This protocol describes the isolation of satellite cells from branchiomeric head muscles of a 9 week-old rat. The muscles originate from different branchial arches. Subsequently, the satellite cells are cultured on a spot coating of millimeter size to study their differentiation. This approach avoids the expansion and passaging of satellite cells.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
על 1: 500 עד 1: 1000 תינוקות תערוכה שסועים מעורבים השפה ו / או חיך (CLP); כך זה מום המולד הנפוץ ביותר בבני האדם 1. השרירים של החיך הרך הם קריטיים לתפקודו של החיך הרך בדיבור, בליעה, ומציצה. אם שסוע של החיך הרך הוא הווה, שרירים אלה מוכנסים באופן חריג לקצה האחורי של עצם החיך.
החיך הרך נע מעלה ומטה במהלך נאום, מניעת אוויר לברוח דרך האף. ילדים עם שסע בחיך אין לי פונקצית שליטה זו וכתוצאה מכך תופעה הידועה בתפקוד velopharyngeal 2,3. למרות שפרוטוקולי הטיפול משתנים, התיקון ניתוחי של החיך הרך מתרחש בילדות המוקדמת (6-36 חודשים של גיל) 4. השרירים מוכנסים באופן חריג של החיך הרך ניתן לתקן בניתוח 5-7, לעומת זאת, תפקוד לקוי של velopharyngeal נמשך ב -7% עד 30%של החולים 2,3,8-10.
יכולתו של שריר שלד להתחדש דרך הפעולה של תאי לווין (SCS) היא מבוססת היטב 11,12. על פגיעה בשרירים, מאמנים מופעלים ולעבור לאתר של פציעה. לאחר מכן הם מתרבים, להבדיל, ולמזג ליצירת myofibers החדש או אלה תיקון פגום 13. מאמנים רגיעה להביע גורם שעתוק Pax7 14,15, בעוד צאצאיהם, myoblasts מתרבים, גם להביע גורם myogenic נחישות 1 (Myod) 16. myoblasts ההבחנה להתחיל להביע myogenin (MyoG) 17. בידול המסוף של myoblasts מסומן על ידי ההיווצרות של myofibers, והביטוי של חלבוני שריר ספציפי כגון שרשרת שרירן כבדה (MyHC) 16,18.
לאחרונה, מספר אסטרטגיות כבר בשימוש ברפואת רגנרטיבית לשפר התחדשות שריר של שרירי גפיים 19-23. מחקרים ספציפיים עלשרירי ראש branchiomeric חשובים גם משום שהוא הוכיח לאחרונה כי הם שונים משרירים אחרים בכמה היבטים 24. בניגוד לשרירי גפיים, זה כבר הציע שרירי ראש branchiomeric מכילים פחות SCS 25, להתחדש איטי יותר, ורקמת חיבור סיבית יותר נוצר לאחר פציעת 26 בנוסף, מתרבות מאמנים משרירי ראש branchiomeric גם להביע את גורמי שעתוק אחרים. לדוגמא, Tcf21, גורם שעתוק לבניית שריר craniofacial בחום לידי ביטוי בהתחדשות שרירי ראש אבל לא בהתחדשות שרירי גפיים 25. השרירים בחיך הרך של חולי CLP הם בדרך כלל קטנים ומאורגן היטב פחות בהשוואה לשרירי חיך רגיל 27,28. סיבים איטיים ומהירים גם נמצאים בשרירי החיך הרכים אבל הסיבים איטיים הם שופעים יותר. לעומת זאת, שרירים שסועים מכילים שיעור גבוה יותר של סיבים מהירים וגם אספקת נימים מופחתתלעומת שרירי חיך רכים נורמלים 29-31. סיבים מהיר נוטים יותר לפגיעה הנגרמת על-התכווצות 31-33. אספקת נימי עניים הנלווית עשויה גם לקדם סיסטיק 34,35. כל ההיבטים הללו עשויים לתרום לעניי ההתחדשות של שרירי חיך רכים לאחר סגירה שסועה כירורגית 36. לאור זאת, פרוטוקול לבידוד והאפיון של שריר ראש branchiomeric SCS הוא חיוני. זה מספק את האפשרות ללמוד ביולוגיה SC של שרירי ראש branchiomeric. בנוסף, ניתן לפתח טיפולים חדשים המבוססים על הנדסת רקמות לקידום התחדשות שריר לאחר הניתוח בCLP ותנאים אחרים להתפשר אזור craniofacial.
באופן כללי, ניתן לקבל SCS לאחר הניתוק של רקמת שריר 14. ממינסינג, עיכול אנזימטי, וטחינה הדקה נדרשים בדרך כלל כדי לשחרר מאמנים מהנישה שלהם. יכול להיות מטוהר SCS ידי מראש ציפוי על מנות ללא ציפוי 14,37,38, fractionation על Percoll 39,40, תא או ניאון או מגנטי מיון 41-43. כאן אנו מציגים פרוטוקול כלכלי ומהיר חדש לבידוד של תאי לווין משרירי ראש branchiomeric של חולדות מבוגרות צעירות. פרוטוקול זה מבוסס על כתב יד קודמת 14 ומותאם ספציפית לדגימות רקמה קטנות. הבידוד של מאמנים משרירי נציג מקורם -1, 2 nd, ו -4 קשתות branchial ה מתואר. לאחר בידוד, מספרים נמוכים של תאי לווין בתרבית על כתמי ג'ל מטריקס בגודל מילימטר ללמוד הבידול שלהם. גישה זו תמנע את הדרישה להרחבה וpassaging של מאמנים.
SCs from different branchiomeric head muscles were isolated from one 9-week-old Wistar rat and cultured directly on extracellular matrix gel spots without prior expansion and passaging. After isolation, the cells were counted and seeded at the same cell density. For the parallel isolation of three different muscles, this method takes about 4 hr. To avoid culture contamination, a critical step is the rapid washing in alcohol 70% after dissection of the muscles.
During SC isolation it is important to cut the muscle tissue into small pieces (about 2 mm) but avoid too much mincing as this will result in a small cell yield because of cell damage. Also, the duration of the enzymatic digestion must be checked carefully under the microscope to avoid further damage. The aim of the digestion is to dissociate the myofibers. Since more than 90% of the isolated cells express Pax7, no further purification is required (Figures 6-8). This avoids extra purification steps in other methods such as pre-plating on uncoated dishes14,37,38, fractionation on Percoll39,40, or fluorescent- or magnetic cell sorting41,43. For trituration it is essential to induce shear between the tissue fragments and the opening of the pipette tip as this allows the mechanical release of the SCs. If the trituration with a 10 ml pipette (inside diameter tip: 1 mm) is difficult, a 5 ml (inside diameter tip: 2 mm) pipette can be used first. Alternatively, glass Pasteur pipettes can be cut at the desired diameter and be used. This method is simple, efficient and allows the simultaneous isolation of SC from different muscle samples.
The culture plates for SCs can also be coated with gelatin or collagen, but our previous studies show that extracellular matrix gel is far better for the maintenance of the myogenic potential than collagen38. The extracellular matrix gel spots of millimeter size (10 µl/Ø 2 mm or 20 µl/Ø 4 mm) allows the study of proliferation and differentiation of SCs with limited numbers of cells. For the differentiation assay about 8 to 20 times fewer cells are required compared to a 24-well plate (Ø 15.6 mm), and about 80 to 200 times fewer compared to 35 mm Petri dishes (Ø 35 mm)14,38.
Since extracellular matrix gel is expensive, this method is also more cost-efficient. In addition, the chamber slides can be replaced by plastic cover slips to further reduce the costs. For the preparation of the extracellular matrix gel spots overnight drying of the chamber slides is essential. As the extracellular matrix gel spots are transparent, it is necessary to mark the spots at the bottom side using back lighting. The chambers slides are fixed in a Petri dish for easy manipulation. Further cell culture expansion is not necessary, which offers the possibility to study the SCs of smaller muscles or small muscle samples. Alternatively, e.g. for PCR or muscle constructs if more cells are needed, the freshly isolated SCs can first be expanded in T75 flasks as indicated above.
SCs isolated using this protocol are not suitable for further purification with flow cytometry immediately after isolation. The digestion with pronase causes extensive digestion of the surface antigens14. Horse serum and fetal bovine serum that are used for cell culture must first be properly characterized before isolation, as different lot numbers differentially affected myoblasts proliferation and differentiation.
In recent years, there is a growing interest in the muscles derived from the branchial arches and the head mesoderm (e.g. the extraocular muscles)24. It has been clearly demonstrated that head and limb muscles possess highly different properties. Masseter muscle from old animals seems to retain their regenerative capacity in comparison with limb muscles25,26. SCs from the extraocular muscles possess a robust proliferation and differentiation capacity comparable to SCs from head muscles, and show a larger engraftment potential than limb muscle SCs24.
The fiber type distribution and myosin composition varies among muscle groups and also between species. Muscles originating from the first branchial arch in humans contain both slow and fast fibers (subtypes IIA and IIX), neonatal myosins and myosins typical for developing cardiac muscle. In rodents these muscles contain about 95% fast fibers myosin IIA and IIb)44-46. Studies on avian muscles show that SCs from different muscle fiber types vary in differentiation capacity. SCs from fast fibers only differentiate into fast muscle fibers, while SCs from slow fibers can differentiate into both fiber types47. In addition, the percentage of SCs in fast muscle fibers is lower than in slow muscle fibers48,49. This indicates that the fiber type distribution must be taken into account for studies on muscles in the craniofacial area. Similar to cleft palate muscles, the LVP in rodents contains almost exclusively fast fibers50. For that reason, SCs from the LVP are suitable for pre-clinical studies in the field of cleft palate.
This protocol offers new possibilities to study SCs derived from branchiomeric head muscles or other smaller muscles or smaller muscles samples. This will facilitate the development of new therapies to improve the regeneration of muscles in the maxillofacial area in conditions such as cleft palate but also in other conditions affecting smaller muscles.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |