Denne protokollen beskriver isolering av satellittceller fra branchiomeric hode musklene i en 9 uker gamle rotter. Musklene kommer fra forskjellige branchial buer. Deretter satellitt dyrkes cellene på en flekk belegg av millimeterstørrelse for å studere deres differensiering. Denne tilnærmingen unngår ekspansjon og passaging av satellitten celler.
Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.
Om 1: 500 til 1: 1000 nyfødte utviser en kløft som involverer leppe og / eller ganespalte (CLP); dermed er dette den vanligste medfødte misdannelser hos mennesker en. Musklene i den bløte ganen er kritiske for driften av den bløte ganen under tale, svelge, og suger. Hvis en kløft av den myke ganen er til stede, er disse musklene unormalt innsatt i den bakre enden av palatinal benet.
Den myke ganen beveger seg opp og ned i løpet av tale, hindrer luft å slippe gjennom nesen. Barn med en kløft i gane har ikke denne kontrollfunksjon som resulterer i et fenomen som er kjent som velopharyngeal dysfunksjon 2,3. Selv om behandlingsprotokoller er variable, tar kirurgisk reparasjon av den bløte ganen sted i tidlig barndom (6-36 måneders alder) 4. De unormalt innsatte musklene i den bløte ganen kan korrigeres kirurgisk 5-7, men vedvarer velopharyngeal dysfunksjon hos 7% til 30%av pasientene 2,3,8-10.
Evnen til skjelettmuskel for å regenerere ved virkningen av satellittceller (SCS) er vel etablert 11,12. Ved muskelskader, er SC'er aktivert og migrere til skadestedet. De deretter spre seg, skille, og smelte til å danne nye myofibers eller reparere skadet seg 13. Stillestående SC'er uttrykke transkripsjonsfaktor Pax7 14,15, mens deres avkom, prolifererende myoblaster, i tillegg uttrykke myogenisk fastsettelse faktor 1 (myod) 16. Skille myoblaster begynne å uttrykke myogenin (MyoG) 17. Den terminale differensiering av myoblaster er preget av dannelsen av myofibers, og ekspresjonen av muskel-spesifikke proteiner som myosin tung kjede (MyHC) 16,18.
Nylig har flere strategier blitt brukt i regenerativ medisin for å forbedre muskel regenerering av lem muskler 19-23. Spesifikke studier påbranchiomeric hode muskler er også viktig fordi det ble nylig demonstrert at de skiller seg fra andre muskler i flere aspekter 24. I motsetning til lem muskler, har det blitt foreslått at branchiomeric hode muskler inneholder mindre SC'er 25, regenerere langsommere, og mer fibrøst bindevev er dannet etter skade 26 I tillegg prolifererende SC'er fra branchiomeric hode muskler uttrykker også andre transkripsjonsfaktorer. For eksempel er Tcf21, en transkripsjonsfaktor for craniofacial muskeldannelse sterkt uttrykt i regenererende hode muskler, men neppe i regenererende lem muskler 25. Musklene i den bløte ganen av CLP pasienter er vanligvis mindre og mindre godt organisert i forhold til normal palatal muskler 27,28. Langsomme og raske fibre er begge til stede i den bløte ganen muskler, men de langsomme fibrene er mer rikelig. I motsetning til dette, hare muskler inneholder en høyere andel av raske fibre og også en redusert kapillær tilførselsammenlignet med vanlige myke ganen muskler 29-31. Raske fibre er mer utsatt for sammentrekning-indusert skade 31-33. Den medfølgende dårlig kapillær forsyningen kan også gi fibrose 34,35. Alle disse aspektene kan bidra til dårlig regenerering av bløte gane muskler etter kirurgisk kløft nedleggelse 36. I lys av dette, er en protokoll for isolering og karakterisering av branchiomeric hode muskel SC'er avgjørende. Dette gir mulighet til å studere SC biologi branchiomeric hode muskler. I tillegg kan nye behandlingsformer basert på tissue engineering utvikles for å fremme muskel regenerasjon etter operasjonen i CLP og andre forhold kompromitterende kraniofaciale området.
Generelt kan SC'er oppnås etter dissosiasjon av muskelvev 14. Hakking, enzymatisk fordøyelse, og maling er vanligvis nødvendig for å frigjøre SC'er fra sin nisje. SC'er kan renses ved pre-plating på ubestrøket retter 14,37,38, fractionation på Percoll 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk celle sortering 41-43. Her presenterer vi en ny økonomisk og hurtig protokoll for isolering av satellittceller fra branchiomeric hode musklene i unge voksne rotter. Denne protokollen er basert på en tidligere manuskript 14 og spesielt tilpasset for små vevsprøver. Isolering av SC'er fra representative muskler som stammer fra den 1., 2., og 4. branchial buer er beskrevet. Etter isolering, lavt antall satellitt celler dyrkes på ekstracellulære matrise gel flekker av millimeter størrelse for å studere deres differensiering. Denne tilnærmingen unngår behovet for utvidelse og passaging av SC'er.
SC'er fra forskjellige branchiomeric hode muskler ble isolert fra en 9 uker gamle Wistar-rotte, og dyrket direkte på ekstracellulær matriks gel flekker uten forutgående ekspansjon og aging. Etter isolering ble cellene tellet og podet på samme celletetthet. For parallell isolering av tre forskjellige muskler, tar denne fremgangsmåte omtrent 4 timer. For å unngå forurensning kultur, er et kritisk trinn rask vasking i alkohol 70% etter disseksjon av musklene.
Under SC isolasjon er det viktig å skjære muskelvev i små biter (ca. 2 mm), men unngå for mye hakking, da dette vil resultere i en liten celle utbytte på grunn av celleskade. Dessuten må varigheten av den enzymatiske fordøyelse kontrolleres nøye under mikroskopet for å unngå ytterligere skade. Formålet med fordøyelsen er å dissosiere myofibers. Siden mer enn 90% av de isolerte celler uttrykker Pax7, er ingen ytterligere rensning er nødvendig (figurene 6-8).Dette unngår ekstra rensetrinn i andre metoder som pre-plating på ubestrøket retter 14,37,38, fraksjonering på Percoll® 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk celle sortering 41,43. For finfordeling er det viktig å indusere skjær mellom vevfragmenter og åpningen av pipettespissen da dette gjør den mekaniske frigjøring av SCS. Dersom triturering med en 10 ml pipette (innvendig diameter tip: 1 mm) er vanskelig, en 5 ml (indre diameter: 2 mm spiss) kan pipette brukes først. Alternativt kan glass Pasteur pipetter kappes i ønsket diameter og benyttes. Denne metoden er enkel, effektiv og tillater samtidig isolering av SC fra forskjellige muskelprøver.
Kulturplatene for SC'er kan også være belagt med gelatin eller kollagen, men våre tidligere studier viser at ekstracellulære matriks gel er langt bedre for vedlikehold av myogenisk potensial enn 38 kollagen. Den ekstracellulære matrise gel flekker avmillimeter størrelse (10 ul / Ø 2 mm eller 20 ul / o 4 mm) tillater studiet av proliferasjon og differensiering av SC'er med et begrenset antall celler. For differensiering analysen omtrent 8 til 20 ganger færre celler er nødvendige i forhold til en 24-brønns plate (Ø 15,6 mm), og 80 til 200 ganger mindre sammenlignet med 35 mm petriskåler (35 mm) 14,38.
Siden ekstracellulære matrise gel er dyrt, er denne metoden også mer kostnadseffektiv. I tillegg kan kammers objektglass erstattes av plastdekkglass for å redusere omkostningene ytterligere. For fremstilling av den ekstracellulære matriks gelen ble over natten tørking av kammers objektglass er viktig. Som de ekstracellulære matrise gel flekker er gjennomsiktig, er det nødvendig å markere flekker på undersiden ved hjelp av bakgrunnsbelysning. Kamrene lysbildene er løst i en petriskål for enkel manipulasjon. Videre cellekultur utvidelse ikke er nødvendig, som tilbyr muligheten til å studere SC'er av smalLER muskler eller små muskelprøver. Alternativt, f.eks PCR eller muskel-konstruksjonene hvis flere celler er nødvendig, kan den nylig isolerte SC'er først ekspanderes i T75-kolber som angitt ovenfor.
SC'er isolert ved anvendelse av denne protokollen er ikke egnet for ytterligere rensing med flowcytometri umiddelbart etter isolering. Nedbrytning med pronase forårsaker omfattende oppslutning av overflateantigener 14. Hesteserum og føtalt bovint serum som blir benyttet for cellekultur, må først være riktig karakteriseres før isolasjon, som forskjellige partinummer differensielt påvirkes myoblaster proliferasjon og differensiering.
I de senere årene, er det en økende interesse i musklene avledet fra branchial buer og hodet mesoderm (f.eks extraocular muskler) 24. Det har blitt tydelig demonstrert at hode og lem muskler har svært forskjellige egenskaper. Tyggemuskelen fra gamle dyr ser ut til å reholde sin evne til reproduksjon i sammenligning med lem muskler 25,26. SC'er fra extraocular musklene har en robust spredning og differensiering kapasitet sammenlignes SC'er fra hode muskler, og viser en større engraftment potensial enn lem muskel SC'er 24.
The fiber type fordeling og myosin sammensetning varierer mellom muskelgrupper og også mellom arter. Muskler som stammer fra den første branchial arch hos mennesker inneholde både langsomme og raske fibre (subtyper IIA og IIx), neonatale myosins og myosins typiske for utvikling av hjertemuskelen. I gnagere disse musklene inneholder ca 95% raske fibre myosin IIA og IIB) 44-46. Studier på avian muskler viser at SC'er fra ulike muskelfibertyper varierer i differensiering kapasitet. SC'er fra raske fibre bare differensiere til raske muskelfibre, mens SC'er fra langsomme fibre kan differensiere i begge fibertyper 47. I tillegg er den prosentandel av SC'er i fast muskelFibrene er lavere enn i langsomme muskelfibrene 48,49. Dette indikerer at fibertypen fordelingen må tas i betraktning for studier av muskler i kraniofaciale området. I likhet med ganespalte muskler, LVP hos gnagere inneholder nesten utelukkende raske fibre 50. Av den grunn SC'er fra LVP er egnet for pre-kliniske studier innen ganespalte.
Denne protokollen gir nye muligheter for å studere SC'er avledet fra branchiomeric hode muskler eller andre mindre muskler eller mindre muskler prøver. Dette vil lette utviklingen av nye behandlingsformer for å bedre regenerering av muskler i kjeveområdet i forhold som ganespalte, men også i andre forhold som påvirker mindre muskler.
The authors have nothing to disclose.
This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).
Hypodermic Needle 25G 0,5x25m | BD Microlance | 300400 | |
Dissecting scissors | Braun | BC154R | |
Micro forceps straight | Braun | BD330R | |
Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton | 0205 | |
Alcohol 70% | Denteck | 2,010,005 | |
Permanox Slide, 8 Chamber | Thermo Scientific | 177445 | |
6 well cell culture plate | Greiner bio-one | 657160 | |
Cell Culture Dishes (100 x 20 mm) | Greiner bio-one | 664160 | |
15 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352097 | |
50 ml sterile conical centrifuge tube | BD Biosciences | 352098 | |
Cell strainer (40 μm) | Gibco | 431750 | |
10 mL serological pipette | Greiner bio-one | 607180 | |
20µL FT20 | Greiner bio-one | 774288 | |
Matrigel, Phenol-Red Free | BD Biosciences | 356237 | 10 mL |
Pronase | Calbiochem | 53702 | 10KU |
Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
Dulbecco's Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate | Gibco | 10569-010 | 500 mL |
Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | 3600511 | 500 mL |
Horse Serum | Gibco | 26050088 | 500 mL |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | 100 mL |
Chicken Embryo Extract | MP Biomedicals | 2850145 | 20 mL |