इस प्रोटोकॉल एक 9 सप्ताह पुरानी चूहे के branchiomeric सिर मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन है। मांसपेशियों को अलग गिल मेहराब से उत्पन्न। बाद में, उपग्रह कोशिकाओं उनके भेदभाव का अध्ययन करने के लिए मिलीमीटर आकार का एक स्थान कोटिंग पर संवर्धित कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण उपग्रह कोशिकाओं के विस्तार और passaging से बचा जाता है।
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
के बारे में 1: 500 1: 1,000 नवजात शिशुओं होंठ और / या तालु (सीएलपी) से जुड़े एक फांक का प्रदर्शन; इस प्रकार यह मनुष्य 1 में सबसे आम जन्मजात विकृति है। कोमल तालू की मांसपेशियों भाषण, निगल, और चूसने के दौरान कोमल तालू के कामकाज के लिए महत्वपूर्ण हैं। कोमल तालू की एक फांक मौजूद है, तो इन मांसपेशियों को असामान्य रूप से तालु हड्डी के पीछे अंत में डाला जाता है।
कोमल तालू नाक के माध्यम से बचने के लिए हवा को रोकने के भाषण के दौरान ऊपर और नीचे ले जाता है। तालू में एक फांक साथ बच्चे velopharyngeal शिथिलता 2,3 के रूप में जाना जाता घटना में जिसके परिणामस्वरूप इस पर नियंत्रण समारोह में नहीं है। उपचार प्रोटोकॉल चर रहे हैं, कोमल तालू की शल्य चिकित्सा की मरम्मत बचपन (उम्र के 6-36 महीने) 4 में जगह लेता है। कोमल तालू का असामान्य रूप से डाला मांसपेशियों को शल्य चिकित्सा द्वारा 5-7 सुधारा जा सकता है, हालांकि, velopharyngeal शिथिलता 30% करने के लिए 7% में बनी रहती हैरोगियों 2,3,8-10 की।
उपग्रह कोशिकाओं (अनुसूचित जाति) की क्रिया के माध्यम से पुनर्जीवित करने के लिए कंकाल की मांसपेशी की क्षमता अच्छी तरह से 11,12 स्थापित है। मांसपेशी की चोट पर, अनुसूचित जातियों सक्रिय कर रहे हैं और चोट के स्थल की ओर पलायन। वे तो पैदा अंतर है, और नया myofibers या मरम्मत क्षतिग्रस्त लोगों में 13 के लिए फार्म का फ्यूज। उनकी संतान, proliferating myoblasts, साथ ही myogenic दृढ़ संकल्प कारक 1 (MyoD) 16 व्यक्त करते हुए मौन अनुसूचित जातियों, प्रतिलेखन कारक Pax7 14,15 व्यक्त करते हैं। फर्क myoblasts 17 (MyoG) myogenin व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं। myoblasts के टर्मिनल भेदभाव myofibers के गठन, और इस तरह मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) 16,18 के रूप में मांसपेशियों-विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है।
हाल ही में, कई रणनीतियों अंग की मांसपेशियों 19-23 की पेशी उत्थान में सुधार करने के लिए पुनर्योजी चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया है। पर विशिष्ट अध्ययनयह हाल ही में वे कई पहलुओं को 24 में अन्य मांसपेशियों से अलग प्रदर्शन किया गया क्योंकि branchiomeric सिर की मांसपेशियों को भी महत्वपूर्ण हैं। अंग की मांसपेशियों के साथ इसके विपरीत, यह branchiomeric सिर मांसपेशियों, कम अनुसूचित जातियों के 25 होते धीमी पुनर्जन्म, और अधिक रेशेदार संयोजी ऊतक भी अन्य प्रतिलेखन कारक व्यक्त branchiomeric सिर मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों proliferating, इसके अलावा चोट 26 के बाद का गठन किया गया है जो सुझाव दिया गया है। उदाहरण के लिए, Tcf21, craniofacial पेशी गठन के लिए एक प्रतिलेखन कारक दृढ़ता से सिर की मांसपेशियों regenerating में है, लेकिन शायद ही अंग की मांसपेशियों 25 regenerating में व्यक्त किया है। सीएलपी मरीजों की कोमल तालू में मांसपेशियों को आम तौर पर छोटे और कम सामान्य तालु की मांसपेशियों 27,28 की तुलना में अच्छी तरह का आयोजन कर रहे हैं। धीमी और तेज तंतुओं दोनों कोमल तालू की मांसपेशियों में मौजूद हैं, लेकिन धीमी गति से तंतुओं अधिक प्रचुर मात्रा में हैं। इसके विपरीत, फांक की मांसपेशियों को भी एक उच्च तेजी से फाइबर के अनुपात और एक कम केशिका आपूर्ति होते हैंसामान्य कोमल तालू की मांसपेशियों को 29-31 के साथ तुलना में। फास्ट तंतुओं संकुचन प्रेरित चोट 31-33 से ग्रस्त हैं। साथ गरीब केशिका आपूर्ति भी फाइब्रोसिस 34,35 को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। इन सभी पहलुओं को शल्य फांक बंद होने के 36 के बाद कोमल तालू की मांसपेशियों के गरीब उत्थान के लिए योगदान कर सकते हैं। इसे देखते हुए, branchiomeric सिर पेशी अनुसूचित जातियों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है। इस branchiomeric सिर की मांसपेशियों के अनुसूचित जाति के जीव विज्ञान का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अलावा, ऊतक इंजीनियरिंग के आधार पर नए उपचारों सीएलपी और craniofacial क्षेत्र में कोई समझौता अन्य स्थितियों में सर्जरी के बाद मांसपेशियों की पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए विकसित किया जा सकता है।
सामान्य तौर पर, अनुसूचित जातियों मांसपेशियों के ऊतकों को 14 वर्ष की हदबंदी के बाद प्राप्त किया जा सकता है। क़ीमा बनाने, enzymatic पाचन, और विचूर्णन आम तौर पर अपनी जगह से अनुसूचित जातियों जारी करने के लिए आवश्यक हैं। अनुसूचित जातियों FR, uncoated व्यंजन 14,37,38 पर पूर्व चढ़ाना द्वारा शुद्ध किया जा सकता हैactionation Percoll 39,40 पर, fluorescent- या चुंबकीय या सेल 41-43 छँटाई। यहाँ हम युवा वयस्क चूहों के branchiomeric सिर मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक नई आर्थिक और तेजी प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल पिछले एक पांडुलिपि 14 और विशेष रूप से छोटे ऊतकों के नमूनों के लिए अनुकूलित पर आधारित है। 1 सेंट, 2 एन डी, और 4 वें गिल मेहराब से होने वाले प्रतिनिधि मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के अलगाव वर्णित हैं। अलगाव के बाद, उपग्रह कोशिकाओं की कम संख्या उनके भेदभाव का अध्ययन करने के लिए मिलीमीटर आकार का बाह्य मैट्रिक्स जेल स्थानों पर संवर्धित कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण अनुसूचित जातियों के विस्तार और passaging के लिए आवश्यकता से बचा जाता है।
अलग branchiomeric सिर मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के पूर्व विस्तार और passaging के बिना एक 9 सप्ताह पुरानी Wistar चूहा और बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉट पर सीधे सुसंस्कृत से अलग थे। अलगाव के बाद, कोशिकाओं गिना रहे थे और एक ही सेल घनत्व पर वरीयता प्राप्त। तीन अलग अलग मांसपेशियों के समानांतर अलगाव के लिए, इस विधि के बारे में 4 घंटे लगते हैं। संस्कृति संक्रमण से बचने के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम की मांसपेशियों के विच्छेदन के बाद शराब के 70% में तेजी से धोने है।
अनुसूचित जाति के अलगाव के दौरान यह छोटे टुकड़ों में मांसपेशियों के ऊतकों (लगभग 2 मिमी) में कटौती, लेकिन इस वजह से कोशिका क्षति के एक छोटे से सेल उपज में परिणाम देगा के रूप में बहुत ज्यादा क़ीमा बनाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, enzymatic पाचन की अवधि को और अधिक नुकसान से बचने के लिए खुर्दबीन के नीचे ध्यान से जाँच की जानी चाहिए। पाचन के उद्देश्य myofibers अलग कर देना है। अलग कक्षों की 90% से अधिक Pax7 व्यक्त बाद, आगे नहीं शुद्धि (आंकड़े 6-8) की आवश्यकता है।यह एक ऐसी Percoll 39,40 पर uncoated व्यंजन 14,37,38 पर पूर्व चढ़ाना, विभाजन के रूप में अन्य तरीकों में अतिरिक्त शुद्धि चरणों से बचा जाता है, fluorescent- या चुंबकीय या सेल 41,43 छँटाई। विचूर्णन के लिए यह इस अनुसूचित जातियों के यांत्रिक रिहाई की अनुमति देता है के रूप में ऊतक टुकड़े और विंदुक टिप के उद्घाटन के बीच कतरनी प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। (व्यास टिप के अंदर: 1 मिमी) एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ विचूर्णन तो मुश्किल है, (व्यास टिप के अंदर: 2 मिमी) एक 5 एमएल पिपेट पहली बार उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कांच पाश्चर pipettes वांछित व्यास में कटौती की जा सकती है और इस्तेमाल किया जाएगा। इस विधि, कुशल सरल है और विभिन्न मांसपेशियों के नमूनों से अनुसूचित जाति के एक साथ अलगाव की अनुमति देता है।
अनुसूचित जातियों के लिए संस्कृति प्लेटें भी जिलेटिन या कोलेजन के साथ लेपित किया जा सकता है, लेकिन हमारे पिछले अध्ययनों बाह्य मैट्रिक्स जेल कोलेजन 38 से अधिक myogenic क्षमता के रखरखाव के लिए कहीं बेहतर है कि पता चलता है। के बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉटमिलीमीटर आकार (10 μl / ओ 2 मिमी या 20 μl / O 4 मिमी) प्रसार और कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ अनुसूचित जाति के भेदभाव के अध्ययन की अनुमति देता है। भेदभाव परख के लिए करीब 8 से 20 गुना कम कोशिकाओं 24 अच्छी तरह से थाली (हे 15.6 मिमी) की तुलना में आवश्यक हैं, और कम के बारे में 80-200 बार 35 मिमी पेट्री डिश (ओ 35 मिमी) 14,38 की तुलना में।
बाह्य मैट्रिक्स जेल महंगा है, इसलिए इस विधि भी अधिक लागत प्रभावी है। इसके अलावा, चैम्बर स्लाइड्स प्लास्टिक कवर से बदला जा सकता है और आगे की लागत को कम करने के लिए निकल जाता है। बाह्य मैट्रिक्स जेल की तैयारी के लिए चैम्बर स्लाइड्स के रातोंरात सुखाने के लिए आवश्यक है स्पॉट। बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉट पारदर्शी हो रहे हैं, यह प्रकाश पीठ का उपयोग कर नीचे की ओर पर स्पॉट चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। कक्षों स्लाइड आसान हेरफेर के लिए एक पेट्री डिश में तय कर रहे हैं। इसके अलावा सेल संस्कृति के विस्तार smal की अनुसूचित जातियों अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है, जो जरूरी नहीं हैमांसपेशियों या छोटे पेशी के नमूने ler। वैकल्पिक रूप से, पीसीआर या पेशी के लिए जैसे अधिक कोशिकाओं की जरूरत है अगर ऊपर संकेत के रूप में, हौसले से अलग जातियों पहले T75 बोतल में विस्तार किया जा सकता निर्माण करती है।
अनुसूचित जातियों इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलगाव के बाद तुरंत फ्लो के साथ आगे की शुद्धि के लिए उपयुक्त नहीं हैं अलग। pronase साथ पाचन सतह का व्यापक पाचन 14 प्रतिजन का कारण बनता है। अलग बहुत संख्या विभिन्न myoblasts प्रसार और भेदभाव प्रभावित के रूप में सेल संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है कि घोड़े सीरम और भ्रूण गोजातीय सीरम पहले ठीक से अलगाव से पहले की विशेषता किया जाना चाहिए।
हाल के वर्षों में, गिल मेहराब और सिर mesoderm (जैसे दृष्टितर मांसपेशियों) 24 से निकाली गई मांसपेशियों में दिलचस्पी बढ़ रही है। यह स्पष्ट रूप से सिर और अंग की मांसपेशियों अत्यधिक विभिन्न गुणों के अधिकारी को प्रदर्शित किया गया है। पुराने जानवरों से masseter मांसपेशियों को फिर से करने लगता हैअंग की मांसपेशियों 25,26 के साथ तुलना में उनके पुनर्योजी क्षमता टाइन। दृष्टितर मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के सिर की मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के लिए तुलनीय एक मजबूत प्रसार और भेदभाव क्षमता के अधिकारी, और अंग पेशी अनुसूचित जातियों के 24 की तुलना में एक बड़ा engraftment क्षमता दिखाने।
फाइबर प्रकार वितरण और मायोसिन रचना मांसपेशी समूहों के बीच और भी प्रजातियों के बीच होती है। मनुष्यों में पहली गिल चाप से होने वाले स्नायु हृदय की मांसपेशियों के विकास के लिए विशिष्ट धीमी और तेज दोनों फाइबर (उपप्रकार आईआईए और IIx), नवजात myosins और myosins होते हैं। कृन्तकों में इन मांसपेशियों के बारे में 95% तेजी से तंतुओं मायोसिन आईआईए और IIb) 44-46 होते हैं। एवियन मांसपेशियों पर अध्ययन अलग मांसपेशी फाइबर प्रकार से अनुसूचित जाति भेदभाव क्षमता में भिन्न है कि दिखा। धीमी गति से फाइबर से अनुसूचित जातियों दोनों फाइबर प्रकार 47 में अंतर कर सकते हैं, जबकि तेजी से फाइबर से अनुसूचित जातियों ही, तेजी से मांसपेशी फाइबर में अंतर है। इसके अलावा, तेजी से मांसपेशियों में अनुसूचित जातियों का प्रतिशततंतुओं धीमी गति से मांसपेशी फाइबर 48,49 की तुलना में कम है। यह फाइबर प्रकार वितरण craniofacial क्षेत्र में मांसपेशियों पर अध्ययन के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इंगित करता है। फांक तालु की मांसपेशियों के लिए भी इसी तरह, कृन्तकों में LVP तेजी से तंतुओं 50 लगभग विशेष रूप से शामिल हैं। कारण है कि, LVP से अनुसूचित जातियों फांक तालु के क्षेत्र में पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं।
इस प्रोटोकॉल branchiomeric सिर मांसपेशियों या अन्य छोटे मांसपेशियों या छोटे मांसपेशियों के नमूनों से व्युत्पन्न अनुसूचित जातियों का अध्ययन करने के लिए नई संभावनाओं प्रदान करता है। यह एक ऐसी फांक तालु के रूप में बल्कि छोटे मांसपेशियों को प्रभावित करने वाले अन्य स्थितियों में स्थितियों में मैक्सिलोफेशियल क्षेत्र में मांसपेशियों के उत्थान में सुधार करने के लिए नए उपचारों के विकास की सुविधा होगी।
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |