Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Iridium (III) Luminescent Probe for Påvisning af malaria Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Dette arbejde beskriver syntesen af en ikke-emitterende, cyclometalated Ir (III) kompleks, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1), som fremkalder en hurtig, langlivet phosphorescerende signal, når koordineret til en histidin- holdigt protein immobiliseret på overfladen af ​​en magnetisk partikel. Syntese af IR1, i høje udbytter, er komplet O / N og involverer opsplitning af det oprindelige cyclometalated Ir (III) chlor-broforbundne dimer i to ækvivalenter af den solvatiserede kompleks. For at bekræfte specificiteten blev adskillige aminosyrer probet for koordination aktivitet ved tilsætning til den syntetiserede probe og kun histidin fremkaldes et signal respons. Brug af BNT-II, en forgrenet peptid efterligner af malaria biomarkør Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) blev iridium sonden valideret som et redskab til HRP-II afsløring. Quenching virkninger blev bemærket i BNT-II / IR1 titrering sammenlignet med L-histidin / IR1, men disse blev tilskrevet sterisk hindring og triPlet state quenching. Biolayer interferometri blev anvendt til bestemmelse realtid kinetik for interaktion af IR1 med BNT-II. Når systemet er optimeret, blev detektionsgrænse rcHRP-II ved hjælp af sonden sig at være 12,8 nM i opløsning. Når dette protein blev immobiliseret på overfladen af ​​en 50 um magnetisk agarose partikel, var detektionsgrænsen 14,5 nM. Den robuste signal reaktion af denne uorganiske probe, såvel som dens fleksibilitet i anvendelsen i opløsning eller immobiliseret på en overflade, kan egner sig mod en lang række applikationer, fra diagnostisk anvendelse til billeddannelse.

Introduction

Kolorimetrisk og fluorescerende mærkning er en vigtig metode til påvisning og sporing af biokemiske molekyler og processer 1,2. De mest almindelige fluorescerende markører er lavmolekylære organiske farvestoffer 3,4, men disse molekyler har ikke altid ideelle optiske egenskaber. Fluorescerende farvestoffer er tilbøjelige til fotoblegning, ofte har små Stokes skift, og kan have overlappende excitation og emission spektre. Kolorimetrisk mærkning opnås ofte ved anvendelse af enzymatiske mærker, som har et forstærket signal nyttig i immunoassay kvantificering 5,6. Disse enzymer har også deres ulemper, herunder lysfølsomhed, reaktionsbetingelser og korte substrat holdbarhed. Disse egenskaber tendens til at kræve immunassays og protein mærkning metoder, der skal gøres under velkontrollerede forhold ved hjælp af dyre reagenser.

Emissionsforårsagende overgang-metalkomplekser er blevet udforsket som en alternativ mærkning tilgang for biokemisk detektion. Især cyclometalated Ir (III) er blevet undersøgt i forbindelse med organiske lysdioder (OLED) 7-9 oxygen sensing 10, katalyse 11, og protein / celle farvning 12-14. Høj fotostabilitet og kvante effektivitet gør denne klasse af prober en god kandidat til biomolekyle detektion 15,16. Det blev tidligere vist sig, at cyclometalated Ir (III) komplekser, af formen [Ir (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, irreversibelt binder histidin og fremkalde en blågrøn signal respons 12,17. Disse komplekser er ikke-emitterende i solvento tilstand, men når histidin forskyder opløsningsmiddelmolekylerne og binder til metallet centrum, de frigiver en intens phosphorescerende signal efter langbølget UV-bestråling. Dette signal forekommer kun efter ligand substitution, og er resultatet af en triplet state elektron afslappende til grundtilstanden gennem aktivering af metal-ligand ladningsoverførsel (3 mlCT) og ligand centreret overførsel (3 LC) veje 8,15. Disse komplekser kan potentielt anvendes som detektionsprober for histidin-rige proteiner.

Histidin-rige proteiner og deres regulering niveauer er vigtige i mange sygdomme, herunder levercirrose, cancer og thrombemasse lidelser. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) i særdeleshed er en velvalideret biomarkør for malariaparasitten infektion. Dette protein er 67 kDa og indeholder 34% histidin, hovedsagelig inden karakteristiske AHHAHHAAD gentage motiver 19. Disse histidin gentagelser kan binde frit metalioner 19 og hæm komplekser 20 i vært blod. pfHRP-II er almindeligt påvist i indstillinger ressourcesvage hjælp immunkromatografiske hurtige diagnostiske test (RDTs), men disse test er ofte unøjagtige på grund af prøven betingelser, lav biomarkør koncentration, dårlige produktionsstandarder og antistof nedbrydning 21.

2 (H2O) 2] + (IR1) for at detektere BNT-II, en forgrenet peptid efterligner af pfHRP-II er udforsket 22. Kinetik af denne interaktion blev overvåget i realtid under anvendelse biolayer interferometri teknikker. Assayet blev også tilpasset til en on-bead ELISA-typen format, hvor nanomolære påvisningsgrænser blev nået. Dette assay rummer fordele sammenlignet med traditionelle ELISA'er fordi den kan udføres på under 2 timer med antistof-fri reagenser, i stedet for de 4-5 timer og biologiske reagenser, der er nødvendige med typiske ELISA'er.

Protocol

1. Syntese af Iridium (III) kompleks

  1. Afvej 53,6 mg (50 pmol) [lr (ppy) 2 Cl] 2 og opløses i 5 ml methylenchlorid. Tilføje denne opløsning til en 50 ml Erlenmeyer kolbe forsynet med en omrører.
  2. Afvej 26,2 mg (100 pmol) AgOTf og opløses i 5 ml methanol.
  3. Tilsæt opløst AgOTf til [Ir (ppy) 2-Cl] 2-opløsning og omrør i 1 time.
    Bemærk: En cremefarvet gylle bør resultere.
  4. Efter 1 time filtreres opslæmningen gennem silicagel i en 25 x 95 mm dram hætteglas og inddampes resterende opløsningsmiddel under anvendelse af en rotationsfordamper (5-10 min).
  5. Når det meste af opløsningsmidlet fjernes, kontrolleres, at en olieagtig gul remanens forbliver i hætteglasset. Til denne remanens, tilsættes 1 ml methanol for at genopløse produktet og lyofiliser 1-2 dage til opnåelse af gult fast produkt.
  6. Karakterisere Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + produkt (IR1) ved H <sup> 1 NMR (i CDCI3), ESI og UV-Vis som tidligere beskrevet. 23

2. Interaktioner af IR1 med forskellige aminosyrer

  1. Forbered en 2 mM opløsning af IR1 i methanol (MW 537,10 g / mol). Vortex for at sikre fuldstændig opløsning af det faste stof.
  2. Fremstilling af 100 uM opløsninger af de følgende aminosyrer og biomolekyler i HEPES-bufret saltvand (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val.
  3. Tilsæt 100 pi af hver aminosyre i en sort 96-brønds plade. Tilsættes 100 pi HBS til pladen for at tjene som en blank.
  4. Tilføje 2,5 pi af 2 mM IR1 opløsning til hver prøve og ryst pladen på en pladeryster i 10 min.
  5. Efter 10 min erhverve emissionsspektrene af prøverne ved anvendelse af en 96-brønds plade-læser (365 ex / 400-700 em).
    1. Pladen anbringes i instrumentet og åbn pladelæseren software til at oprette et nyt eksperiment.
    2. Sæt den nye experiment at læse en fluorescens-scanning med en excitationsbølgelængde på 365 nm og en spaltebredde på 9 nm med optik på den øverste position.
    3. Læs emission 300-700 nm med et trin størrelse på 5 nm.
    4. Eksportere data til dataanalyse.
  6. Overfør prøverne til en klar plade med 96 brønde og billede emissionen under anvendelse af en UV-transilluminator.

3. Titrering af IR1 med BNT-II

  1. Der fremstilles en 1 mM stamopløsning af BNT-II (MW 8233,6 g / mol) i HBS samt en 2 mM opløsning af IR1 i methanol.
  2. Fra stamopløsningen, forberede 1 ml 100 uM BNT-II i HBS. Vortexes mikrocentrifugerør at sikre prøven er blandet.
  3. Serielt fortynde 100 uM BNT-II med halvdelen i HBS til en slutkoncentration på 1,56 uM BNT-II.
  4. Tilsættes 100 pi af hver fortynding, i tre eksemplarer, med HBS tjener som en tom, til brøndene i en plade med 96 brønde. Til hver prøve tilsættes 2,5 pi 2 mM IR1.
  5. Shake pladen i 10 minutter på en pladeryster.
  6. Efter omrystning læse emissionsintensiteten ved 510 nm (excitation ved 365 nm) ved anvendelse af en 96-brønds plade-læser.
    1. Pladen anbringes i instrumentet og åbn pladelæseren software til at oprette et nyt eksperiment.
    2. Indstil nyt eksperiment til at læse en fluorescens endepunkt med en excitationsbølgelængde på 365 nm og emissionsbølgelængde på 510 nm. Indstil spaltebredde for begge bølgelængder til 9nm, med optik på den øverste position.
    3. Læs pladen og eksportere data til analyse.
  7. Overfør prøverne til en klar plade med 96 brønde og billede titreringen ved anvendelse af en UV-transilluminator.

4. Real-time Kinetic Analyse af IR1 / BNT-II System Brug Biolayer interferometri

  1. Tilsæt 200 pi kinetisk buffer (KB; 1x phosphatpufret saltopløsning med 0,02% Tween-20) til 8 brønde i den første søjle i en sort 96-brønds plade og sæt pladen i plasten sensorholder. Overføre omhyggeligt 8 Ni (II) NTA biosensorer til den første kolonne i plastholder, således at spidserne suspenderes i brøndene i puffer. Placer plastholder i venstre side af interferometri instrument.
  2. Forbered en 2 ml af en 0,5 uM opløsning af BNT-II i KB.
  3. Forbered 500 pi af en 10 pM opløsning af IR1 i KB, og serielt fortyndet til det halve ned til 0,156 pM i KB.
  4. Til en ny sort plade med 96 brønde, pipette 200 pi KB til alle 8 brønde i kolonne A og C.
  5. I den samme plade, pipette 200 pi af 0,5 uM BNT-II-opløsning til brøndene i kolonne B.
  6. Afpipetteres 200 pi af hver fortynding af IR1 i kolonne D, begyndende med KB som blind i brønd D1. Tilsæt fortyndinger, således at brøndene stige i IR1 koncentration gennem kolonnen.
  7. Placer denne plade i instrumentet til højre for plade indeholdende de forudgående befugtning sensorer.
  8. I biolayer interferometri software, der er nedsat en grundlæggende Kinetic eksperiment ved at definere plade, assay, og sensor tips.
    1. For at definere pladen, skal du vælge en kolonne på skærmen, højreklik, og vælg den relevante definition for brøndene. Vælg "Buffer" for kolonne A og C, "Load" for kolonne B, og "Sample" for kolonne D.
    2. Definer analysen i næste fane ved at tilføje følgende trin (Klik på "Tilføj"): Ækvilibrering (Custom), 60 sek; Lastning, 120 sek; Baseline, 60 sek; Association, 120 sek; og Dissociation, 300 sek. Vælg Ækvilibrering trin, og dobbeltklik på kolonne A. Gentag for Loading (kolonne B), Baseline (kolonne C), Association (kolonne D), og Dissociation (kolonne C). Vælg de Ni (II) NTA sensorer.
    3. Flyt til den næste fane, og bekræfter, at sensorerne er i kolonne A på indehaveren af ​​plast sensor.
    4. Bekræft eksperimentet er skitseret korrekt, skal du indsætte et filnavn, sikre, at "forsinkelse eksperiment" er markeret, og tryk på "Go".
      Note: På grund af den automatiske karakter af instrumentet, når den kinetiske eksperiment er skitseret, vil forekomme trinene som programmeret.
  9. Når den kinetiske løb er afsluttet, behandle data i den medfølgende behandling software.
    1. Dobbeltklik på mappen med filnavnet af interesse i den nederste del af panelet til venstre. Derefter skal du dobbeltklikke på den tilsvarende mappe under "Kinetics" i den øverste del af panelet. Flyt til fanen Processing.
    2. Kontroller Subtraktion til venstre for at åbne skærmen til valg sensor. Højreklik på godt A4 og ændre brønden type reference Well.
    3. Marker afkrydsningsfeltet ved siden af ​​Juster Y-aksen, og sikre det valgte trin er Baseline. Angiv tidsintervallet for at være den sidste fem sekunder af baseline (ca. 55-60 sek).
    4. Marker afkrydsningsfeltet for Inter-trins Rettelse og vælg Juster til Dissociation. Sørg for, at Savitzky-Golay Filtrering er markeret, og tryk på "Process data! ̶1;
    5. Flyt til fanen Analysis. Sikre, at "Association og Dissociation" er udvælgelsen for skridt til at analysere og at Model er 1: 1. Vælg en lokal, Full pasform og trykke på "Fit Kurver!"
    6. Fremhæv alle kurver i tabellen og højreklik for at indstille alle kurver til en farve. Dernæst skal du vælge en global (Full) fit, grupperet efter farve og Rmax Unlinked af Sensor. Tryk på "Fit Kurver!" For at opnå globale kinetik data.

5. On-bead Påvisning af BNT-II og rcHRP-II med IR1

  1. Forberede 1 ml hver af en 1 uM opløsning af BNT-II og rcHRP-II i HBS med Tween (HBST; HBS med 0,025% Tween 20).
  2. Serielt fortynde hvert protein med halvdelen i HBST til en slutkoncentration på 15,6 nM.
  3. Afpipetteres 100 pi af hver fortynding i tre eksemplarer i en hvid plade med 96 brønde, med fortyndinger i rækkefølge fra laveste til højeste koncentration ned en kolonne.
  4. Afpipetteres 10 pi 50 pm Ni (II) NTA magnetiske agarosepartikler ind hver fortynding godt.
    1. Vortexes mikrocentrifugerør indeholdende de magnetiske partikler efter hver pipettering at sikre partiklerne forblive suspenderet.
  5. Pladen anbringes på en pladeryster i 15 min for at inkubere prøverne med partiklerne.
  6. Efter denne inkubationsperiode placere pladen på en 96-brønds plade magnet og vente 30 sekunder for partiklerne at trække sig ud af opløsning.
  7. Ved hjælp af en multikanal pipette, pull off den oprindelige prøve og kassér som affald. Fjern pladen fra magneten.
  8. Tilsæt 200 pi HBST til hver brønd ved hjælp af multikanalpipette. Pump bufferen op og ned flere gange for at vaske de magnetiske partikler.
  9. Pladen tilbage på magneten og vente 30 sekunder for partiklerne at trække sig ud af opløsning.
  10. Brug af multikanal pipette, pull off de 200 ul buffer og kassér som affald. Fjern pladen fra magneten.
  11. Gentag trin 5.8 through 5.10 to gange for at fuldføre tre vaskninger af partiklerne.
  12. Tilsættes 100 pi HBST til hver brønd indeholdende magnetiske partikler efterfulgt af 2,5 pi 2 mM IR1.
  13. Inkubere partiklerne med IR1 på en pladeryster i 1 time.
  14. Efter 1 time læse emissionsintensiteten ved 510 nm (excitation ved 365 nm) ved anvendelse af en 96-brønds plade-læser.
    1. Pladen anbringes i instrumentet og åbn pladelæseren software til at oprette et nyt eksperiment.
    2. Indstil nyt eksperiment til at læse en fluorescens endepunkt med en excitationsbølgelængde på 365 nm og emissionsbølgelængde på 510 nm. Indstil spaltebredde for begge bølgelængder til 9 nm, med optik på den øverste position.
    3. Læs pladen og eksportere data til analyse.
  15. Overfør prøverne til en klar plade med 96 brønde og billede titreringen ved anvendelse af en UV-transilluminator.

Representative Results

Som vist i figur 1, syntese af IR1 solvento-kompleks involveret spaltning af chloridet bro i forælder dimer ved udfældning af chloridet i form af uopløselige AgCl og association af vandmolekyler til metallet centrum. Dannelsen af IR1 blev bekræftet ved H 1 NMR og ESI. Derudover blev UV-synlige bånd karakteristiske for metal-ligand ladningsoverførsel og π-π * overgange tildelt spektret, yderligere validering dannelsen af IR1. Dette opløste komplekse udviser ingen emitterende karakter, når ophidset ved 365 nm.


Figur 1
Figur 1:. Syntese og karakterisering af IR1 Chloride bro opdeling omsætning af Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) phenyl) diiridium (III) for at oprette aquo kompleks Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1). Ved tilsætning af L-His til aquo kompleks i vandig buffer, er luminescerende signal tændt.

Når komplekset blev syntetiseret og karakteriseret, blev aminosyresekvensen selektivitet analyseret som tidligere beskrevet under anvendelse af en lignende iridium analog 17. Figur 2A viser, at kun histidin fremkaldes et signal respons ved 510 nm, når den exciteres ved 365 nm.


Figur 2
Figur 2: Amino Acid Selektivitet og Titrering af IR1 med Histidin Rich Peptider (A) Interaktion af 200 uM af forskellige aminosyrer (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) med 50 uM. IR1 i HBS. Spektrale scanninger blev taget 400-700 nm ved en excitationsbølgelængde på 365 nm i en sort 96-brønds plade. Signal i relative fluorescensenheder (RFU) fra alle aminosyrer besides histidin (stiplet sort trace) var ubetydelig. (B) nanomolære koncentrationer af BNT-II (▪) og rcHRP-II (♦) blev titreret med IR1 i HBS. Histidin rige peptider blev inkuberet med proben i 15 minutter i opløsningen inden aflæsning af emission ved 510 nm efter excitation med 365 nm lys. Detektionsgrænse blev beregnet som værdien af x, når y = 3σ tom.

Denne "on-switch" af phosphorescens af iridium proben forekommer, fordi singlet exciterede tilstand (1 MLCT'er / 1 LC) af Ir (III) biokonjugatet undergår intersystemkrydsning til den exciterede triplet tilstand (3 MLCT'er), når histidin koordineres til metallet centrum. Denne probe blev anvendt til BNT-II et peptid efterligner af malaria biomarkør Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pf HRP-II). I en titrering af BNT-II med IR1 blev en koncentrationsafhængig signal respons observeret ( D i IR1 binding til BNT-II immobiliseret på en Ni (II) NTA overflade viste sig at være 2,05 pM (figur 3).

Figur 4

Figur 3: Real-time Kinetic Analyse af IR1 med BNT-II Biolayer interferometri til kinetisk analyse af forskellige koncentrationer af IR1 binding til BNT-II på overfladen af en Ni (II) NTA glas sensor.. Efter ækvilibrering sensorerne i KB (Region A), er sensorerne fyldt med 0,5 uM BNT-II (region B). Når peptidet er indlæst på sensorerne, er en basislinje etableret (Region C) før måling af associeringen af ​​IR1 til BNT-II (Region D). Efteren periode med foreningen, er følerne placeres tilbage i KB for at måle dissociation (Region E). Hele kinetisk analyse processen tager mindre end 30 minutter.

Hvor der skiftes fra en opløsning assay til en magnetisk partikel platform, den ekstra kompleksitet af partiklen i systemet skulle tages i betragtning. Det var kendt fra tidligere arbejde, at disse partikler effektivt binde malaria biomarkør pf HRP-II. 24 Sort fluorescerende plader arbejdede godt for opløsningen assayet beskrevet ovenfor, men hvide plader var bedre egnet til on-partikel afsløring platform, som det ses i figur 4A. I en hvid plade, er det lys, der reflekteres tilbage ind i prøven, hvilket således giver mulighed for bedre absorbans ved IR1 bundet til overfladen af ​​partiklen. I on-partiklen assay, detektionsgrænsen af rcHRP-II var bestemt til at være 14,5 nM (figur 4B). Detektionsgrænsen for rcHRP-II in-løsning, og on-perle var statimatisk samme baseret på en uparret t-test (p = 0,731).

Figur 5
Figur 5


Figur 4:. On-perle Påvisning af BNT-II og HRP-II (A) Forskel mellem signalet detekteres fra IR1 bundet til BNT-II på overfladen af 50 um Ni (II) NTA magnetiske agarosepartikler i en sort 96- brønds plade (optrukket linje) versus en hvid plade med 96 brønde (stiplet linie). Partiklerne blev exciteret med 365 nm lys, og emission blev målt ved 510 nm. (B) Titrering af rcHRP-II immobiliseret på de magnetiske partikler og påvist under anvendelse af IR1. Detektionsgrænse blev beregnet som vaLue af x, når y = 3σ tom.

Figur 5

Figur 5: Skematisk repræsentation On-perle Påvisning af rcHRP-II med IR1 almindelige opbygning af HRP-II binding til overfladen af Ni (II) NTA partikler og mærket med IR1.. Partiklerne inkuberes med en histidin rig peptid i 15 min. Efter denne inkubationsperiode partiklerne vasket med HBST anvendelse af en magnet, for at trække partiklerne ud af opløsning. Endelig er de peptid-bundne partikler inkuberet med IR1 i 1 time inden aflæsning af emission ved 510 nm efter excitation med 365 nm lys.

Discussion

Som mikropartikler-baserede diagnostiske værktøjer kommer til forkant med moderne diagnostiske teknologi, afsløring af target biomolekyler direkte på overfladen af ​​partiklen er en stor fordel. Traditionelle molekylære påvisningsmetoder, såsom ELISA og PCR, er fordelagtige, idet de kan opnå meget lave påvisningsgrænser 25. Men disse analyser kræver omfattende reagenser og langvarige protokoller. Dette assay blev designet til at efterligne ELISA-type sandwich-interaktioner uden klokkeslæt og reagens krav (figur 5). Desuden blev omkostningerne ved IR1 sonde per prøve anslås at være omkring en krone, mens prisen på antistoffer for en typisk ELISA er $ 0,20-0,30 per prøve.

Da de ovenfor beskrevne metoder er afhængige af en cyclometalated iridium probe til påvisning af malaria biomarkør, ville denne probe ikke være modtagelige for failure modes fælles for andre påvisningsmetoder (ie. Fluorofor quenching og antistof / enzym nedbrydning). Histidin er enestående i sin metal-bindende egenskaber. Den skitserede arbejde drager fordel af dette fænomen ved at erstatte de antistoffer i en typisk ELISA sandwich med metalholdige komplekser. Ni (II) NTA indfanger rcHRP-II på overfladen af ​​partiklen og IR1 angiver tilstedeværelsen af ​​proteinet. Det mest kritiske trin i assayet er at tillade de magnetiske partikler blandes med prøven og proben. I en 96-brønds plade ELISA, biomolekylerne og reagenser nå ligevægt med den todimensionelle overflade på bunden af ​​brønden. Magnetiske partikler har tendens til at bundfælde fra opløsningen på grund af deres tætte jern-oxid kerne, hvilket ville reducere de tilgængelige bindingssteder. Således skal partiklerne blandes under assayet for at opnå maksimal binding.

Når du designer en reagens til sygdomsdiagnostik, må man huske på form af patientprøve samt den fysiologiske koncentration af biomarkør. Tilmalaria, kan koncentrationen af pf HRP-II i en patients blod variere fra lav til høj picomolær nanomolær. Mens dette assay er klinisk relevant for højere niveauer af infektion, skal forbedres for at opdage asymptomatiske patienter med lav picomolær cirkulerer pf HRP-II detektionsgrænsen. I fremgangsmåderne skitseret ovenfor, er "switch-on" signal frembragt af IR1 forekommer i nærvær af histidin. Mens malaria biomarkør er rig på histidin, andre serumproteiner, såsom humant serumalbumin og histidin rig glycoprotein, ville fremkalde et signal respons med proben. Dette ville til gengæld føre til falske positive diagnoser. Dette gør indfangning af proteinet på overfladen af ​​partiklen en gavnlig skridt, ved, at proteinet af interesse kan hurtigt ekstraheret fra en patientprøve. Derudover designe et bifunktionelt probe, der kobler en histidin rig peptid til en robust molekylær genkendelse element (dvs.. Aptamer) Kunne tilføje endnu et lag af specificitet til assayet. Peptidet ville blive belastet med iridium før kobling til aptameren. I en sådan udformning kan den stabile IR1 sonden stadig anvendes samtidig opfylde målspecificitet med aptamer. Dette ville muliggøre anvendelse af proben til påvisning af nativt HRP-II i et kompleks matrix (plasma eller fuldblod ie.) Og reducere uspecifik binding virkninger. For yderligere at forstærke signalet af hurtige diagnostiske test, kan analysen inkorporeres i et system, elektro (ECL), hvor pf HRP-II kan detekteres på RDTs som en elektrokemisk udlæsning 26. Denne næste generation iridium sonde ville i høj grad øge vores on-bead ELISA-assay til påvisning af sygdomstilstande biomarkører.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
Iridium (III) Luminescent Probe for Påvisning af malaria Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter