Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
这项工作概述了非发射的合成,环金属化铱(III)络合物,铱(PPY)2(H 2 O)2 +(IR1),当配位到一个组氨酸可引起一个快速,长寿命的磷光信号含蛋白质固定化磁性粒子的表面上。 IR1的合成,产量高,是完整的O / N和涉及母公司环金属铱(III)氯桥联二聚体成两个当量的溶解复杂的分裂。 以确认特异性,数个氨基酸进行探测的协调活动时加入到合成的探针,只有组氨酸引起的信号响应。使用BNT-II中,疟疾生物标记组氨酸丰富蛋白II(pfHRP-II)的支链的肽模拟物中,铱探针验证作为HRP-Ⅱ检测的工具。淬火效果注意到在BNT-II / IR1滴定相比L-组氨酸/ IR1,但这些都归因于空间位阻和三诗人盖伊状态淬火。生物层干涉测量被用来确定IR1与BNT-Ⅱ相互作用的实时动力学。一旦系统进行了优化,检测用探针rcHRP-Ⅱ的限制被认为是12.8纳米在溶液中。当这种蛋白质被固定在50微米磁性琼脂糖颗粒的表面上,检测限为14.5纳米。此无机探针的健壮信号的响应,以及在溶液中利用其柔性或固定在表面上,可借本身朝向各种应用,从诊断用成像。
比色和荧光标记是用于生化分子的检测和跟踪的重要方法和处理1,2-。最常见的荧光标记物是低分子量的有机染料3,4-,但这些分子并不总是理想的光学性质。荧光染料容易发生光漂白,常常有小的斯托克斯位移,并且可具有重叠的激发和发射光谱。比色标记通常通过使用酶标记,其具有一个放大的信号在免疫测定定量5,6-有用实现。这些酶也有其缺点,包括光敏性,反应条件,和短基片的保质期。这些性质往往需要免疫测定和蛋白标记方法使用昂贵的试剂良好控制的条件下进行。
发射过渡金属配合物已探索作为替代标记方法FO- [R生化检测。特别是,环金属化铱(Ⅲ)已经研究了在有机发光二极管(OLED)7-9氧传感10的上下文中,催化11,和蛋白/细胞染色12-14。高光稳定性和量子效率使这一类探头的一个很好的候选人生物分子检测15,16。这是以前发现,环金属化的形式的铱(Ⅲ)配合物,[铱(C ^ N)2(SOLV)2] +,不可逆地结合组氨酸和引发蓝绿信号响应12,17。这些配合物是不发光的solvento状态,但是当组氨酸置换的溶剂分子与结合至金属中心,它们释放长波紫外线照射后的强烈的磷光信号。这个信号只发生配位体置换后,并且是一个三线态的电子通过的金属配位体的电荷转移活化放松到基态的结果(3毫升CT)和配体为中心的转移(3 LC)途径8,15。这些配合物可以潜在地用作检测探针对富含组氨酸的蛋白质。
富含组氨酸的蛋白质和它们的调节的水平是很重要的,在许多疾病,包括肝硬化,癌症,和凝血酶病症。18恶性疟原虫组氨酸丰富蛋白II(pfHRP-Ⅱ),特别是良好的验证生物标记疟原虫感染。这种蛋白质是67 kDa的并含有34%组氨酸,多内特性AHHAHHAAD重复图案19。这些重复的组氨酸可结合不含金属离子19和血红素络合物20主机的血液。 pfHRP-II是在低资源设置常用检测使用免疫层析快速诊断测试(主任小组),但这些测试往往是不准确的,由于样本的条件下,低浓度的生物标记物,可怜的制造标准,以及抗体降解21。
<p class=“jove_content”>金属基磷光探针如环金属铱(Ⅲ)上述配合物是有吸引力的选择为pfHRP-Ⅱ的检测,由于其选择性的组氨酸的结合和它们的稳定的,高效的发光特性。在本文中,采用对[Ir(PPY)2(H 2 O)2] +(IR1)来检测BNT-II,pfHRP-II的分支肽模拟进行了探讨22。这种相互作用的动力学实时使用生物层干涉测量技术监测。该测定也适合于在小球上的ELISA类型的格式,在那里分别实现检测纳摩尔限制。该测定中保持优于传统的ELISA,因为它可以在2小时来进行的,而不是在4-5小时,并用典型的ELISA需要生物试剂与抗体的游离的试剂。作为微粒为基础的诊断工具来现代诊断技术的前沿,直接作用于颗粒的表面的检测对象的生物分子的是一大优势。传统的分子的检测方法,如ELISA和PCR,是有利的,因为它们能够实现检测25的非常低的限制。但是,这些测定法需要大量的试剂和冗长的协议。该测定被设计为模仿ELISA类型夹心相互作用不受时间和试剂的要求( 图5)。另外,每个样品的IR1探针的成本估计是围绕一个便士,而抗体的一个典型的ELISA的成本为$ 0.20-0.30每个样品。
因为上述方法依赖于一个环金属铱探针用于检测疟疾生物标志物的,该探针将不容易受到共同的其他检测方法的故障模式( 即荧光团淬火时NG和抗体/酶降解)。组氨酸是在其金属结合特性是唯一的。概述的工作利用了这一现象通过替换抗体中的典型ELISA夹心与含有金属配合物的优势。镍(Ⅱ)NTA捕获rcHRP-Ⅱ的颗粒的表面上和IR1信号的蛋白质的存在。在测定中最关键的步骤是允许磁性颗粒混合的样品和探针。在一个96孔板的ELISA,生物分子和试剂达到与井的底部的二维表面平衡。磁性颗粒具有沉降出来的溶液中的倾向,由于其致密氧化铁核心,这将减少了可用结合位点。因此,颗粒必须在测定时间进行混合,以确保最大结合。
当设计一个试剂为疾病的诊断,必须牢记患者样品的形式,以及所述生物标志物的生理浓度。为疟疾, 粉煤的HRP-Ⅱ的在病人的血液中的浓度可以从低皮摩尔到高纳摩尔变化。而该测定是临床相关更高水平的感染,需要检测极限,以检测无症状患者低皮摩尔循环粉煤的HRP-Ⅱ得到改善。在以上概述的方法中,“接通”,在组氨酸存在下通过IR1产生的信号出现。而疟疾生物标志物是富含组氨酸,其它血清蛋白,如人血清白蛋白和组氨酸丰富的糖蛋白,会引起与探针的信号的响应。这反过来又导致假阳性诊断。这使得粒子的有益步骤,在该感兴趣的蛋白质,可以迅速地从患者样品中提取的表面上的蛋白质的捕获。此外,设计一个双功能探头,即夫妻富含组氨酸肽与强大的分子识别元件( 即适体),可以添加特异性另一层到测定。肽将与铱装载联接到所述适体之前。在这样的设计中,稳定IR1探针仍然可以同时实现靶特异性与适体使用。这将允许应用的探针来检测天然的HRP-II在一个复杂的基质( 即血浆或全血),并减少非特异性结合效果。为了进一步提高快速诊断测试信号,该测定可纳入电化学发光(ECL)系统,其中, 粉煤的HRP-II可以在快速诊断被检测为电化学读数26。这种新一代铱探测器将大大提高我们的小球上的ELISA检测的疾病生物标志的检测分析。
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |