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Developmental Biology

चूहा हेड Branchiomeric मांसपेशियों से अलगाव और उपग्रह कोशिकाओं की विशेषता

doi: 10.3791/52802 Published: July 20, 2015

ERRATUM NOTICE

Summary

इस प्रोटोकॉल एक 9 सप्ताह पुरानी चूहे के branchiomeric सिर मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव का वर्णन है। मांसपेशियों को अलग गिल मेहराब से उत्पन्न। बाद में, उपग्रह कोशिकाओं उनके भेदभाव का अध्ययन करने के लिए मिलीमीटर आकार का एक स्थान कोटिंग पर संवर्धित कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण उपग्रह कोशिकाओं के विस्तार और passaging से बचा जाता है।

Introduction

के बारे में 1: 500 1: 1,000 नवजात शिशुओं होंठ और / या तालु (सीएलपी) से जुड़े एक फांक का प्रदर्शन; इस प्रकार यह मनुष्य 1 में सबसे आम जन्मजात विकृति है। कोमल तालू की मांसपेशियों भाषण, निगल, और चूसने के दौरान कोमल तालू के कामकाज के लिए महत्वपूर्ण हैं। कोमल तालू की एक फांक मौजूद है, तो इन मांसपेशियों को असामान्य रूप से तालु हड्डी के पीछे अंत में डाला जाता है।

कोमल तालू नाक के माध्यम से बचने के लिए हवा को रोकने के भाषण के दौरान ऊपर और नीचे ले जाता है। तालू में एक फांक साथ बच्चे velopharyngeal शिथिलता 2,3 के रूप में जाना जाता घटना में जिसके परिणामस्वरूप इस पर नियंत्रण समारोह में नहीं है। उपचार प्रोटोकॉल चर रहे हैं, कोमल तालू की शल्य चिकित्सा की मरम्मत बचपन (उम्र के 6-36 महीने) 4 में जगह लेता है। कोमल तालू का असामान्य रूप से डाला मांसपेशियों को शल्य चिकित्सा द्वारा 5-7 सुधारा जा सकता है, हालांकि, velopharyngeal शिथिलता 30% करने के लिए 7% में बनी रहती हैरोगियों 2,3,8-10 की।

उपग्रह कोशिकाओं (अनुसूचित जाति) की क्रिया के माध्यम से पुनर्जीवित करने के लिए कंकाल की मांसपेशी की क्षमता अच्छी तरह से 11,12 स्थापित है। मांसपेशी की चोट पर, अनुसूचित जातियों सक्रिय कर रहे हैं और चोट के स्थल की ओर पलायन। वे तो पैदा अंतर है, और नया myofibers या मरम्मत क्षतिग्रस्त लोगों में 13 के लिए फार्म का फ्यूज। उनकी संतान, proliferating myoblasts, साथ ही myogenic दृढ़ संकल्प कारक 1 (MyoD) 16 व्यक्त करते हुए मौन अनुसूचित जातियों, प्रतिलेखन कारक Pax7 14,15 व्यक्त करते हैं। फर्क myoblasts 17 (MyoG) myogenin व्यक्त करने के लिए शुरू करते हैं। myoblasts के टर्मिनल भेदभाव myofibers के गठन, और इस तरह मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) 16,18 के रूप में मांसपेशियों-विशिष्ट प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित है।

हाल ही में, कई रणनीतियों अंग की मांसपेशियों 19-23 की पेशी उत्थान में सुधार करने के लिए पुनर्योजी चिकित्सा में इस्तेमाल किया गया है। पर विशिष्ट अध्ययनयह हाल ही में वे कई पहलुओं को 24 में अन्य मांसपेशियों से अलग प्रदर्शन किया गया क्योंकि branchiomeric सिर की मांसपेशियों को भी महत्वपूर्ण हैं। अंग की मांसपेशियों के साथ इसके विपरीत, यह branchiomeric सिर मांसपेशियों, कम अनुसूचित जातियों के 25 होते धीमी पुनर्जन्म, और अधिक रेशेदार संयोजी ऊतक भी अन्य प्रतिलेखन कारक व्यक्त branchiomeric सिर मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों proliferating, इसके अलावा चोट 26 के बाद का गठन किया गया है जो सुझाव दिया गया है। उदाहरण के लिए, Tcf21, craniofacial पेशी गठन के लिए एक प्रतिलेखन कारक दृढ़ता से सिर की मांसपेशियों regenerating में है, लेकिन शायद ही अंग की मांसपेशियों 25 regenerating में व्यक्त किया है। सीएलपी मरीजों की कोमल तालू में मांसपेशियों को आम तौर पर छोटे और कम सामान्य तालु की मांसपेशियों 27,28 की तुलना में अच्छी तरह का आयोजन कर रहे हैं। धीमी और तेज तंतुओं दोनों कोमल तालू की मांसपेशियों में मौजूद हैं, लेकिन धीमी गति से तंतुओं अधिक प्रचुर मात्रा में हैं। इसके विपरीत, फांक की मांसपेशियों को भी एक उच्च तेजी से फाइबर के अनुपात और एक कम केशिका आपूर्ति होते हैंसामान्य कोमल तालू की मांसपेशियों को 29-31 के साथ तुलना में। फास्ट तंतुओं संकुचन प्रेरित चोट 31-33 से ग्रस्त हैं। साथ गरीब केशिका आपूर्ति भी फाइब्रोसिस 34,35 को बढ़ावा देने के कर सकते हैं। इन सभी पहलुओं को शल्य फांक बंद होने के 36 के बाद कोमल तालू की मांसपेशियों के गरीब उत्थान के लिए योगदान कर सकते हैं। इसे देखते हुए, branchiomeric सिर पेशी अनुसूचित जातियों के अलगाव और लक्षण वर्णन के लिए एक प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है। इस branchiomeric सिर की मांसपेशियों के अनुसूचित जाति के जीव विज्ञान का अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अलावा, ऊतक इंजीनियरिंग के आधार पर नए उपचारों सीएलपी और craniofacial क्षेत्र में कोई समझौता अन्य स्थितियों में सर्जरी के बाद मांसपेशियों की पुनर्जनन को बढ़ावा देने के लिए विकसित किया जा सकता है।

सामान्य तौर पर, अनुसूचित जातियों मांसपेशियों के ऊतकों को 14 वर्ष की हदबंदी के बाद प्राप्त किया जा सकता है। क़ीमा बनाने, enzymatic पाचन, और विचूर्णन आम तौर पर अपनी जगह से अनुसूचित जातियों जारी करने के लिए आवश्यक हैं। अनुसूचित जातियों FR, uncoated व्यंजन 14,37,38 पर पूर्व चढ़ाना द्वारा शुद्ध किया जा सकता हैactionation Percoll 39,40 पर, fluorescent- या चुंबकीय या सेल 41-43 छँटाई। यहाँ हम युवा वयस्क चूहों के branchiomeric सिर मांसपेशियों से उपग्रह कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक नई आर्थिक और तेजी प्रोटोकॉल उपस्थित थे। इस प्रोटोकॉल पिछले एक पांडुलिपि 14 और विशेष रूप से छोटे ऊतकों के नमूनों के लिए अनुकूलित पर आधारित है। 1 सेंट, 2 एन डी, और 4 वें गिल मेहराब से होने वाले प्रतिनिधि मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के अलगाव वर्णित हैं। अलगाव के बाद, उपग्रह कोशिकाओं की कम संख्या उनके भेदभाव का अध्ययन करने के लिए मिलीमीटर आकार का बाह्य मैट्रिक्स जेल स्थानों पर संवर्धित कर रहे हैं। यह दृष्टिकोण अनुसूचित जातियों के विस्तार और passaging के लिए आवश्यकता से बचा जाता है।

Protocol

इस के साथ साथ वर्णित सभी प्रयोगों डच कानूनों और नियमों (आरयू-Dec 2013-205) के अनुसार Radboud विश्वविद्यालय Nijmegen से पशु प्रयोगों के लिए स्थानीय बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. बाह्य मैट्रिक्स जेल बिताने के स्थान

  1. अलगाव से पहले निम्न चरणों का एक दिन प्रदर्शन:
    1. कम से कम 1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक विभाज्य बाह्य मैट्रिक्स जेल (100 μl) गला लें। Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम में 01:10 पतला; 4,500 मिलीग्राम / एल ग्लूकोज, 4 मिमी एल glutamine, और 110 मिलीग्राम / एमएल सोडियम पाइरूवेट (DMEM) के साथ। हर समय 4 डिग्री सेल्सियस पर बाह्य मैट्रिक्स जेल रखें। नोट: अचानक तापमान में परिवर्तन असमान कोटिंग और क्रिस्टल के गठन में परिणाम होगा।
    2. 15 मिनट के लिए बर्फ पर पतला बाह्य मैट्रिक्स जेल समाधान रखें।
    3. 10 मिनट के लिए एक 20 μl micropipette के प्री-ठंडा।
    4. एक 100 मिमी पेट्री डिश में 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड्स रखो और 10 मिनट के लिए एक ठंडी सतह (उदाहरण के लिए एक फ्रीजर पैक) पर पकवान हस्तांतरण।
    5. अच्छी तरह से प्रत्येक में 10 μl बाह्य मैट्रिक्स जेल की एक बूंद डाल करने के लिए पूर्व ठंडा micropipette का प्रयोग करें। कम से कम एक और 7 मिनट (चित्रा 1 ए) के लिए ठंड की सतह पर पेट्री डिश रखें।
    6. पूरी तरह से शेष बाह्य मैट्रिक्स जेल (चित्रा 1 बी) को हटाने, और रात में 37 डिग्री सेल्सियस पर कुओं सूखी।

2. विच्छेदन प्रमुख की मांसपेशियों (masseter, द्वितुंदी, और उन्नमनी वेली Palatini)

  1. विच्छेदन से पहले, फॉस्फेट बफर खारा 2% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ पूरक (पीबीएस) के 50 मिलीलीटर तैयार करते हैं। बर्फ पर रखें।
  2. सीओ 2 / ओ 2 के साथ एक युवा वयस्क चूहे (9 सप्ताह) के इच्छामृत्यु के बाद, सिर सिर काटना और सिर से त्वचा को हटा दें। ठंडा पीबीएस के लिए सिर स्थानांतरण एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 2% पी / एस के साथ पूरक।
  3. (1 गिल चाप से व्युत्पन्न) masseter पेशी
    1. एक सिलिकॉन पैड पर एक पक्ष के साथ सिर प्लेस और चमड़े के नीचे एन के साथ तयeedles (2A चित्रा)।
    2. कर्णमूल और चेहरे की नस (2A चित्रा) को पहचानें। ग्रंथि को कवर गहरी प्रावरणी बेनकाब। प्रावरणी कट और विच्छेदन कैंची का उपयोग ग्रंथि को हटा दें। बाहरी श्रवण नहर को पहचानें। Stylomastoid रंध्र से चेहरे की नस का पता लगाने और ध्यान से एक स्केलपेल ब्लेड नं 15 के साथ, अस्थायी गाल की हड्डी, और मुख शाखाओं को हटा दें।
    3. प्रावरणी को हटाने के द्वारा masseter पेशी के सतही सिर मुफ्त। Masseter पेशी के सतही और गहरे दोनों प्रमुखों को पहचानें। मैक्सिला की गाल की हड्डी प्रक्रिया में डाला इसकी मोटी मांसल aponeurosis तक सतही सिर ट्रेस।
    4. एक सीधे संदंश के साथ गाल की हड्डी प्रक्रिया में अपने मूल से कण्डरा अलग करें। एक स्केलपेल ब्लेड नं 15 या विच्छेदन कैंची और ध्यान से जीवन यह (चित्रा 2 बी) के साथ कटौती।
    5. इसके कोण पर प्रविष्टि और टी के अवर छमाही तक masseter की सतही सिर काटनावह एक स्केलपेल ब्लेड नंबर 15 (चित्रा -2) के साथ जबड़ा के Ramus की सतह पार्श्व। अब, पूरी तरह से मांसपेशियों को हटा दें।
  4. (2 एन डी गिल चाप से व्युत्पन्न) द्वितुंदी पेशी के पीछे पेट
    1. सिलिकॉन पैड पर एक लापरवाह स्थिति में सिर प्लेस और चमड़े के नीचे सुई (चित्रा 3) के साथ तय कर लो।
    2. मांसल और अवअधोहनुज ग्रंथियों दोनों overlying वसा निकालें। अगला, सतही प्रावरणी और विच्छेदन कैंची का उपयोग ग्रंथियों को हटा दें। द्वितुंदी पेशी (पूर्वकाल और कूल्हों पेट) बेनकाब।
    3. एक सीधे संदंश के साथ पीछे पेट के पूर्वकाल कण्डरा पकड़ो यह कटौती, और मध्य कर्ण Bulla (3B चित्रा) में अपने मूल जब तक इसे ध्यान से काटना। प्रतिपक्षी पक्ष में ही मत करो।
  5. (4 गिल चाप से व्युत्पन्न) उन्नमनी वेली palatini पेशी
    1. द्वितुंदी पेशी के पीछे पेट के विच्छेदन के बाद, पार्श्विक यह पुल, stylohyoid पेशी स्थानीय बनाना, और इसे ध्यान से (चित्रा -4 ए) को हटा दें।
    2. मध्य कर्ण Bulla (चित्रा -4 ए) में सम्मिलित करता है कि उन्नमनी वेली palatini का पट्टा स्थानीयकरण। इसे ध्यान से काटना और दोनों पक्षों पर यह कटौती।
    3. श्वासनली और इसके पीछे चलता है कि घेघा के लिए देखो। घेघा लिफ्ट, और ग्रसनी, गला और कोमल तालू को बेनकाब।
    4. उन्नमनी वेली palatini डाला जाता है, जहां कोमल तालू के क्षेत्र स्थानीय बनाना और यह ढीला (चित्रा 4 बी) में कटौती।
      नोट: सीधे विच्छेदन के बाद, ध्यान से स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत प्रत्येक पेशी से पट्टा और संयोजी ऊतक को हटा दें। इथेनॉल 70% में जल्दी से सभी नमूनों डूब, और ठंडा पीबीएस के लिए उन्हें स्थानांतरित एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 2% पी / एस पूरक।

उपग्रह कोशिकाओं 3. अलगाव

  1. मांसपेशियों के 3 समूहों से अनुसूचित जाति के अलगाव के लिए निम्नलिखित तैयारी चरणों का पालन:
    1. DMEM में 0.1% pronase के 7.5 मिलीलीटर तैयार करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान फ़िल्टर। अलगाव से पहले 10 मिनट के लिए एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर समाधान पूर्व गर्म।
    2. तैयार करें 10% हार्स सीरम (एचएस) और 1% पी / एस के साथ पूरक DMEM के 35 मिलीलीटर। इसके अलावा पूर्व गर्म 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में।
    3. 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 10% एच एस, 1% पी / एस और 1% चिकन भ्रूण निकालने (CEE) के साथ पूरक DMEM के होते हैं, जो 15 मिलीलीटर संस्कृति के माध्यम से तैयार करें। एक पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व गर्म।
    4. प्री-कोट छह प्लास्टिक pipettes का उपयोग करने से पहले कम से कम 10 मिनट के लिए एच एस के साथ (10 एमएल) और शुष्क।
  2. संस्कृति हुड में, 6 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में प्रत्येक पेशी हस्तांतरण। विच्छेदन कैंची का प्रयोग, के बारे में 2 मिमी के छोटे-छोटे टुकड़ों में पेशी काटा। ऊतक बहुत ज्यादा भरती के लिए नहीं सावधान रहना होगा।
  3. ध्यान से अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 0.1% pronase समाधान के 2.5 मिलीलीटर जोड़ने और 60 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। धीरे 20, 40, और 60 मिनट के बाद थाली हिला। नोट: सटीक duratioऊष्मायन के एन जानवरों की उम्र और तनाव जैसे कारकों पर निर्भर करता है।
  4. माइक्रोस्कोप के तहत निगरानी करें। पेशी के टुकड़े की जाँच करें और फाइबर बंडलों एक ढीला उपस्थिति (चित्रा 5) मिलता है जब enzymatic पाचन बंद करो।
  5. DMEM के 2.5 एमएल 10% एच एस और 1% पी / एस के साथ पूरक जोड़ें। 5 मिनट के लिए 400 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र ट्यूब स्थानांतरण। निस्तारण से सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  6. 10% एच एस और 1% पी / एस के साथ पूरक 5 मिलीलीटर DMEM जोड़ें। ऊतक homogenize करने के लिए ऊपर और नीचे एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक पिपेट (विचूर्णन) के साथ के लिए कम से कम 20 बार समाधान पिपेट।
  7. 4 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला लीजिए और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में हस्तांतरण।
  8. 10% एच एस और 1% पी / एस के साथ पूरक 5 मिलीलीटर DMEM जोड़ें। पिपेट फिर ऊतक टुकड़े जब तक एक 10 मिलीलीटर की प्लास्टिक विंदुक के साथ विंदुक के माध्यम से आसानी से गुजरता है।
  9. 4 मिनट के लिए 200 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा।
  10. पीएक 50 मिलीलीटर ट्यूब पर एक सेल झरनी (40 माइक्रोन) ut और फिल्टर पर अलग कोशिकाओं से युक्त सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण। अधिक से अधिक सेल वसूली के लिए 1 मिलीलीटर DMEM के साथ धोएं।
  11. 10 मिनट के लिए 1,000 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और एक pipet के साथ सतह पर तैरनेवाला त्यागें।
  12. 300 μl संस्कृति माध्यम में गोली Resuspend और एक hemocytometer में कोशिकाओं की गिनती।

बाह्य मैट्रिक्स जेल बिताने के स्थान पर उपग्रह कोशिकाओं की 4. भेदभाव

  1. संस्कृति के माध्यम से 10 μl में 1.5 एक्स 10 3 कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सेल निलंबन पतला।
  2. टेप के साथ कक्षों स्लाइड्स के कवर को सुरक्षित और वस्तु कांच के नीचे की ओर एक काला मार्कर के साथ बिताने के स्थान चिह्नित।
  3. एक micropipette का प्रयोग, बाह्य मैट्रिक्स जेल मौके पर 10 μl सेल निलंबन की एक बूंद डाल दिया। सेल निलंबन की बूंद की मौके पर ही सही ढंग से रखा गया है खुर्दबीन के नीचे की जाँच करें। 37 डिग्री सेल्सियस से कम छह घंटे के लिए सेते हैं।
  4. सावधानly की संस्कृति के माध्यम से (20% FBS के साथ पूरक DMEM, 10% एच एस, 1% पी / एस और 1% CEE) के 400 μl जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस से कम तीन दिनों के लिए सेते हैं।
    नोट: इस बिंदु पर, हौसले से अलग अनुसूचित जाति भारी आघात (एंजाइमी डाइजेस्ट और कठोर विचूर्णन) के अधीन है और वे ठीक करने की जरूरत हैं। पहले तीन दिन 37. अगला दौरान कोशिकाओं को परेशान मत करो, संस्कृति के माध्यम से प्रयोग के प्रकार के आधार पर बदला जा सकता है।
    बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉट भेदभाव परख के लिए एक उच्च सेल घनत्व (1.5-2.5 एक्स 10 20/03 μl) के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है। संस्कृति मध्यम (DMEM 20% FBS के, 10% एच एस, 1% पी / एस और 1% चिकन भ्रूण निकालने के साथ पूरक) हर तीसरे दिन बदला जा सकता है।
  5. विस्तार और गुजर वांछित है अगर वैकल्पिक रूप से, अगले चरणों का पालन करें:
    1. कम से कम 1.5 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर एक विभाज्य बाह्य मैट्रिक्स जेल (500 μl) गला लें। DMEM में 01:10 पतला और बिंदु 1.1.1 में सिफारिशों का पालन करें।
    2. 4 & पर 10 मिनट के लिए एक 10 एमएल पिपेट प्री-ठंडा# 176; सी।
    3. 10 मिनट के लिए एक ठंडी सतह (उदाहरण के लिए एक फ्रीजर पैक) पर तीन T75 बोतल स्थानांतरण।
    4. प्रत्येक फ्लास्क में 1 मिलीलीटर बाह्य मैट्रिक्स जेल में डाल करने के लिए पूर्व ठंडा पिपेट का प्रयोग करें। सतह पूरी तरह से कवर किया जाता है कि जाँच करें। कम से कम एक और 7 मिनट (चित्रा 1 ए) के लिए ठंड की सतह पर बोतल रखें।
    5. पूरी तरह से एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ शेष बाह्य मैट्रिक्स जेल हटाने, और 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कुओं सूखी।
    6. गिनती के बाद, संस्कृति के माध्यम से पूर्व लेपित T75 बोतल में और बीज (20% FBS के, 10% एच एस, 1% पी / एस और 1% चिकन भ्रूण निकालने के साथ पूरक DMEM) के 10 एमएल में हौसले से अलग जातियों resuspend।
    7. तीन दिनों के बाद, 80% संगम तक मध्यम (और हर तीसरे दिन) बदलने पर पहुंच गया है। Passaging के लिए, पीबीएस के साथ T75 बोतल तीन बार धोएं। अगला 1 मिलीलीटर 0.25% trypsin समाधान जोड़ने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस से कम तीन मिनट के लिए सेते हैं। संस्कृति के माध्यम से 9 मिलीलीटर में Resuspend (DMEM 10% एच एस, 1% पी / एस, 20% FBS के साथ पूरकऔर 1% चिकन भ्रूण निकालने) और 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र। सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गिनती के बाद, संस्कृति के माध्यम से 1,000 μl में 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं resuspend और कोशिकाओं फ्रीज।

Representative Results

इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, masseter पेशी (एक तरफ) 0.8-1 x 10 6 कोशिकाओं, द्वितुंदी पेशी (पीछे पेट) 1.5-2 x 10 5 कोशिकाओं पैदावार, और उन्नमनी वेली palatini पेशी पैदावार 1-1.5 x 10 5 कोशिकाओं अर्जित करता है। सेल पैदावार जानवर की मांसपेशी प्रकार, तनाव, और उम्र पर निर्भर करते हैं। तीन मांसपेशी समूहों के बीच तुलना के लिए, हौसले से अलग जातियों को एक ही सेल घनत्व (1.5 एक्स 10 10/03 μl) पर वरीयता प्राप्त थे। सीधे अलगाव के बाद, हौसले से अलग कोशिकाओं के 90% से अधिक Pax7 (चित्रा 6) व्यक्त करते हैं।

4 दिन, 7 और 10 संस्कृतियों Pax7, MyoD, MyoG और MyHC immunostaining के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। पोस्टल मनमाना क्षेत्रों एक 20x उद्देश्य का उपयोग संस्कृति के प्रति गिना रहे थे। दिन 4 पैक्स 7 और म्यो डी में सभी मांसपेशी समूहों में व्यक्त किया जाता है (आंकड़े 6 और 7 और 8), masseter और द्वितुंदी मांसपेशियों से SatCs की लेकिन संतान एक्सप्रेशंस शुरूmyogenin पहले उन्नमनी वेली palatini पेशी (9 चित्रा) की तुलना में गाते हैं। 10 दिन में, MyoG की अभिव्यक्ति दृढ़ता से सभी समूहों में (9 चित्रा) कम हो जाता है। कुछ दिन बाह्य मैट्रिक्स जेल स्थानों पर बोने के बाद, proliferating कोशिकाओं फ्यूज और मायोसिन भारी श्रृंखला व्यक्त जो बहु-केन्द्रक myotubes, आकार लेने लगते हैं। लघु myotubes दिन 7 (10 चित्रा) में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं। 10 दिन में, myotubes के हिल (वीडियो 1) मनाया जा सकता है।

चित्र 1
चित्रा 1:। एक कक्ष स्लाइड में बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉट (ए) आसान हेरफेर के लिए, एक 100 मिमी पेट्री डिश में 8 अच्छी तरह चैम्बर स्लाइड जगह है। Pipet 10 μl बाह्य मैट्रिक्स प्रत्येक कक्ष में जेल और एक ठंडी सतह (7 मिनट) पर डाल दिया। (बी) के अतिरिक्त बाह्य मैट्रिक्स जी के बाद चैम्बर स्लाइडएल निकाल दिया जाता है।

चित्र 2
चित्रा 2:। एक पार्श्व दृश्य में पशु की masseter पेशी के विच्छेदन (ए) के प्रमुख के। कान (ई), कर्णमूल (पी) और चेहरे की नस (सप्तम)। (बी) masseter पेशी (सुश्री) और लौकिक पेशी (टी) का सतही सिर के मांसल aponeurosis (ते)। एक संदंश के साथ अपनी प्रविष्टि से कण्डरा अलग करें। (सी) ध्यान से जबड़ा के Ramus पर अपनी प्रविष्टि जब तक मांसपेशियों में काटना। ई: कान, पी: कर्णमूल, सातवीं: चेहरे की नस, टी: टेम्पोरल मांसपेशियों, एमएस: masseter पेशी, ते के सतही सिर: कण्डरा, सांसद: masseter मांसपेशियों की गहरी सिर।

चित्र तीन
चित्रा 3: द्वितुंदी पेशी के पीछे पेट के विच्छेदन (।एक लापरवाह स्थिति में पशु की ए) प्रमुख। अवअधोहनुज ग्रंथि (एसजी), masseter पेशी (एम), चेहरे की नस (सप्तम) और sternocleidomastoid पेशी (एससीएम) स्थानीयकरण। अवअधोहनुज ग्रंथि को निकाल दें। (बी) द्वितुंदी मांसपेशी पूर्वकाल (ई) और पीछे पेट (पीडी) स्थानीयकरण। एक सीधे संदंश के साथ,, पीछे पेट के पूर्वकाल कण्डरा लेने के लिए यह कटौती और मध्य कर्ण Bulla (Ty) में अपने मूल जब तक इसे ध्यान से काटना। ई: कान, एसजी: अवअधोहनुज ग्रंथि, सातवीं: चेहरे की हिम्मत, एम: masseter पेशी, एसएमसी: sternocleidomastoid पेशी, ई: पूर्वकाल पेट द्वितुंदी पेशी, पीडी: पीछे पेट द्वितुंदी पेशी, TY: मध्य कर्ण Bulla।

चित्रा 4
चित्रा 4:। उन्नमनी वेली palatini पेशी के विच्छेदन (ए) द्वितुंदी पेशी (पीछे पेट) के विच्छेदन के बाद सामान्य दृश्य। Stylohyoid पेशी (एसटी) और उन्नमनी का पट्टावेली palatini स्थानीयकृत किया जा सकता है। इसके पीछे चल श्वासनली (टी) और घेघा (ते) ध्यान दें। श्वासनली और ग्रसनी (पी) संपर्क में है घेघा उठाने के बाद (बी)। कोमल तालू में उन्नमनी वेली palatini की प्रविष्टि अब दिख रहा है। तीर दोनों पक्षों में उन्नमनी वेली palatini मांसपेशियों के साथ विच्छेदित कोमल तालू को इंगित करता है। ई: कान, सेंट: stylohyoid पेशी, सातवीं: चेहरे की हिम्मत, एम: masseter पेशी, ई: पूर्वकाल पेट द्वितुंदी पेशी, पीडी: पीछे पेट द्वितुंदी पेशी, टी: श्वासनली, es: घेघा, पी: ग्रसनी, * उन्नमनी वेली palatini पेशी ।

चित्रा 5
चित्रा 5: pronase के साथ enzymatic पाचन के बाद से पहले मांसपेशियों के ऊतकों (ए) की उपस्थिति और (बी)। मांसपेशी बंडलों enzymatic पाचन के बाद ढीला होना दिखाई देते हैं कि ध्यान दें।


चित्रा 6: पैक्स 7 immunostaining के अलगाव के अंत में बाह्य मैट्रिक्स जेल के लिए लागू हौसले से अलग जातियों, (लगभग 6 घंटे प्रारंभिक ऊतक पाचन के बाद)।। पोस्टल मनमाना क्षेत्रों क्षेत्र में प्रति 210 कोशिकाओं के एक औसत के साथ एक 10x उद्देश्य का उपयोग गिना रहे थे। लगभग कोशिकाओं के 90% सकारात्मक पैक्स 7 रहे हैं। DAPI: नीले, Pax7: लाल। स्केल बार, 100 माइक्रोन।

चित्रा 7
चित्रा 7:। पैक्स 7, MyoD immunostaining के दिन 4, 7 और 10 संस्कृतियों Pax7 के खिलाफ एंटीबॉडी, और MyoD immunostaining के साथ दाग रहे थे। (ए - सी) और (डी - एफ) 4 दिन के प्रतिनिधि photomicrographs और masseter पेशी से 7 संस्कृतियों। (जी और एच + और ​​MyoD + सूक्ष्म क्षेत्र प्रति नाभिक की संख्या की गिनती और नाभिक की कुल संख्या (DAPI) के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। DAPI: नीले, Pax7: लाल, और MyoD: हरा। तराजू बार, 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

आंकड़ा 8
चित्रा 8:। Masseter, द्वितुंदी और उन्नमनी वेली तालु पेशी से संस्कृतियों में mononucleated कोशिकाओं से संस्कृतियों में Pax7 ± / MyoD ± का वितरण (एक - सी) दिवस 4, 7 और 10 संस्कृतियों Pax7 के खिलाफ एंटीबॉडी, और MyoD immunostaining के साथ दाग रहे थे। कोशिकाओं की कुल संख्या नाभिक की कुल संख्या (DAPI) के आधार पर किया जाता है। (डी) सेल ± Pax7 ± / MyoD का डाटा मात्रा का ठहरावरास। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

9 चित्रा
चित्रा: 9। Myogenin immunostaining के दिन 4, 7 और 10 संस्कृतियों Myogenin के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। (ए - डी) प्रतिनिधि 4 दिन की photomicrographs और उन्नमनी वेली तालु पेशी से 7 संस्कृतियों। (ई) MyoG + सूक्ष्म क्षेत्र प्रति नाभिक की संख्या की गिनती और नाभिक की कुल संख्या (DAPI) के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की गई थी। MyoG + कोशिकाओं की (एफ) डाटा मात्रा का ठहराव। DAPI: नीले, Myogenin: हरा। तराजू बार, 100 माइक्रोन। इस figur का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंई।

10 चित्रा
चित्रा 10:। मायोसिन भारी चेन immunostaining के दिन 4, 7 और 10 संस्कृतियों मायोसिन भारी श्रृंखला (MyHC) के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे। प्रतिनिधि दिन 4, 7 की photomicrographs और द्वितुंदी (डीआईजी) पेशी से 10 संस्कृतियों। दिन में 10 लंबी और अच्छी तरह से संगठित myotubes स्पष्ट कर रहे हैं, जबकि 7 दिन में, छोटे myotubes मौजूद हैं। तराजू बार, 200 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

वीडियो 1:।। Myotube हिल हिल myotubes के साथ दो प्रतिनिधि क्षेत्रों के उदाहरण दिन के लिए द्वितुंदी पेशी से 10 संस्कृतियों दिखाए जाते हैं इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

अलग branchiomeric सिर मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के पूर्व विस्तार और passaging के बिना एक 9 सप्ताह पुरानी Wistar चूहा और बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉट पर सीधे सुसंस्कृत से अलग थे। अलगाव के बाद, कोशिकाओं गिना रहे थे और एक ही सेल घनत्व पर वरीयता प्राप्त। तीन अलग अलग मांसपेशियों के समानांतर अलगाव के लिए, इस विधि के बारे में 4 घंटे लगते हैं। संस्कृति संक्रमण से बचने के लिए, एक महत्वपूर्ण कदम की मांसपेशियों के विच्छेदन के बाद शराब के 70% में तेजी से धोने है।

अनुसूचित जाति के अलगाव के दौरान यह छोटे टुकड़ों में मांसपेशियों के ऊतकों (लगभग 2 मिमी) में कटौती, लेकिन इस वजह से कोशिका क्षति के एक छोटे से सेल उपज में परिणाम देगा के रूप में बहुत ज्यादा क़ीमा बनाने से बचने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, enzymatic पाचन की अवधि को और अधिक नुकसान से बचने के लिए खुर्दबीन के नीचे ध्यान से जाँच की जानी चाहिए। पाचन के उद्देश्य myofibers अलग कर देना है। अलग कक्षों की 90% से अधिक Pax7 व्यक्त बाद, आगे नहीं शुद्धि (आंकड़े 6-8) की आवश्यकता है।यह एक ऐसी Percoll 39,40 पर uncoated व्यंजन 14,37,38 पर पूर्व चढ़ाना, विभाजन के रूप में अन्य तरीकों में अतिरिक्त शुद्धि चरणों से बचा जाता है, fluorescent- या चुंबकीय या सेल 41,43 छँटाई। विचूर्णन के लिए यह इस अनुसूचित जातियों के यांत्रिक रिहाई की अनुमति देता है के रूप में ऊतक टुकड़े और विंदुक टिप के उद्घाटन के बीच कतरनी प्रेरित करने के लिए आवश्यक है। (व्यास टिप के अंदर: 1 मिमी) एक 10 मिलीलीटर विंदुक के साथ विचूर्णन तो मुश्किल है, (व्यास टिप के अंदर: 2 मिमी) एक 5 एमएल पिपेट पहली बार उपयोग किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, कांच पाश्चर pipettes वांछित व्यास में कटौती की जा सकती है और इस्तेमाल किया जाएगा। इस विधि, कुशल सरल है और विभिन्न मांसपेशियों के नमूनों से अनुसूचित जाति के एक साथ अलगाव की अनुमति देता है।

अनुसूचित जातियों के लिए संस्कृति प्लेटें भी जिलेटिन या कोलेजन के साथ लेपित किया जा सकता है, लेकिन हमारे पिछले अध्ययनों बाह्य मैट्रिक्स जेल कोलेजन 38 से अधिक myogenic क्षमता के रखरखाव के लिए कहीं बेहतर है कि पता चलता है। के बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉटमिलीमीटर आकार (10 μl / ओ 2 मिमी या 20 μl / O 4 मिमी) प्रसार और कोशिकाओं की सीमित संख्या के साथ अनुसूचित जाति के भेदभाव के अध्ययन की अनुमति देता है। भेदभाव परख के लिए करीब 8 से 20 गुना कम कोशिकाओं 24 अच्छी तरह से थाली (हे 15.6 मिमी) की तुलना में आवश्यक हैं, और कम के बारे में 80-200 बार 35 मिमी पेट्री डिश (ओ 35 मिमी) 14,38 की तुलना में।

बाह्य मैट्रिक्स जेल महंगा है, इसलिए इस विधि भी अधिक लागत प्रभावी है। इसके अलावा, चैम्बर स्लाइड्स प्लास्टिक कवर से बदला जा सकता है और आगे की लागत को कम करने के लिए निकल जाता है। बाह्य मैट्रिक्स जेल की तैयारी के लिए चैम्बर स्लाइड्स के रातोंरात सुखाने के लिए आवश्यक है स्पॉट। बाह्य मैट्रिक्स जेल स्पॉट पारदर्शी हो रहे हैं, यह प्रकाश पीठ का उपयोग कर नीचे की ओर पर स्पॉट चिह्नित करने के लिए आवश्यक है। कक्षों स्लाइड आसान हेरफेर के लिए एक पेट्री डिश में तय कर रहे हैं। इसके अलावा सेल संस्कृति के विस्तार smal की अनुसूचित जातियों अध्ययन करने की संभावना प्रदान करता है, जो जरूरी नहीं हैमांसपेशियों या छोटे पेशी के नमूने ler। वैकल्पिक रूप से, पीसीआर या पेशी के लिए जैसे अधिक कोशिकाओं की जरूरत है अगर ऊपर संकेत के रूप में, हौसले से अलग जातियों पहले T75 बोतल में विस्तार किया जा सकता निर्माण करती है।

अनुसूचित जातियों इस प्रोटोकॉल का उपयोग अलगाव के बाद तुरंत फ्लो के साथ आगे की शुद्धि के लिए उपयुक्त नहीं हैं अलग। pronase साथ पाचन सतह का व्यापक पाचन 14 प्रतिजन का कारण बनता है। अलग बहुत संख्या विभिन्न myoblasts प्रसार और भेदभाव प्रभावित के रूप में सेल संस्कृति के लिए उपयोग किया जाता है कि घोड़े सीरम और भ्रूण गोजातीय सीरम पहले ठीक से अलगाव से पहले की विशेषता किया जाना चाहिए।

हाल के वर्षों में, गिल मेहराब और सिर mesoderm (जैसे दृष्टितर मांसपेशियों) 24 से निकाली गई मांसपेशियों में दिलचस्पी बढ़ रही है। यह स्पष्ट रूप से सिर और अंग की मांसपेशियों अत्यधिक विभिन्न गुणों के अधिकारी को प्रदर्शित किया गया है। पुराने जानवरों से masseter मांसपेशियों को फिर से करने लगता हैअंग की मांसपेशियों 25,26 के साथ तुलना में उनके पुनर्योजी क्षमता टाइन। दृष्टितर मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के सिर की मांसपेशियों से अनुसूचित जातियों के लिए तुलनीय एक मजबूत प्रसार और भेदभाव क्षमता के अधिकारी, और अंग पेशी अनुसूचित जातियों के 24 की तुलना में एक बड़ा engraftment क्षमता दिखाने।

फाइबर प्रकार वितरण और मायोसिन रचना मांसपेशी समूहों के बीच और भी प्रजातियों के बीच होती है। मनुष्यों में पहली गिल चाप से होने वाले स्नायु हृदय की मांसपेशियों के विकास के लिए विशिष्ट धीमी और तेज दोनों फाइबर (उपप्रकार आईआईए और IIx), नवजात myosins और myosins होते हैं। कृन्तकों में इन मांसपेशियों के बारे में 95% तेजी से तंतुओं मायोसिन आईआईए और IIb) 44-46 होते हैं। एवियन मांसपेशियों पर अध्ययन अलग मांसपेशी फाइबर प्रकार से अनुसूचित जाति भेदभाव क्षमता में भिन्न है कि दिखा। धीमी गति से फाइबर से अनुसूचित जातियों दोनों फाइबर प्रकार 47 में अंतर कर सकते हैं, जबकि तेजी से फाइबर से अनुसूचित जातियों ही, तेजी से मांसपेशी फाइबर में अंतर है। इसके अलावा, तेजी से मांसपेशियों में अनुसूचित जातियों का प्रतिशततंतुओं धीमी गति से मांसपेशी फाइबर 48,49 की तुलना में कम है। यह फाइबर प्रकार वितरण craniofacial क्षेत्र में मांसपेशियों पर अध्ययन के लिए ध्यान में रखा जाना चाहिए कि इंगित करता है। फांक तालु की मांसपेशियों के लिए भी इसी तरह, कृन्तकों में LVP तेजी से तंतुओं 50 लगभग विशेष रूप से शामिल हैं। कारण है कि, LVP से अनुसूचित जातियों फांक तालु के क्षेत्र में पूर्व नैदानिक ​​अध्ययन के लिए उपयुक्त हैं।

इस प्रोटोकॉल branchiomeric सिर मांसपेशियों या अन्य छोटे मांसपेशियों या छोटे मांसपेशियों के नमूनों से व्युत्पन्न अनुसूचित जातियों का अध्ययन करने के लिए नई संभावनाओं प्रदान करता है। यह एक ऐसी फांक तालु के रूप में बल्कि छोटे मांसपेशियों को प्रभावित करने वाले अन्य स्थितियों में स्थितियों में मैक्सिलोफेशियल क्षेत्र में मांसपेशियों के उत्थान में सुधार करने के लिए नए उपचारों के विकास की सुविधा होगी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hypodermic Needle 25 G 0.5 x 25 m BD Microlance 300400
Dissecting scissors Braun BC154R
Micro forceps straight Braun BD330R
Surgical Scalpel Blade No. 15 Swann-Morton 0205
Alcohol 70% Denteck 2,010,005
Permanox Slide, 8 Chamber Thermo Scientific 177445
6 well cell culture plate Greiner bio-one 657160
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) Greiner bio-one 664160
15 ml sterile conical centrifuge tube BD Biosciences 352097
50 ml sterile conical centrifuge tube BD Biosciences 352098
Cell strainer (40 μm) Gibco 431750
10 ml serological pipette Greiner bio-one 607180
20 µl FT20 Greiner bio-one 774288
Matrigel, Phenol-Red Free BD Biosciences 356237 10 ml
Pronase Calbiochem 53702 10 KU
Phosphate Buffered Saline Gibco 14190-144 500 ml
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate  Gibco 10569-010 500 ml
Fetal Bovine Serum   Fisher Scientific 3600511 500 ml
Horse Serum Gibco 26050088 500 ml
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 100 ml
Chicken Embryo Extract MP Biomedicals 2850145 20 ml

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles
Posted by JoVE Editors on 10/01/2015. Citeable Link.

An erratum was issue for Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Steps 2.5.3 and 2.5.4 were updated from:

2.5.3. Look for the trachea and the esophagus that runs behind it. Lift the esophagus, and expose the pharynx, larynx and the soft palate.
2.5.4. Localize the area of the soft palate where the levator veli palatini is inserted and cut it loose (Figure 4B).

to

2.5.3. Look for the trachea and the esophagus that runs behind it. Lift the esophagus, and expose the pharynx and the larynx.
2.5.4 Localize and dissect the area of the superior pharyngeal constrictor muscle. Identify the levator veli palatini and cut it at both sides (Figure 4B).

Figure 4 and its legend were updated from:


Figure 4: Dissection of the levator veli palatini muscle. (A) General view after dissection of the digastric muscle (posterior belly). Stylohyoid muscle (St) and tendon of the levator veli palatini can be localized. Note the trachea (T) and esophagus (Es) running behind it. (B) After lifting the trachea and the esophagus the pharynx (P) is exposed. The insertion of the levator veli palatini into the soft palate is now visible. The arrow indicates the dissected soft palate with the levator veli palatini muscles at both sides. E: ear, St: stylohyoid muscle, VII: facial nerve, M: masseter muscle, AD: anterior belly digastric muscle, PD: posterior belly digastric muscle, T: trachea, Es: esophagus, P: Pharynx, *levator veli palatini muscle.

to


Figure 4: Dissection of the levator veli palatini muscle. (A) General view after dissection of the digastric muscle (posterior belly). Stylohyoid muscle (St) and tendon of the levator veli palatini can be localized. Note the trachea (T) and esophagus (Es) running behind it. (B) After lifting the trachea and the esophagus the pharynx (P) is exposed. The levator veli palatini that runs laterally towards the soft palate is now visible. The arrow indicates the dissected superior pharyngeal constrictor muscle; note the levator veli palatini muscles at both sides. E: ear, St: stylohyoid muscle, VII: facial nerve, M: masseter muscle, AD: anterior belly digastric muscle, PD: posterior belly digastric muscle, T: trachea, Es: esophagus, P: Pharynx, *levator veli palatini muscle.

चूहा हेड Branchiomeric मांसपेशियों से अलगाव और उपग्रह कोशिकाओं की विशेषता
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Carvajal Monroy, P. L., Yablonka-Reuveni, Z., Grefte, S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Wagener, F. A. D. T. G., Von den Hoff, J. W. Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles. J. Vis. Exp. (101), e52802, doi:10.3791/52802 (2015).

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