pipetteres opløsningen op og ned med en 10 ml plastik pipette (triturering) i mindst 20 gange for at homogenisere vævet.
  7. Centrifuger rørene ved 200 xg i 4 min. Opsaml supernatanten og overføres til et 15 ml rør.
  8. Tilsæt 5 ml DMEM suppleret med 10% HS og 1% P / S. Pipette igen med en 10 ml plastik pipette, indtil vævsfragmenterne passerer let gennem pipetten.
  9. Centrifuger rørene ved 200 xg i 4 min og indsamle supernatanten i et 15 ml rør.
  10. Put en celle si (40 um) på et 50 ml rør og overfør supernatanten indeholdende de dissocierede celler på filteret. Vask med 1 ml DMEM for maksimal celle opsving.
  11. Centrifuger rørene ved 1.000 xg i 10 min og kassér supernatanten med en pipette.
  12. Pellet resuspenderes i 300 pi kulturmedium og tælle cellerne i et hæmocytometer.

4. Differentiering af satellit celler på Ekstracellulær Matrix Gel Steder

  1. Cellesuspensionen fortyndes til opnåelse af 1,5 x 10 3 celler i 10 pi kulturmedium.
  2. Fastgør dækslerne af kamrene dias med tape og markere pletter med en sort markør på undersiden af ​​objektet glas.
  3. Med en mikropipette sætte en dråbe af 10 pi cellesuspension på den ekstracellulære matrix gelplet. Kontroller under mikroskop, om dråbe cellesuspension er blevet placeret korrekt på stedet. Der inkuberes i seks timer ved 37 ° C.
  4. Forsigtigly tilsættes 400 pi kulturmedium (DMEM suppleret med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S og 1% CEE) og inkuberes i tre dage ved 37 ° C.
    Bemærk: På dette tidspunkt er frisk isolerede SC udsat for massive traumer (enzymatisk fordøjelse og barske findeling), og de har brug for at komme sig. Ikke forstyrrer cellerne under de første tre dage 37. Dernæst kan dyrkningsmediet ændres afhængigt af typen af ​​eksperimentet.
    Den ekstracellulære matrix gel spots kan podes med en høj celledensitet (1,5-2,5 x 10 3/20 pi) for differentiering assay. Dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S og 1% kylling embryo ekstrakt) kan udskiftes hver tredje dag.
  5. Alternativt, hvis der ønskes ekspansion og passerer følge de næste trin:
    1. Tø en alikvot ekstracellulær matrix gel (500 pi) ved 4 ° C i mindst 1,5 time. Fortynd 1:10 i DMEM og følge anbefalingerne i punkt 1.1.1.
    2. Pre-chill en 10 ml pipette i 10 minutter ved 4 &# 176; C.
    3. Overfør tre T75 kolber på en kold overflade (fx en fryser pack) i 10 minutter.
    4. Brug forkølet pipette til at sætte 1 ml ekstracellulær matrix gelen i hver kolbe. Kontroller at overfladen er dækket fuldstændigt. Hold kolberne på den kolde overflade i mindst en anden 7 min (figur 1A).
    5. Helt at fjerne den resterende ekstracellulære matrix gel med en 10 ml pipette, og tør brøndene ved 37 ° C i 1 time.
    6. Efter optælling, resuspendere frisk isolerede SC'er i 10 ml dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S og 1% kylling embryo ekstrakt) og frø i de forud overtrukne T75-kolber.
    7. Efter tre dage ændre mediet (og hver tredje dag), indtil 80% konfluens er nået. For passage, vaske T75 kolber tre gange med PBS. Næste tilsættes 1 ml 0,25% trypsin-opløsning og inkuberes i tre minutter ved 37 ° C. Resuspender i 9 ml dyrkningsmedium (DMEM suppleret med 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sog 1% kylling embryo ekstrakt) og centrifugeres ved 200 xg i 5 min. Kassér supernatanten. Efter optælling, resuspender 1 x 10 6 celler i 1.000 ul dyrkningsmedium og fryse cellerne.

Representative Results

Ved hjælp af denne protokol, tyggemusklen (én side) giver 0,8-1 x 10 6 celler, kan kæbe muskel (posterior belly) giver 1,5-2 x 10 5 celler og levator Veli Palatini muskel udbytter 1-1,5 x 10 5 celler. Celleudbytter afhænger af muskel type, stamme og alder af dyret. Til sammenligning mellem de tre muskelgrupper, blev frisk isolerede SC'er podet på samme celledensitet (1,5 x 10 3/10 pi). Direkte efter isolering, mere end 90% af de frisk isolerede celler udtrykker Pax7 (figur 6).

Dag 4, 7 og 10 kulturer blev farvet med antistoffer mod Pax7, MyoD, MyoG og MyHC immunfarvning. Fem vilkårlige felter blev talt pr kultur under anvendelse af et 20X objektiv. På dag 4 Pax 7 og Myo D udtrykkes i alle muskelgrupper (figur 6 og 7 og 8), men afkom af SatCs fra kæbemuskler og digastric muskler begynder Expressynge myogenin tidligere end levator veli Palatini musklen (figur 9). På dag 10, er ekspressionen af MyoG reduceret kraftigt i alle grupper (figur 9). Nogle dage efter podning på de ekstracellulære matrix gel spots, begynder de prolifererende celler til at smelte og danne multi-kerneholdige myotuber, som udtrykker myosin tung kæde. Små myorør er klart synlige på dag 7 (figur 10). På dag 10, kan observeres trækninger i myorør (Video 1).

Figur 1
Figur 1:. Ekstracellulær matrix gel pletter i et kammer slide (A) For let manipulation, placere 8-brønds kammer slide i en 100 mm petriskål. Pipet 10 pi ekstracellulær matrix gel i hvert kammer og sætte det på en kold overflade (7 min). (B) Chamber slide efter overskydende ekstracellulær matrix gel fjernes.

Figur 2
Figur 2:. Dissektion af tyggemusklen (A) leder af dyret i et sidebillede. Øre (E), ørespytkirtlen (P) og facial nerve (VII). (B) tendinous aponeurosis (Te) af den overfladiske leder af kæbemuskel (Ms) og tidsmæssig muskel (T). Adskil senen fra dets insertion med en pincet. (C) dissekere forsigtigt musklen indtil dens indsættelse ved ramus af underkæben. E: øre, P: ørespytkirtlen, VII: facial nerve, T: Temporal muskler, Ms: overfladisk leder af kæbemuskel, Te: sene, Mp: dyb leder af kæbemuskel.

Figur 3
Figur 3: Dissektion af den bageste bugen af musklen kan kæbe (.A) Leder af dyret i en liggende stilling. Lokalisere det submandibulære kirtel (Sg), kæbemuskel (M), facial nerve (VII) og musculus sternocleidomastoideus (SCM). Fjern den submandibulære kirtel. (B) lokalisere kan kæbe muskel anterior (AD) og posterior maven (PD). Med en straight pincet, tage den forreste senen af ​​den bageste mave, klippe det og dissekere den omhyggeligt, indtil sin oprindelse i tympaniske bulla (ty). E: øre, Sg: submandibulære kirtel, VII: facial nerve, M: kæbemuskel, SMC: musculus sternocleidomastoideus, AD: anterior mave digastric muskler, PD: posterior mave digastric muskler, Ty: Tympaniske bulla.

Figur 4
Figur 4:. Dissektion af levator veli Palatini muskel (A) General view efter dissektion af kan kæbe muskel (posterior mave). Stylohyoid muskel (St) og sener af levatorveli Palatini kan lokaliseres. Bemærk luftrøret (T) og spiserøret (Es), der kører bagved. (B) Efter at løfte luftrøret og spiserøret pharynx (P) er blotlagt. Indsættelsen af ​​levator veli Palatini i den bløde gane er nu synlig. Pilen angiver det dissekerede bløde gane med levator Veli Palatini muskler på begge sider. E: øre, St: stylohyoid muskler, VII: facial nerve, M: kæbemuskel, AD: anterior mave digastric muskler, PD: posterior mave digastric muskler, T: trachea, Es: spiserør, P: svælg, * levator veli Palatini muskel .

Figur 5
Figur 5: Udseende af muskelvæv (A) før og (B) efter enzymatisk behandling med pronase. Bemærk, at muskel bundter synes at være løsnet efter enzymatisk fordøjelse.


Figur 6: Pax 7 immunfarvning frisk isolerede SC'er, anvendt til ekstracellulær matrix gel ved udgangen af isolation (ca. 6 timer efter indledende vævsfordøjelse).. Fem vilkårlige felter blev talt under anvendelse af et 10X objektiv med et gennemsnit på 210 celler pr. Ca. 90% af cellerne er Pax 7 positive. DAPI: blå, Pax7: rød. Scale bar, 100 pm.

Figur 7
Figur 7:. Pax 7, MyoD immunfarvning Dag 4, 7 og 10 kulturer blev farvet med antistoffer mod Pax7 og MyoD immunfarvning. (A - C) og (D - F) Repræsentative mikrofotografier af dag 4 og 7 kulturer fra tyggemusklen. (G og H + og MyoD + kerner pr mikroskopisk felt blev talt og udtrykt som en procentdel af det samlede antal kerner (DAPI). DAPI: blå, Pax7: rød, og MyoD: grøn. Scales bar, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8
Figur 8:. Fordeling af Pax7 ± / ± MyoD i kulturer fra mononukleære celler i kulturer fra kæbemuskler, digastric og levator veli palatine muskel (A - C) Dag 4, 7 og 10 kulturer blev farvet med antistoffer mod Pax7 og MyoD immunfarvning. Det samlede antal celler er baseret på af det totale antal kerner (DAPI). (D) af data kvantificering af Pax7 ± / MyoD ± cells. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9
Figur 9:. Myogeningenet immunfarvning Dag 4, 7 og 10 kulturer blev farvet med antistoffer mod myogenin. (A - D) Repræsentative mikrofotografier af dag 4 og 7 kulturer fra levator veli palatine muskel. (E) Antallet af MyoG + kerner pr mikroskopisk felt blev talt og udtrykt som en procentdel af det samlede antal kerner (DAPI). (F) af data kvantificering af MyoG + celler. DAPI: blå, myogenin: grøn. Scales bar, 100 um. Klik her for at se en større version af denne figure.

Figur 10
Figur 10:. Myosin tung kæde immunfarvning Dag 4, 7 og 10 kulturer blev farvet med antistoffer mod myosin tung kæde (MyHC). Repræsentative mikrofotografier af dag 4, 7 og 10 kulturer fra kan kæbe (DIG) muskler. På dag 7, små myorør er til stede, mens på dag 10 lange og velorganiserede myorør er indlysende. Scales bar, 200 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1:.. Myotube trækninger Eksempler på to repræsentative marker med trækninger myorør er vist for dag 10 kulturer fra digastric muskel Klik her for at se denne video.

Discussion

SC'er fra forskellige branchiomeric hoved muskler blev isoleret fra en 9 uger gammel Wistar rotte og dyrket direkte på ekstracellulær matrix gel spots uden forudgående ekspansion og passage. Efter isolering blev cellerne talt og podet ved samme celledensitet. For parallel isolation af tre forskellige muskler, denne metode tager omkring 4 timer. For at undgå kontaminering kultur, et kritisk trin er den hurtige vask i alkohol 70% efter dissektion af musklerne.

Under SC isolation er det vigtigt at skære muskelvæv i små stykker (ca. 2 mm), men undgå for meget hakning da dette vil resultere i en lille celle udbytte på grund af cellebeskadigelse. Desuden skal varigheden af ​​den enzymatiske fordøjelse kontrolleres omhyggeligt under mikroskop for at undgå yderligere beskadigelse. Formålet med fordøjelsen er at dissociere myofibre. Da over 90% af de isolerede celler udtrykker Pax7, er yderligere oprensning påkrævet (figur 6-8).Derved undgår ekstra oprensningstrin i andre metoder såsom pre-plating på ubestrøget retter 14,37,38, fraktionering på Percoll 39,40 eller fluorescent- eller magnetisk cellesortering 41,43. For triturering er det vigtigt at inducere forskydning mellem væv fragmenter og åbningen af ​​pipettespidsen da dette giver den mekaniske frigørelse af SCS. Hvis findeling med en 10 ml pipette (indvendig diameter tip: 1 mm) er svært, en 5 ml (indvendig diameter tip: 2 mm) kan pipette anvendes først. Alternativt kan glas Pasteur-pipetter skæres i den ønskede diameter og anvendes. Denne metode er enkel, effektiv og tillader den samtidige isolation af SC fra forskellige muskelgrupper prøver.

Dyrkningspladerne til SCS kan også overtrækkes med gelatine eller collagen, men vores tidligere undersøgelser viser, at ekstracellulær matrix gel er langt bedre for opretholdelse af den myogene potentiale end collagen 38. De ekstracellulære matrix gel pletter afmillimeter størrelse (10 pl / Ø 2 mm eller 20 pl / Ø 4 mm) tillader studiet af proliferation og differentiering af SC'er med et begrænset antal celler. For differentieringen assayet ca. 8 til 20 gange færre celler er påkrævet i forhold til en 24-brønds plade (Ø 15,6 mm), og ca. 80 til 200 gange færre sammenlignet med 35 mm petriskåle (Ø 35 mm) 14,38.

Eftersom ekstracellulær matrix gel er dyre, er denne metode også mere omkostningseffektiv. Desuden kan de kammerskiver erstattes af plastik dækglas for yderligere at reducere omkostningerne. Til fremstilling af den ekstracellulære matrix gel blev natten over tørring af kammerskiver er afgørende. Som de ekstracellulære matrix gel spots er gennemsigtige, er det nødvendigt at markere pletter ved den nederste side ved anvendelse tilbage belysning. Kamrene objektglas er fastgjort i en petriskål til nem manipulation. Yderligere cellekultur ekspansion er ikke nødvendig, hvilket giver mulighed for at studere SCS smLer muskler eller små muskelgrupper prøver. Alternativt, fx til PCR eller muskel-konstruktioner hvis flere celler er nødvendige, kan de frisk isolerede SC'er først blive udvidet i T75-kolber som anført ovenfor.

SC'er isoleret under anvendelse af denne protokol er ikke egnede til yderligere oprensning med flowcytometri straks efter isolering. Fordøjelsen med pronase forårsager omfattende fordøjelse af overfladeantigener 14. Hesteserum og føtalt bovint serum, der anvendes til cellekultur skal først ordentligt karakteriseret før isolation, som forskellige partinumre differentielt påvirket myoblaster proliferation og differentiering.

I de seneste år, er der en voksende interesse i musklerne afledt Branchialfedderne buer og hovedet mesoderm (f.eks ekstraokulære muskler) 24. Det er blevet tydeligt demonstreret, at hoved og lemmer muskler besidder meget forskellige egenskaber. Kæbemuskel fra gamle dyr synes at reTain deres regenerationsevne sammenlignet med lemmer muskler 25,26. SC'er fra ekstraokulære muskler besidder en robust proliferation og differentiering kapacitet sammenlignes med SC'er fra hoved muskler, og viser et større potentiale end indpodning lemmemuskel SC'er 24.

Den fibertype fordeling og myosin sammensætning varierer mellem muskelgrupper og også mellem arter. Muskler oprindelse fra den første brankiebue hos mennesker indeholder både langsomme og hurtige fibre (undertyper IIA og IIx), neonatale myosiner og myosiner typiske for udvikling hjertemuskel. I gnavere disse muskler indeholder omkring 95% hurtige fibre myosin IIa og IIb) 44-46. Undersøgelser af aviær muskler viser, at SC'er fra forskellige muskel fibertyper varierer i differentiering kapacitet. SC'er fra hurtige fibre kun differentiere til hurtige muskelfibre, mens SC'er fra langsomme fibre kan differentiere ind i begge fibertyper 47. Derudover var procentdelen af ​​SCs i hurtig muskelfibre er lavere end i langsomme muskelfibre 48,49. Dette indikerer, at der skal tages fiber typen fordeling hensyn til undersøgelser på muskler i kraniofacial område. Svarende til ganespalte muskler, LVP hos gnavere indeholder næsten udelukkende hurtige fibre 50. Derfor, SC'er fra LVP er egnede til prækliniske undersøgelser på området ganespalte.

Denne protokol giver nye muligheder for at studere SC'er afledt branchiomeric hoved muskler eller andre mindre muskler eller mindre muskler prøver. Dette vil fremme udviklingen af ​​nye behandlingsformer til at forbedre regenerering af muskler i maxillofacial område i forhold såsom ganespalte, men også i andre forhold, der påvirker mindre muskler.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hypodermic Needle 25 G 0.5 x 25 m BD Microlance 300400
Dissecting scissors Braun BC154R
Micro forceps straight Braun BD330R
Surgical Scalpel Blade No. 15 Swann-Morton 0205
Alcohol 70% Denteck 2,010,005
Permanox Slide, 8 Chamber Thermo Scientific 177445
6 well cell culture plate Greiner bio-one 657160
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) Greiner bio-one 664160
15 ml sterile conical centrifuge tube BD Biosciences 352097
50 ml sterile conical centrifuge tube BD Biosciences 352098
Cell strainer (40 μm) Gibco 431750
10 ml serological pipette Greiner bio-one 607180
20 µl FT20 Greiner bio-one 774288
Matrigel, Phenol-Red Free BD Biosciences 356237 10 ml
Pronase Calbiochem 53702 10 KU
Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-144 500 ml
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate  Gibco 10569-010 500 ml
Fetal Bovine Serum   Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco 26050088 500 ml
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 100 ml
Chicken Embryo Extract MP Biomedicals 2850145 20 ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gritli-Linde, A. Molecular control of secondary palate development. Developmental Biology. 301, 309-326 (2007).
  2. Marrinan, E. M., LaBrie, R. A., Mulliken, J. B. Velopharyngeal function in nonsyndromic cleft palate: relevance of surgical technique, age at repair, and cleft type. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 35, 95-100 (1998).
  3. Morris, H. L. Velopharyngeal competence and primary cleft palate surgery, 1960-1971: a critical review. The Cleft Palate Journal. 10, 62-71 (1973).
  4. Mossey, P. A., Little, J., Munger, R. G., Dixon, M. J., Shaw, W. C. Cleft lip and palate. Lancet. 374, 1773-1785 (2009).
  5. Boorman, J. G., Sommerlad, B. C. Musculus uvulae and levator palati: their anatomical and functional relationship in velopharyngeal closure. British Journal of Plastic Surgery. 38, 333-338 (1985).
  6. Bae, Y. C., Kim, J. H., Lee, J., Hwang, S. M., Kim, S. S. Comparative study of the extent of palatal lengthening by different methods. Annals of Plastic Surgery. 48, 359-362 (2002).
  7. Braithwaite, F., Maurice, D. G. The importance of the levator palati muscle in cleft palate closure. British Journal of Plastic Surgery. 21, 60-62 (1968).
  8. Inman, D. S., Thomas, P., Hodgkinson, P. D., Reid, C. A. Oro-nasal fistula development and velopharyngeal insufficiency following primary cleft palate surgery--an audit of 148 children born between 1985 and 1997. British Journal of Plastic Surgery. 58, 1051-1054 (2005).
  9. Phua, Y. S., de Chalain, T. Incidence of oronasal fistulae and velopharyngeal insufficiency after cleft palate repair: an audit of 211 children born between 1990 and 2004. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 45, 172-178 (1990).
  10. Kirschner, R. E., et al. Cleft-palate repair by modified Furlow double-opposing Z-plasty: the Children's Hospital of Philadelphia experience. Plastic and Reconstructive Surgery. 104, 1998-2010 (1999).
  11. Mauro, A. Satellite cell of skeletal muscle fibers. The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9, 493-495 (1961).
  12. Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: still young and fascinating at 50. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59, 1041-1059 (2011).
  13. Ten Broek, R. W., Grefte, S., Von den Hoff, J. W. Regulatory factors and cell populations involved in skeletal muscle regeneration. Journal of Cellular Physiology. 224, 7-16 (2010).
  14. Danoviz, M. E., Yablonka-Reuveni, Z. Skeletal muscle satellite cells: background and methods for isolation and analysis in a primary culture system. Methods in Molecular Biology. 798, 21-52 (2012).
  15. Seale, P., et al. Pax7 is required for the specification of myogenic satellite cells. Cell. 102, 777-786 (2000).
  16. Yablonka-Reuveni, Z., et al. The transition from proliferation to differentiation is delayed in satellite cells from mice lacking MyoD. Developmental Biology. 210, 440-455 (1999).
  17. Zammit, P. S., Partridge, T. A., Yablonka-Reuveni, Z. The skeletal muscle satellite cell: the stem cell that came in from the cold. The Journal of Histochemistry And Cytochemistry. 54, 1177-1191 (2006).
  18. Andres, V., Walsh, K. Myogenin expression, cell cycle withdrawal, and phenotypic differentiation are temporally separable events that precede cell fusion upon myogenesis. The Journal of Cell Biology. 132, 657-666 (1996).
  19. Fukushima, K., et al. The use of an antifibrosis agent to improve muscle recovery after laceration. The American Journal of Sports Medicine. 29, 394-402 (2001).
  20. Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Skeletal muscle fibrosis: the effect of stromal-derived factor-1α-loaded collagen scaffolds. Regenerative Medicine. 5, 737-747 (2010).
  21. Jackson, W. M., Nesti, L. J., Tuan, R. S. Potential therapeutic applications of muscle-derived mesenchymal stem and progenitor cells. Expert Opinion on Biological Therapy. 10, 505-517 (2010).
  22. Sato, K., et al. Improvement of muscle healing through enhancement of muscle regeneration and prevention of fibrosis. Muscle, & Nerve. 28, 365-372 (2003).
  23. Tatsumi, R., Anderson, J. E., Nevoret, C. J., Halevy, O., Allen, R. E. HGF/SF is present in normal adult skeletal muscle and is capable of activating satellite cells. Developmental Biology. 194, 114-128 (1998).
  24. Stuelsatz, P., et al. Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency. Developmental biology. (2014).
  25. Ono, Y., Boldrin, L., Knopp, P., Morgan, J. E., Zammit, P. S. Muscle satellite cells are a functionally heterogeneous population in both somite-derived and branchiomeric muscles. Developmental Biology. 337, 29-41 (2010).
  26. Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Developmental Dynamics. 212, 495-508 (1998).
  27. Koo, S. H., Cunningham, M. C., Arabshahi, B., Gruss, J. S., Grant, J. H. 3rd The transforming growth factor-beta 3 knock-out mouse: an animal model for cleft palate. Plastic and Reconstructive Surgery. 108, 938-948 (2001).
  28. Fara, M., Brousilova, M. Experiences with early closure of velum and later closure of hard palate. Plastic and Reconstructive Surgery. 44, 134-141 (1969).
  29. Lindman, R., Paulin, G., Stal, P. S. Morphological characterization of the levator veli palatini muscle in children born with cleft palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 38, 438-448 (2001).
  30. Hanes, M. C., et al. Contractile properties of single permeabilized muscle fibers from congenital cleft palates and normal palates of Spanish goats. Plastic and Reconstructive Surgery. 119, 1685-1694 (2007).
  31. Rader, E. P., et al. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from normal and congenitally-clefted goat palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 44, 216-222 (2007).
  32. Rader, E. P., et al. Effect of cleft palate repair on the susceptibility to contraction-induced injury of single permeabilized muscle fibers from congenitally-clefted goat palates. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. 45, 113-120 (2008).
  33. Macpherson, P. C., Dennis, R. G., Faulkner, J. A. Sarcomere dynamics and contraction-induced injury to maximally activated single muscle fibres from soleus muscles of rats. The Journal of Physiology. 500, (Pt 2), 523-533 (1997).
  34. Koch, K. H., Grzonka, M. A., Koch, J. The pathology of the velopharyngeal musculature in cleft palates). Annals of Anatomy. 181, 123-126 (1999).
  35. Fara, M., Dvorak, J. Abnormal anatomy of the muscles of palatopharyngeal closure in cleft palates: anatomical and surgical considerations based on the autopsies of 18 unoperated cleft palates. Plastic and Reconstructive Surgery. 46, 488-497 (1970).
  36. Carvajal Monroy, P. L., Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Wagener, F. A., Von den Hoff, J. W. Strategies to Improve Regeneration of the Soft Palate Muscles After Cleft Palate Repair. Tissue Engineering. Part B, Reviews. (2012).
  37. Grefte, S., Kuijpers, M. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Myogenic capacity of muscle progenitor cells from head and limb muscles. European Journal of Oral Sciences. 120, 38-45 (2012).
  38. Grefte, S., Vullinghs, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Torensma, R., Von den Hoff, J. W. Matrigel but not collagen I, maintains the differentiation capacity of muscle derived cells in vitro. Biomedical Materials. 7, 055004 (2012).
  39. Kastner, S., Elias, M. C., Rivera, A. J., Yablonka-Reuveni, Z. Gene expression patterns of the fibroblast growth factors and their receptors during myogenesis of rat satellite cells. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 48, 1079-1096 (2000).
  40. Yablonka-Reuveni, Z., Quinn, L. S., Nameroff, M. Isolation and clonal analysis of satellite cells from chicken pectoralis muscle. Developmental Biology. 119, 252-259 (1987).
  41. Sherwood, R. I., et al. Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle. Cell. 119, 543-554 (2004).
  42. Gilbert, P. M., et al. Substrate elasticity regulates skeletal muscle stem cell self-renewal in culture. Science. 329, 1078-1081 (2010).
  43. Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. Isolation culture, and transplantation of muscle satellite cells. Journal of Visualized Experiments. (2014).
  44. Sciote, J. J., Horton, M. J., Rowlerson, A. M., Link, J. Specialized cranial muscles: how different are they from limb and abdominal muscles. Cells, Tissues, Organs. 174, 73-86 (2003).
  45. Rowlerson, A., Mascarello, F., Veggetti, A., Carpene, E. The fibre-type composition of the first branchial arch muscles in Carnivora and Primates. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 4, 443-472 (1983).
  46. Muller, J., et al. Comparative evolution of muscular dystrophy in diaphragm, gastrocnemius and masseter muscles from old male mdx mice. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 22, 133-139 (2001).
  47. Feldman, J. L., Stockdale, F. E. Skeletal muscle satellite cell diversity: satellite cells form fibers of different types in cell culture. Developmental Biology. 143, 320-334 (1991).
  48. Schmalbruch, H., Hellhammer, U. The number of nuclei in adult rat muscles with special reference to satellite cells. The Anatomical Record. 189, 169-175 (1977).
  49. Gibson, M. C., Schultz, E. The distribution of satellite cells and their relationship to specific fiber types in soleus and extensor digitorum longus muscles. The Anatomical Record. 202, 329-337 (1982).
  50. Carvajal Monroy, P. L., et al. A rat model for muscle regeneration in the soft palate. PloS One. 8, e59193 (2013).

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Steps 2.5.3 and 2.5.4 were updated from:

2.5.3. Look for the trachea and the esophagus that runs behind it. Lift the esophagus, and expose the pharynx, larynx and the soft palate.
2.5.4. Localize the area of the soft palate where the levator veli palatini is inserted and cut it loose (Figure 4B).

to

2.5.3. Look for the trachea and the esophagus that runs behind it. Lift the esophagus, and expose the pharynx and the larynx.
2.5.4 Localize and dissect the area of the superior pharyngeal constrictor muscle. Identify the levator veli palatini and cut it at both sides (Figure 4B).

Figure 4 and its legend were updated from:


Figure 4: Dissection of the levator veli palatini muscle. (A) General view after dissection of the digastric muscle (posterior belly). Stylohyoid muscle (St) and tendon of the levator veli palatini can be localized. Note the trachea (T) and esophagus (Es) running behind it. (B) After lifting the trachea and the esophagus the pharynx (P) is exposed. The insertion of the levator veli palatini into the soft palate is now visible. The arrow indicates the dissected soft palate with the levator veli palatini muscles at both sides. E: ear, St: stylohyoid muscle, VII: facial nerve, M: masseter muscle, AD: anterior belly digastric muscle, PD: posterior belly digastric muscle, T: trachea, Es: esophagus, P: Pharynx, *levator veli palatini muscle.

to


Figure 4: Dissection of the levator veli palatini muscle. (A) General view after dissection of the digastric muscle (posterior belly). Stylohyoid muscle (St) and tendon of the levator veli palatini can be localized. Note the trachea (T) and esophagus (Es) running behind it. (B) After lifting the trachea and the esophagus the pharynx (P) is exposed. The levator veli palatini that runs laterally towards the soft palate is now visible. The arrow indicates the dissected superior pharyngeal constrictor muscle; note the levator veli palatini muscles at both sides. E: ear, St: stylohyoid muscle, VII: facial nerve, M: masseter muscle, AD: anterior belly digastric muscle, PD: posterior belly digastric muscle, T: trachea, Es: esophagus, P: Pharynx, *levator veli palatini muscle.

Isolering og karakterisering af satellit-celler fra rotte Hoved Branchiomeric Muskler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvajal Monroy, P. L., Yablonka-Reuveni, Z., Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. J. Vis. Exp. (101), e52802, doi:10.3791/52802 (2015).More

Carvajal Monroy, P. L., Yablonka-Reuveni, Z., Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. J. Vis. Exp. (101), e52802, doi:10.3791/52802 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter