Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Diese Arbeit beschreibt die Synthese einer nicht-emittierende cyclometallierte Ir (III) -Komplexes, Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), die eine schnelle und langlebiges phosphoreszierende Signal auslöst, wenn sie einem Histidin koordiniert enthaltenden Proteins auf der Oberfläche eines magnetischen Partikels immobilisiert. Synthese von Ir1, in hohen Ausbeuten, ist eine vollständige O / N und beinhaltet das Teilen des Muttercyclometallierten Ir (III) Chlor-verbrückten Dimer in zwei Äquivalente des solvatisierten Komplexes. Um die Spezifität zu bestätigen, wurden mehrere Aminosäuren, die für die Koordination Aktivität untersucht, wenn auf das synthetisierte Sonde aufgenommen und nur Histidin löste eine Signalantwort. Verwendung BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum Malaria Biomarker histidinreichem Protein II (pfHRP-II), wurde das Iridium-Sonde als ein Werkzeug für HRP-II Detektions validiert. Abschrecken Effekte wurden im BNT-II / Ir1 Titration festgestellt, wenn im Vergleich zu L-Histidin / Ir1, diese wurden auf sterische Hinderung und Tri zurückzuführenPlet Zustand Abschrecken. Bioschicht Interferometrie wurde verwendet, um in Echtzeit die Kinetik der Wechselwirkung des Ir1 mit BNT-II zu bestimmen. Sobald das System optimiert wurde die Nachweisgrenze von rcHRP-II unter Verwendung der Sonde festgestellt, daß 12,8 nM in Lösung sein. Wenn dieses Protein auf der Oberfläche einer 50 um magnetische Agarose Teilchen immobilisiert, die Nachweisgrenze lag bei 14,5 nM. Die robuste Signalantwort dieses anorganischen Sonde sowie ihre Flexibilität im Einsatz in Lösung oder auf einer Oberfläche immobilisiert ist, kann sich in Richtung auf eine Vielzahl von Anwendungen verleihen, aus diagnostischen Anwendung zur Bilderzeugung.
Kolorimetrischen und Fluoreszenzmarkierung ist eine wichtige Methode zur Detektion und Verfolgung von biochemischen Molekülen und verarbeitet 1,2. Die häufigsten Fluoreszenzmarker sind solche niedermolekularen organischen Farbstoffe 3,4, aber diese Moleküle nicht immer ideal optische Eigenschaften. Fluoreszenzfarbstoffe sind anfällig gegen Ausbleichung, haben oft geringe Stokes-Verschiebungen und können überlappende Anregungs- und Emissionsspektren haben. Kolorimetrischen Markierung wird oft durch den Einsatz von enzymatischen Markierungen, die ein verstärktes Signal nützlich Immunoassay Quantifizierung 5,6 erreicht. Diese Enzyme haben auch ihre Nachteile, einschließlich der Lichtempfindlichkeit, den Reaktionsbedingungen und kurzen Substrat Haltbarkeit. Diese Eigenschaften sind in der Regel Immunoassays und Proteinmarkierungsmethoden benötigen, um unter kontrollierten Bedingungen mit teuren Reagenzien durchgeführt werden.
Emittierenden Übergangsmetallkomplexe wurden als Alternative Kennzeichnung Ansatz fo erforschtr biochemischen Nachweis. Insbesondere cyclometallierten Ir (III) wurde im Rahmen von organischen Leuchtdioden (OLEDs) 7-9 Sauerstofferfassungs 10 untersucht, Katalyse 11 und Protein / Zellfärbung 12-14. Hohe Photostabilität und Quantenausbeute machen diese Klasse von Sonden ein guter Kandidat für Biomolekül-Erkennungs 15,16. Es wurde vorher festgestellt, dass Ir cyclometallierten (III) -Komplexe, der Form [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, irreversibel binden, Histidin und rufen eine blau-grüne Signalantwort 12,17. Diese Komplexe sind nicht emittierenden in Solvenskomplex Zustand, aber wenn Histidin verdrängt die Lösungsmittelmoleküle und bindet an das Metallzentrum, ein intensives Phosphoreszenzsignal nach langwellige UV-Strahlung freisetzen sie. Dieses Signal erst nach Ligandensubstitution, und ist das Ergebnis von einem Triplett-Zustand Elektronen Entspannung in den Grundzustand durch die Aktivierung von Metall-Ligand-Charge-Transfer (3 MLCT) und Liganden zentriert Transfer (3 LC) Pfade 8,15. Diese Komplexe können potentiell als Nachweissonden für Histidin-reiche Proteine verwendet werden.
Histidin-reiche Proteine und deren Regulation Ebenen sind wichtig für viele Krankheiten, darunter Leberzirrhose, Krebs und thrombische Störungen. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) ist insbesondere ein gut validierten Biomarker für die Malaria-Parasiten-Infektion. Dieses Protein ist 67 kDa und enthält 34% Histidin, meist innerhalb charakteristischen AHHAHHAAD wiederholende Motive 19. Diese Wiederholungen können Histidin freien Metallionen zu binden 19 und Häm-Komplexe 20 in Wirts Blut. pfHRP-II wird gewöhnlich in geringen Ressourceneinstellungen mit immunchromatographischen Schnelldiagnosetests (RDTs) erkannt, aber diese Tests sind oft ungenau aufgrund der Probenbedingungen, niedrige Biomarker-Konzentration, schlechte Fertigungsstandards und Antikörperabbau 21.
<p class="Jove_content"> Metall basierende phosphoreszierende Sonden wie cyclometallier- Ir (III) oben beschriebenen Komplexe sind attraktive Möglichkeiten für den Nachweis von pfHRP-II aufgrund ihrer selektiven Bindung von Histidin und deren stabile und effiziente Emissionseigenschaften. In diesem Dokument ist die Verwendung von [Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) zu BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum pfHRP-II erforscht 22 detektieren. Kinetik dieser Interaktion in Echtzeit mit Bioschicht Interferometrie-Techniken überwacht. Der Test wurde auch mit einem on-bead ELISA-Typ-Format, bei nanomolaren Nachweisgrenzen erreicht wurden angepasst. Dieser Test hat das Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISAs, da es in weniger als 2 Stunden mit dem Antikörper-freie Reagenzien durchgeführt werden, anstelle der 4-5 h und biologischen Reagenzien mit typischen ELISAs erforderlich.Als Mikropartikel-basierten Diagnosewerkzeuge kommen, um die Spitze der modernen Diagnose-Technologie, ist Nachweis von Ziel-Biomolekülen direkt auf der Oberfläche des Partikels ein großer Vorteil. Sind die traditionellen molekularen Nachweisverfahren, wie ELISA und PCR, vorteilhaft, da sie sehr niedrige Nachweisgrenze 25 erreichen. Diese Tests erfordern jedoch umfangreiche Reagenzien und langwierige Protokolle. Dieser Test wurde entwickelt, um Sandwich-ELISA-Typ-Wechselwirkungen, ohne Zeit und Reagenz Anforderungen (Abbildung 5) zu imitieren. Zusätzlich wurde die Kosten des Ir1 Sonde pro Probe auf etwa einen Cent, wohingegen die Kosten für die Antikörper für einen typischen ELISA ist $ 0,20-0,30 pro Probe.
Da die oben beschriebenen Verfahren beruhen auf einer cyclometallier- Iridium Sonde zur Detektion des Malaria Biomarker würde diese Sonde nicht anfällig für Fehlerarten gemeinsam mit anderen Nachweismethoden (d. Fluorophor quenchi seinng und Antikörper / Enzymabbau). Histidin ist in seiner Metallbindungseigenschaften einzigartig. Die skizzierten Arbeits nutzt dieses Phänomen durch Ersetzen der Antikörper in einem typischen Sandwich-ELISA mit Metall enthaltende Komplexe. Ni (II) NTA erfasst rcHRP-II auf der Oberfläche des Partikels und Ir1 signalisiert die Anwesenheit des Proteins. Der wichtigste Schritt im Assay ist damit die magnetischen Partikel mit der Probe und der Sonde mischen. In einer 96-Well-Platte ELISA die Biomoleküle und Reagenzien erreichen Gleichgewicht mit der zweidimensionalen Oberfläche des Boden des Bohrlochs. Magnetpartikel haben die Tendenz, aus der Lösung absetzen aufgrund ihrer dichten Eisenoxid-Kern, der die verfügbaren Bindungsstellen reduzieren würde. Daher müssen die Teilchen während des Assays Zeit gemischt werden, um eine maximale Bindung zu gewährleisten.
Bei der Gestaltung eines Reagenz zur Krankheitsdiagnose, muss man im Hinterkopf behalten die Form der Patientenprobe sowie die physiologische Konzentration der Biomarker. FürMalaria kann die Konzentration von PF-HRP-II in dem Blut eines Patienten zu günstigen picomolar hohe nanomolar variieren. Während dieser Assay für höhere Infektion klinisch relevant, die Nachweisgrenze muss, um auf asymptomatische Patienten mit niedrigen picomolar zirkulierenden pf HRP-II erkennen verbessert werden. In den oben beschriebenen Verfahren, der "Einschaltbereit" in der Gegenwart von Histidin durch Ir1 erzeugte Signal auftritt. Während die Malaria Biomarker ist reich an Histidin, andere Serumproteine, wie Humanserumalbumin und Histidin Glykoprotein, würde eine Signalantwort mit der Sonde hervorzurufen. Dies würde wiederum zu falsch positiven Diagnosen führen. Dies macht die Erfassung des Proteins auf der Oberfläche des Partikels eine vorteil Schritt, dass das Protein von Interesse kann schnell von einer Patientenprobe extrahiert werden. Zusätzlich Gestaltung eines bifunktionellen Sonde, dass Paare eine Histidin-reiche Peptid zu einem robusten molekulares Erkennungselement (dh. Aptamer), Könnte eine weitere Ebene der Spezifität des Tests hinzufügen. Das Peptid würde mit Iridium geladen werden, bevor die Kopplung an das Aptamer. Bei einer solchen Konstruktion kann die stabile Ir1 Sonde immer noch verwendet werden, während eine Zielspezifität mit dem Aptamer. Dies würde für die Anwendung der Sonde an nativen HRP-II in einer komplexen Matrix (d. Plasma oder Vollblut) zu ermitteln und verringern unspezifische Bindung Effekte erlauben. Um das Signal des schnellen Diagnosetests weiter zu verbessern, könnte der Test in eine elektrochemilumineszente (ECL) System, bei dem PF-HRP-II auf der RDTs als elektroAuslese 26 erfaßt werden eingearbeitet werden. Diese nächste Generation Iridium Sonde würde erheblich verbessern unsere On-Bead-ELISA-Test zum Nachweis von Biomarkern Krankheit.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |