Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Dette arbejde beskriver syntesen af en ikke-emitterende, cyclometalated Ir (III) kompleks, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), som fremkalder en hurtig, langlivet phosphorescerende signal, når koordineret til en histidin- holdigt protein immobiliseret på overfladen af en magnetisk partikel. Syntese af IR1, i høje udbytter, er komplet O / N og involverer opsplitning af det oprindelige cyclometalated Ir (III) chlor-broforbundne dimer i to ækvivalenter af den solvatiserede kompleks. For at bekræfte specificiteten blev adskillige aminosyrer probet for koordination aktivitet ved tilsætning til den syntetiserede probe og kun histidin fremkaldes et signal respons. Brug af BNT-II, en forgrenet peptid efterligner af malaria biomarkør Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) blev iridium sonden valideret som et redskab til HRP-II afsløring. Quenching virkninger blev bemærket i BNT-II / IR1 titrering sammenlignet med L-histidin / IR1, men disse blev tilskrevet sterisk hindring og triPlet state quenching. Biolayer interferometri blev anvendt til bestemmelse realtid kinetik for interaktion af IR1 med BNT-II. Når systemet er optimeret, blev detektionsgrænse rcHRP-II ved hjælp af sonden sig at være 12,8 nM i opløsning. Når dette protein blev immobiliseret på overfladen af en 50 um magnetisk agarose partikel, var detektionsgrænsen 14,5 nM. Den robuste signal reaktion af denne uorganiske probe, såvel som dens fleksibilitet i anvendelsen i opløsning eller immobiliseret på en overflade, kan egner sig mod en lang række applikationer, fra diagnostisk anvendelse til billeddannelse.
Kolorimetrisk og fluorescerende mærkning er en vigtig metode til påvisning og sporing af biokemiske molekyler og processer 1,2. De mest almindelige fluorescerende markører er lavmolekylære organiske farvestoffer 3,4, men disse molekyler har ikke altid ideelle optiske egenskaber. Fluorescerende farvestoffer er tilbøjelige til fotoblegning, ofte har små Stokes skift, og kan have overlappende excitation og emission spektre. Kolorimetrisk mærkning opnås ofte ved anvendelse af enzymatiske mærker, som har et forstærket signal nyttig i immunoassay kvantificering 5,6. Disse enzymer har også deres ulemper, herunder lysfølsomhed, reaktionsbetingelser og korte substrat holdbarhed. Disse egenskaber tendens til at kræve immunassays og protein mærkning metoder, der skal gøres under velkontrollerede forhold ved hjælp af dyre reagenser.
Emissionsforårsagende overgang-metalkomplekser er blevet udforsket som en alternativ mærkning tilgang for biokemisk detektion. Især cyclometalated Ir (III) er blevet undersøgt i forbindelse med organiske lysdioder (OLED) 7-9 oxygen sensing 10, katalyse 11, og protein / celle farvning 12-14. Høj fotostabilitet og kvante effektivitet gør denne klasse af prober en god kandidat til biomolekyle detektion 15,16. Det blev tidligere vist sig, at cyclometalated Ir (III) komplekser, af formen [Ir (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, irreversibelt binder histidin og fremkalde en blågrøn signal respons 12,17. Disse komplekser er ikke-emitterende i solvento tilstand, men når histidin forskyder opløsningsmiddelmolekylerne og binder til metallet centrum, de frigiver en intens phosphorescerende signal efter langbølget UV-bestråling. Dette signal forekommer kun efter ligand substitution, og er resultatet af en triplet state elektron afslappende til grundtilstanden gennem aktivering af metal-ligand ladningsoverførsel (3 mlCT) og ligand centreret overførsel (3 LC) veje 8,15. Disse komplekser kan potentielt anvendes som detektionsprober for histidin-rige proteiner.
Histidin-rige proteiner og deres regulering niveauer er vigtige i mange sygdomme, herunder levercirrose, cancer og thrombemasse lidelser. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) i særdeleshed er en velvalideret biomarkør for malariaparasitten infektion. Dette protein er 67 kDa og indeholder 34% histidin, hovedsagelig inden karakteristiske AHHAHHAAD gentage motiver 19. Disse histidin gentagelser kan binde frit metalioner 19 og hæm komplekser 20 i vært blod. pfHRP-II er almindeligt påvist i indstillinger ressourcesvage hjælp immunkromatografiske hurtige diagnostiske test (RDTs), men disse test er ofte unøjagtige på grund af prøven betingelser, lav biomarkør koncentration, dårlige produktionsstandarder og antistof nedbrydning 21.
<p class="Jove_content"> Metal-baserede phosphorescerende prober såsom cyclometalated Ir (III) komplekser beskrevet ovenfor, er attraktive muligheder til påvisning af pfHRP-II på grund af deres selektive binding af histidin og deres stabile og effektive emissionsegenskaber. I dette papir, anvendelsen af [Ir (ppy) 2 (H2O) 2] + (IR1) for at detektere BNT-II, en forgrenet peptid efterligner af pfHRP-II er udforsket 22. Kinetik af denne interaktion blev overvåget i realtid under anvendelse biolayer interferometri teknikker. Assayet blev også tilpasset til en on-bead ELISA-typen format, hvor nanomolære påvisningsgrænser blev nået. Dette assay rummer fordele sammenlignet med traditionelle ELISA'er fordi den kan udføres på under 2 timer med antistof-fri reagenser, i stedet for de 4-5 timer og biologiske reagenser, der er nødvendige med typiske ELISA'er.Som mikropartikler-baserede diagnostiske værktøjer kommer til forkant med moderne diagnostiske teknologi, afsløring af target biomolekyler direkte på overfladen af partiklen er en stor fordel. Traditionelle molekylære påvisningsmetoder, såsom ELISA og PCR, er fordelagtige, idet de kan opnå meget lave påvisningsgrænser 25. Men disse analyser kræver omfattende reagenser og langvarige protokoller. Dette assay blev designet til at efterligne ELISA-type sandwich-interaktioner uden klokkeslæt og reagens krav (figur 5). Desuden blev omkostningerne ved IR1 sonde per prøve anslås at være omkring en krone, mens prisen på antistoffer for en typisk ELISA er $ 0,20-0,30 per prøve.
Da de ovenfor beskrevne metoder er afhængige af en cyclometalated iridium probe til påvisning af malaria biomarkør, ville denne probe ikke være modtagelige for failure modes fælles for andre påvisningsmetoder (ie. Fluorofor quenching og antistof / enzym nedbrydning). Histidin er enestående i sin metal-bindende egenskaber. Den skitserede arbejde drager fordel af dette fænomen ved at erstatte de antistoffer i en typisk ELISA sandwich med metalholdige komplekser. Ni (II) NTA indfanger rcHRP-II på overfladen af partiklen og IR1 angiver tilstedeværelsen af proteinet. Det mest kritiske trin i assayet er at tillade de magnetiske partikler blandes med prøven og proben. I en 96-brønds plade ELISA, biomolekylerne og reagenser nå ligevægt med den todimensionelle overflade på bunden af brønden. Magnetiske partikler har tendens til at bundfælde fra opløsningen på grund af deres tætte jern-oxid kerne, hvilket ville reducere de tilgængelige bindingssteder. Således skal partiklerne blandes under assayet for at opnå maksimal binding.
Når du designer en reagens til sygdomsdiagnostik, må man huske på form af patientprøve samt den fysiologiske koncentration af biomarkør. Tilmalaria, kan koncentrationen af pf HRP-II i en patients blod variere fra lav til høj picomolær nanomolær. Mens dette assay er klinisk relevant for højere niveauer af infektion, skal forbedres for at opdage asymptomatiske patienter med lav picomolær cirkulerer pf HRP-II detektionsgrænsen. I fremgangsmåderne skitseret ovenfor, er "switch-on" signal frembragt af IR1 forekommer i nærvær af histidin. Mens malaria biomarkør er rig på histidin, andre serumproteiner, såsom humant serumalbumin og histidin rig glycoprotein, ville fremkalde et signal respons med proben. Dette ville til gengæld føre til falske positive diagnoser. Dette gør indfangning af proteinet på overfladen af partiklen en gavnlig skridt, ved, at proteinet af interesse kan hurtigt ekstraheret fra en patientprøve. Derudover designe et bifunktionelt probe, der kobler en histidin rig peptid til en robust molekylær genkendelse element (dvs.. Aptamer) Kunne tilføje endnu et lag af specificitet til assayet. Peptidet ville blive belastet med iridium før kobling til aptameren. I en sådan udformning kan den stabile IR1 sonden stadig anvendes samtidig opfylde målspecificitet med aptamer. Dette ville muliggøre anvendelse af proben til påvisning af nativt HRP-II i et kompleks matrix (plasma eller fuldblod ie.) Og reducere uspecifik binding virkninger. For yderligere at forstærke signalet af hurtige diagnostiske test, kan analysen inkorporeres i et system, elektro (ECL), hvor pf HRP-II kan detekteres på RDTs som en elektrokemisk udlæsning 26. Denne næste generation iridium sonde ville i høj grad øge vores on-bead ELISA-assay til påvisning af sygdomstilstande biomarkører.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |