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Chemistry

Iridium (III) Lumineszierende Sonde zum Nachweis von Malaria-Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Diese Arbeit beschreibt die Synthese einer nicht-emittierende cyclometallierte Ir (III) -Komplexes, Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), die eine schnelle und langlebiges phosphoreszierende Signal auslöst, wenn sie einem Histidin koordiniert enthaltenden Proteins auf der Oberfläche eines magnetischen Partikels immobilisiert. Synthese von Ir1, in hohen Ausbeuten, ist eine vollständige O / N und beinhaltet das Teilen des Muttercyclometallierten Ir (III) Chlor-verbrückten Dimer in zwei Äquivalente des solvatisierten Komplexes. Um die Spezifität zu bestätigen, wurden mehrere Aminosäuren, die für die Koordination Aktivität untersucht, wenn auf das synthetisierte Sonde aufgenommen und nur Histidin löste eine Signalantwort. Verwendung BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum Malaria Biomarker histidinreichem Protein II (pfHRP-II), wurde das Iridium-Sonde als ein Werkzeug für HRP-II Detektions validiert. Abschrecken Effekte wurden im BNT-II / Ir1 Titration festgestellt, wenn im Vergleich zu L-Histidin / Ir1, diese wurden auf sterische Hinderung und Tri zurückzuführenPlet Zustand Abschrecken. Bioschicht Interferometrie wurde verwendet, um in Echtzeit die Kinetik der Wechselwirkung des Ir1 mit BNT-II zu bestimmen. Sobald das System optimiert wurde die Nachweisgrenze von rcHRP-II unter Verwendung der Sonde festgestellt, daß 12,8 nM in Lösung sein. Wenn dieses Protein auf der Oberfläche einer 50 um magnetische Agarose Teilchen immobilisiert, die Nachweisgrenze lag bei 14,5 nM. Die robuste Signalantwort dieses anorganischen Sonde sowie ihre Flexibilität im Einsatz in Lösung oder auf einer Oberfläche immobilisiert ist, kann sich in Richtung auf eine Vielzahl von Anwendungen verleihen, aus diagnostischen Anwendung zur Bilderzeugung.

Introduction

Kolorimetrischen und Fluoreszenzmarkierung ist eine wichtige Methode zur Detektion und Verfolgung von biochemischen Molekülen und verarbeitet 1,2. Die häufigsten Fluoreszenzmarker sind solche niedermolekularen organischen Farbstoffe 3,4, aber diese Moleküle nicht immer ideal optische Eigenschaften. Fluoreszenzfarbstoffe sind anfällig gegen Ausbleichung, haben oft geringe Stokes-Verschiebungen und können überlappende Anregungs- und Emissionsspektren haben. Kolorimetrischen Markierung wird oft durch den Einsatz von enzymatischen Markierungen, die ein verstärktes Signal nützlich Immunoassay Quantifizierung 5,6 erreicht. Diese Enzyme haben auch ihre Nachteile, einschließlich der Lichtempfindlichkeit, den Reaktionsbedingungen und kurzen Substrat Haltbarkeit. Diese Eigenschaften sind in der Regel Immunoassays und Proteinmarkierungsmethoden benötigen, um unter kontrollierten Bedingungen mit teuren Reagenzien durchgeführt werden.

Emittierenden Übergangsmetallkomplexe wurden als Alternative Kennzeichnung Ansatz fo erforschtr biochemischen Nachweis. Insbesondere cyclometallierten Ir (III) wurde im Rahmen von organischen Leuchtdioden (OLEDs) 7-9 Sauerstofferfassungs 10 untersucht, Katalyse 11 und Protein / Zellfärbung 12-14. Hohe Photostabilität und Quantenausbeute machen diese Klasse von Sonden ein guter Kandidat für Biomolekül-Erkennungs 15,16. Es wurde vorher festgestellt, dass Ir cyclometallierten (III) -Komplexe, der Form [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, irreversibel binden, Histidin und rufen eine blau-grüne Signalantwort 12,17. Diese Komplexe sind nicht emittierenden in Solvenskomplex Zustand, aber wenn Histidin verdrängt die Lösungsmittelmoleküle und bindet an das Metallzentrum, ein intensives Phosphoreszenzsignal nach langwellige UV-Strahlung freisetzen sie. Dieses Signal erst nach Ligandensubstitution, und ist das Ergebnis von einem Triplett-Zustand Elektronen Entspannung in den Grundzustand durch die Aktivierung von Metall-Ligand-Charge-Transfer (3 MLCT) und Liganden zentriert Transfer (3 LC) Pfade 8,15. Diese Komplexe können potentiell als Nachweissonden für Histidin-reiche Proteine ​​verwendet werden.

Histidin-reiche Proteine ​​und deren Regulation Ebenen sind wichtig für viele Krankheiten, darunter Leberzirrhose, Krebs und thrombische Störungen. 18 Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pfHRP-II) ist insbesondere ein gut validierten Biomarker für die Malaria-Parasiten-Infektion. Dieses Protein ist 67 kDa und enthält 34% Histidin, meist innerhalb charakteristischen AHHAHHAAD wiederholende Motive 19. Diese Wiederholungen können Histidin freien Metallionen zu binden 19 und Häm-Komplexe 20 in Wirts Blut. pfHRP-II wird gewöhnlich in geringen Ressourceneinstellungen mit immunchromatographischen Schnelldiagnosetests (RDTs) erkannt, aber diese Tests sind oft ungenau aufgrund der Probenbedingungen, niedrige Biomarker-Konzentration, schlechte Fertigungsstandards und Antikörperabbau 21.

2 (H 2 O) 2] + (Ir1) zu BNT-II, einen verzweigten Peptid-Mimetikum pfHRP-II erforscht 22 detektieren. Kinetik dieser Interaktion in Echtzeit mit Bioschicht Interferometrie-Techniken überwacht. Der Test wurde auch mit einem on-bead ELISA-Typ-Format, bei nanomolaren Nachweisgrenzen erreicht wurden angepasst. Dieser Test hat das Vorteile gegenüber herkömmlichen ELISAs, da es in weniger als 2 Stunden mit dem Antikörper-freie Reagenzien durchgeführt werden, anstelle der 4-5 h und biologischen Reagenzien mit typischen ELISAs erforderlich.

Protocol

1. Synthese von Iridium (III) Complex

  1. Man wiegt 53,6 mg (50 umol) [Ir (ppy) 2 Cl] 2 und in 5 ml Methylenchlorid zu lösen. Fügen Sie diese Lösung auf eine 50 ml-Erlenmeyerkolben mit einem Rührstab ausgestattet.
  2. Man wiegt 26,2 mg (100 umol) AgOTf und in 5 ml Methanol aufzulösen.
  3. Fügen Sie den gelösten AgOTf in die [Ir (ppy) 2 Cl] 2 Lösung und rühren Sie 1 Stunde.
    Hinweis: Eine cremefarbene Aufschlämmung sollte zur Folge haben.
  4. Nach 1 Stunde filtriert man das Aufschlämmung durch Silicagel in ein 25 x 95 mm-Dram Phiole und abzudampfen restliche Lösungsmittel mit einem Rotationsverdampfer (5-10 min).
  5. Nachdem das meiste Lösungsmittel entfernt wird, prüfen Sie, ob eine ölige gelbe Rückstand in der Ampulle verbleibt. Zu diesem Rückstand, fügen Sie 1 ml Methanol wieder aufzulösen, um ein Produkt zu lyophilisieren und 1-2 Tage, um den gelben festen Produkts zu ergeben.
  6. Charakterisieren die Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + Produkt (Ir1) von H <sup> 1 NMR (in CDCl 3), ESI und UV-Vis wie zuvor beschrieben. 23

2. Wechselwirkungen von Ir1 mit verschiedene Aminosäuren

  1. Vorbereitung einer 2 mM Lösung von Ir1 in Methanol (MG 537,10 g / mol). Wirbel um eine vollständige Auflösung des Feststoffes zu gewährleisten.
  2. Vorzubereiten 100 uM Lösungen der folgenden Aminosäuren und Biomolekülen in HEPES-gepufferter Salzlösung (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCl, pH 7,4), Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Versuchen, Val.
  3. Je 100 & mgr; l jeder Aminosäure in einer schwarzen 96-Well-Platte. 100 l HBS auf die Platte als eine leere dienen.
  4. In 2,5 ul der 2 mM Ir1 Lösung zu jeder Probe und schütteln Sie die Platte auf einem Plattenschüttler für 10 min.
  5. Nach 10 Minuten erhalten die Emissionsspektren der Proben unter Verwendung eines 96-Well-Platten-Lesegerät (365 ex / em 400-700).
    1. Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments.
    2. Stellen Sie die neue experiment einen Fluoreszenz-Scan mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und einer Spaltbreite von 9 nm mit der Optik in der obersten Position zu lesen.
    3. Lesen der Emission von 300 bis 700 nm mit einer Schrittweite von 5 nm.
    4. Exportieren Sie die Daten für die Datenanalyse.
  6. Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Emission mit einem UV-Transilluminator.

3. Titration von Ir1 mit BNT-II

  1. Bereiten Sie eine 1 mM Stammlösung von BNT-II (MW 8233,6 g / mol) in HBS sowie eine 2 mM Lösung von Ir1 in Methanol.
  2. Von der Stammlösung, bereiten 1 ml von 100 uM BNT-II in HBS. Mischen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen, um sicherzustellen, die Probe wird gemischt.
  3. Seriell verdünnt das 100 uM BNT-II um die Hälfte in HBS auf eine Endkonzentration von 1,56 & mgr; M BNT-II.
  4. Füge 100 & mgr; l jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung mit HBS, die als eine leere, in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte. Zu jeder Probe, fügen 2,5 ul 2 mM Ir1.
  5. Shake die Platte für 10 Minuten auf einem Plattenschüttler.
  6. Nach dem Schütteln, lesen Sie die Emissionsintensität bei 510 nm (Anregung bei 365 nm) unter Verwendung einer 96-Well-Platten-Lesegerät.
    1. Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments.
    2. Den neuen Versuch, einen Fluoreszenz Endpunkt mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 510 nm gelesen. Stellen Sie die Schlitzbreite für beide Wellenlängen zu 9 nm, mit der Optik an der Spitzenposition.
    3. Lesen Sie die Platte und exportieren Sie die Daten für die Analyse.
  7. Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Titration mit einem UV-Transilluminator.

4. Echtzeit-kinetische Analyse der Ir1 / BNT-II System mit Bioschicht Interferometry

  1. Fügen Sie 200 ul der kinetischen Puffer (KB; 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,02% Tween-20) bis 8 Vertiefungen in der ersten Spalte einer schwarzen 96-Well-Platte und legen Sie die Platte in das KunststoffsensorHalter. Sorgfältig übertragen 8 Ni (II) NTA Biosensoren auf die erste Spalte in der Kunststoffhalter, so dass die Spitzen in die Vertiefungen der Puffer suspendiert. Setzen Sie die Kunststoffhalterung in der linken Seite der Interferometrie Instrument.
  2. Bereiten Sie eine 2 ml einer 0,5 & mgr; M Lösung von BNT-II in KB.
  3. Bereiten Sie 500 ul einer 10 & mgr; M Lösung von Ir1 in KB, und seriell um die Hälfte zu verdünnen bis 0,156 & mgr; M in KB.
  4. Auf eine neue schwarze Platte mit 96 Vertiefungen, Pipette 200 ul KB für alle 8 Wells in Spalte A und C.
  5. In der gleichen Platte, Pipette 200 ul des 0,5 uM BNT-II-Lösung in die Vertiefungen in Spalte B
  6. Je 200 ul jeder Verdünnung Ir1 in Spalte D, die mit KB als Rohling in gut D1. Fügen Sie die Verdünnungen so dass die Vertiefungen zu erhöhen in Ir1 Konzentration durch die Säule.
  7. Dieses Platte des Instruments in der rechten Seite der Platte mit den Vornetzen Sensoren.
  8. Im Bioschicht Interferometrie-Software, die Einrichtung eines Grund Kinetic Experiment durch die Definition der Platte, Test und Sensorspitzen.
    1. Um die Platte zu definieren, wählen Sie eine Spalte auf dem Bildschirm der rechten Maustaste, und wählen Sie die entsprechende Definition für die Brunnen. Wählen Sie "Buffer" für die Spalten A und C, "Load" für Spalte B und "Probe" für Spalte D.
    2. Definieren Sie den Test in der nächsten Registerkarte, indem Sie die folgenden Schritte (Klicken Sie auf "Hinzufügen"): Die Gleichgewichtseinstellung (Custom), 60 sec; Loading, 120 s; Baseline, 60 sec; Association, 120 s; und Dissoziation, 300 sec. Wählen Sie das Äquilibrierungsschritt und klicken Sie doppelt auf Spalte A. Wiederholen Sie zum Laden (Spalte B), Baseline (Spalte C), Association (Spalte D) und Dissoziation (Spalte C). Wählen Sie die Ni (II) NTA-Sensoren.
    3. Gehen Sie zum nächsten Reiter und bestätigen, dass die Sensoren in Spalte A auf der Plastiksensorhalter.
    4. Bestätigen Sie das Experiment richtig beschrieben ist, legen Sie einen Dateinamen an, sicherzustellen, dass "Verzögerung Experiment" markiert ist, und drücken Sie auf "Go".
      NAnmerkung: Durch die automatisierte Handhabung des Gerätes, sobald die kinetische Experiment wird ausgeführt, die Schritte vorkommen, wie programmiert.
  9. Sobald die kinetische Durchlauf abgeschlossen ist, verarbeitet die Daten in der vorgesehenen Verarbeitungssoftware.
    1. Doppelklicken Sie auf den Ordner mit dem Dateinamen des Interesses an dem unteren Abschnitt der Platte auf der linken Seite. Dann doppelklicken Sie auf den entsprechenden Ordner unter "Kinetics" im oberen Bereich der Frontscheibe. Gehen Sie zu der Registerkarte Verarbeitung.
    2. Überprüfen Sie die Subtraktion-Box auf der linken Seite, um den Sensor Auswahlbildschirm zu öffnen. Klicken Sie rechts auf gut A4 und ändern Sie den Typ und Referenz-Well.
    3. Markieren Sie das Kästchen neben der Y-Achse ausrichten und sicherstellen, dass die gewählte Stufe ist Baseline. Geben Sie den Zeitbereich, um die letzten fünf Sekunden der Basislinie (ca. 55-60 sec) sein.
    4. Markieren Sie das Kästchen für die Inter-Schritt-Korrektur und wählen Align zur Dissoziation. Stellen Sie sicher, dass die Savitzky-Golay-Filter Feld markiert ist, und drücken Sie "Process Data! ̶1;
    5. Gehen Sie zu der Registerkarte Analyse. Stellen Sie sicher, dass "Assoziation und Dissoziation" ist die Auswahl für die Schritte zu analysieren und, dass das Modell 1: 1. Wählen Sie einen lokalen, Ganz fit und drücken Sie "Fit Curves!"
    6. Markieren Sie alle Kurven in der Tabelle und der rechten Maustaste, um alle Kurven auf eine Farbe gesetzt. Als nächstes wählen Sie eine globale (Full) fit, nach Farbe und Rmax Unlinked von Sensor gruppiert. Drücken Sie auf "Fit Curves" globalen Kinetik Daten zu erhalten.

5. On-Bead Nachweis von BNT-II und rcHRP-II mit Ir1

  1. Vorbereitung jeweils 1 ml einer 1 & mgr; M Lösung von BNT-II und rcHRP-II in HBS mit Tween (HBST; HBS mit 0,025% Tween 20).
  2. Seriell jedes Protein verdünnt um die Hälfte in HBST bis zu einer Endkonzentration von 15,6 nM.
  3. Je 100 & mgr; l jeder Verdünnung in dreifacher Ausfertigung in einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen, die Verdünnungen in der Reihenfolge von der niedrigsten zur höchsten Konzentration nach unten eine Spalte.
  4. Je 10 & mgr; l von 50 um Ni (II) NTA Agarose magnetischen Teilchen in jeder Verdünnung gut.
    1. Mischen Sie den Mikrozentrifugenröhrchen die magnetischen Teilchen nach jedem Pipettieren enthält, um sicherzustellen, die Teilchen bleiben suspendiert.
  5. Legen Sie die Platte auf einem Plattenschüttler für 15 Minuten, um die Proben mit den Partikeln inkubiert.
  6. Nach dieser Inkubationszeit wird die Platte auf einer Platte mit 96 Vertiefungen Magneten und warten Sie 30 sec für die Partikel aus der Lösung ziehen.
  7. Mit Hilfe einer Mehrkanalpipette, ziehen Sie die Originalprobe und entsorgen Sie als Abfall. Die Platte aus dem Magneten.
  8. Fügen Sie 200 ul HBST in jede Vertiefung mit Hilfe der Mehrkanalpipette. Pumpen Sie den Puffer nach oben und unten mehrere Male, um die magnetischen Partikel zu waschen.
  9. Legen Sie die Platte zurück auf den Magneten, und warten Sie 30 Sekunden für die Partikel aus der Lösung ziehen.
  10. Unter Verwendung der Mehrkanalpipette, ziehen Sie die 200 ul Puffer und als Abfall entsorgen. Die Platte aus dem Magneten.
  11. Wiederholen Sie die Schritte 5,8 through 5.10 zweimal zu drei Waschungen der Teilchen zu vervollständigen.
  12. 100 ul HBST in jede Vertiefung, die magnetische Teilchen, gefolgt von 2,5 ul 2 mM Ir1.
  13. Die Teilchen mit Ir1 Inkubieren auf einem Plattenschüttler für 1 Stunde.
  14. Nach 1 Stunde, lesen Sie die Emissionsintensität bei 510 nm (Anregung bei 365 nm) unter Verwendung einer 96-Well-Platten-Lesegerät.
    1. Die Platte wird in der Instrumentenplatte und öffnen Sie die Reader-Software, um die Einrichtung eines neuen Experiments.
    2. Den neuen Versuch, einen Fluoreszenz Endpunkt mit einer Anregungswellenlänge von 365 nm und Emissionswellenlänge von 510 nm gelesen. Stellen Sie die Schlitzbreite für beide Wellenlängen bis 9 nm, mit der Optik an der Spitzenposition.
    3. Lesen Sie die Platte und exportieren Sie die Daten für die Analyse.
  15. Übertragen Sie die Proben auf eine klare Platte mit 96 Vertiefungen und Bild die Titration mit einem UV-Transilluminator.

Representative Results

Wie in Abbildung 1, Synthese der Ir1 Solvenskomplexes-Komplex beteiligte Aufspaltung des Chlorid Brücke in der Mutter Dimer durch Ausfällung des Chlorids in Form von unlöslichen AgCl und Vereinigung von Wassermolekülen an das Metallzentrum dargestellt. Die Bildung von Ir1 wurde von H 1 NMR und ESI bestätigt. Zusätzlich wurden UV-Vis-Banden charakteristisch für Metall-Ligand-Charge-Transfer-und π-π * Übergänge zu dem Spektrum zugeordnet, ferner die Validierung der Bildung von Ir1. Das solvatisierte Komplex weist keine emittierende Charakter, wenn sie bei 365 nm angeregt wird.


Abbildung 1
Fig. 1: Synthese und Charakterisierung von Ir1 Chloride Brückenspaltungsreaktion von Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) phenyl) diiridium (III), um die Aquokomplex Ir erstellen (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1). Bei Zugabe von L-His zur Aquokomplex in wässrigem Puffer, Leuchtsignal eingeschaltet ist.

Sobald der Komplex synthetisiert und charakterisiert wurde die Aminosäureselektivität analysiert, wie zuvor unter Verwendung eines ähnlichen Iridium Analog 17 beschrieben. 2A zeigt, daß nur Histidin löste eine Signalantwort bei 510 nm, wenn sie bei 365 nm angeregt wird.


Figur 2
Figur 2: Aminosäure-Selektivität und Titration von Ir1 mit histidinreichem Peptide (A) Zusammenspiel von 200 uM verschiedener Aminosäuren (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) mit 50 & mgr; M. Ir1 in HBS. Spektrale Scans wurden von 400 bis 700 nm bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm in einer schwarzen 96-Well-Platte entnommen. Signal in relativen Fluoreszenzeinheiten (RFU) von allen Aminosäuren besides Histidin (gestrichelte schwarze Linie) war vernachlässigbar. (B) nanomolaren Konzentrationen von BNT-II (▪) und rcHRP-II (♦) wurden mit Ir1 in HBS titriert. Die Histidin-reiche Peptide wurden mit der Sonde für 15 min in der Lösung vor dem Ablesen der Emission bei 510 nm nach Anregung mit 365-nm-Licht inkubiert. Nachweisgrenze wurde als Wert von x, wenn y = 3σ blank berechnet.

Dieses "on-Schalter" der Phosphoreszenz des Iridium-Sonde tritt auf, weil die angeregten Singulettzustand (1 MLCT / 1 LC) des Ir (III) Biokonjugat erfährt Intersystem Crossing zum Triplett angeregten Zustand (3 MLCT), wenn Histidin koordiniert mit dem Metallzentrum. Diese Sonde wurde ein Peptid Mimik des Malaria-Biomarker Plasmodium falciparum Histidin Rich Protein II (pf HRP-II) zu BNT-II angewendet. In einer Titration von BNT-II mit Ir1, eine konzentrationsabhängige Signalantwort beobachtet ( D von Ir1 Bindung an BNT-II immobilisiert auf einem Ni (II) NTA-Oberfläche wurde gefunden, dass 2,05 & mgr; M (Figur 3) sein.

Figur 4

Abbildung 3: Echtzeit-kinetische Analyse Ir1 mit BNT-II Bioschicht Interferometrie für kinetische Analyse von verschiedenen Konzentrationen von Ir1 Bindung an BNT-II auf der Oberfläche eines Ni (II) NTA Glassensor.. Nach Äquilibrieren der Sensoren in KB (Region A) sind die Sensoren mit 0,5 uM BNT-II (Region B) geladen. Sobald das Peptid an den Sensoren geladen wird, wird ein Ausgangswert festgelegt (Region C) vor der Messung der Assoziation von Ir1 zum BNT-II (Region D). Nacheine Zeit der Vereinigung werden die Sensoren wieder in KB gesetzt, um die Dissoziation (Region E) zu messen. Die gesamte kinetische Analyse Vorgang dauert weniger als 30 Minuten.

Wenn von einer Lösung basierenden Assay an ein magnetisches Teilchen Plattform, die zusätzliche Komplexität des Teilchens in dem System musste berücksichtigt werden. Es wurde aus früheren Arbeiten bekannt ist, dass diese Partikel effizient die Malaria Biomarker pf HRP-II zu binden. 24 Black Fluoreszenzplatten funktionierte gut für die Lösung Assay oben beschreiben, aber weiße Platten für die on-Partikeldetektionsplattform besser geeignet waren, wie in gesehen 4A. In einer weißen Platte wird das Licht zurück in die Probe reflektiert wird, wodurch eine bessere Absorption der Ir1 auf die Oberfläche des Partikels gebunden ist. Im On-Partikel-Assay wird die Nachweisgrenze der rcHRP-II wurde bestimmt, dass 14,5 nM (4B) ist. Die Nachweisgrenze für rcHRP-II-Lösung und von partikel waren STATISTMtisch die gleiche Basis eines ungepaarten t-Test (p = 0,731).

Figur 5
Figur 5


Abb. 4: On-bead Nachweis von BNT-II und HRP-II (A) Differenzen zwischen dem von Ir1 BNT-II auf der Oberfläche von 50 um Ni gebunden erfassten Signals (II) NTA magnetische Agarose-Teilchen in einem schwarzen 96- Well-Platte (durchgezogene Linie) im Vergleich zu einer weißen Platte mit 96 Vertiefungen (gestrichelte Linie). Die Partikel wurden mit 365 nm Licht angeregt und die Emission wurde bei 510 nm gemessen. (B) Die Titration rcHRP-II auf den magnetischen Teilchen immobilisiert und unter Verwendung Ir1. Nachweisgrenze wurde als das va berechnetlue von x, wenn y = 3σ leer.

Figur 5

Abbildung 5: Schematische Darstellung des On-Bead-Erkennung von rcHRP-II mit Ir1 Allgemeine Systematik der HRP-II-Bindung an der Oberfläche des Ni (II) NTA-Teilchen und mit Ir1 gekennzeichnet.. Die Partikel werden mit einem histidinreichem Peptid für 15 min inkubiert. Nach diesem Inkubationszeitraum werden die Partikel mit Hilfe eines Magneten HBST, um die Teilchen aus der Lösung zu ziehen gewaschen. Schließlich können die Peptid gebundene Partikel mit Ir1 für 1 h vor dem Ablesen der Emission bei 510 nm nach Anregung mit Licht von 365 nm inkubiert.

Discussion

Als Mikropartikel-basierten Diagnosewerkzeuge kommen, um die Spitze der modernen Diagnose-Technologie, ist Nachweis von Ziel-Biomolekülen direkt auf der Oberfläche des Partikels ein großer Vorteil. Sind die traditionellen molekularen Nachweisverfahren, wie ELISA und PCR, vorteilhaft, da sie sehr niedrige Nachweisgrenze 25 erreichen. Diese Tests erfordern jedoch umfangreiche Reagenzien und langwierige Protokolle. Dieser Test wurde entwickelt, um Sandwich-ELISA-Typ-Wechselwirkungen, ohne Zeit und Reagenz Anforderungen (Abbildung 5) zu imitieren. Zusätzlich wurde die Kosten des Ir1 Sonde pro Probe auf etwa einen Cent, wohingegen die Kosten für die Antikörper für einen typischen ELISA ist $ 0,20-0,30 pro Probe.

Da die oben beschriebenen Verfahren beruhen auf einer cyclometallier- Iridium Sonde zur Detektion des Malaria Biomarker würde diese Sonde nicht anfällig für Fehlerarten gemeinsam mit anderen Nachweismethoden (d. Fluorophor quenchi seinng und Antikörper / Enzymabbau). Histidin ist in seiner Metallbindungseigenschaften einzigartig. Die skizzierten Arbeits nutzt dieses Phänomen durch Ersetzen der Antikörper in einem typischen Sandwich-ELISA mit Metall enthaltende Komplexe. Ni (II) NTA erfasst rcHRP-II auf der Oberfläche des Partikels und Ir1 signalisiert die Anwesenheit des Proteins. Der wichtigste Schritt im Assay ist damit die magnetischen Partikel mit der Probe und der Sonde mischen. In einer 96-Well-Platte ELISA die Biomoleküle und Reagenzien erreichen Gleichgewicht mit der zweidimensionalen Oberfläche des Boden des Bohrlochs. Magnetpartikel haben die Tendenz, aus der Lösung absetzen aufgrund ihrer dichten Eisenoxid-Kern, der die verfügbaren Bindungsstellen reduzieren würde. Daher müssen die Teilchen während des Assays Zeit gemischt werden, um eine maximale Bindung zu gewährleisten.

Bei der Gestaltung eines Reagenz zur Krankheitsdiagnose, muss man im Hinterkopf behalten die Form der Patientenprobe sowie die physiologische Konzentration der Biomarker. FürMalaria kann die Konzentration von PF-HRP-II in dem Blut eines Patienten zu günstigen picomolar hohe nanomolar variieren. Während dieser Assay für höhere Infektion klinisch relevant, die Nachweisgrenze muss, um auf asymptomatische Patienten mit niedrigen picomolar zirkulierenden pf HRP-II erkennen verbessert werden. In den oben beschriebenen Verfahren, der "Einschaltbereit" in der Gegenwart von Histidin durch Ir1 erzeugte Signal auftritt. Während die Malaria Biomarker ist reich an Histidin, andere Serumproteine, wie Humanserumalbumin und Histidin Glykoprotein, würde eine Signalantwort mit der Sonde hervorzurufen. Dies würde wiederum zu falsch positiven Diagnosen führen. Dies macht die Erfassung des Proteins auf der Oberfläche des Partikels eine vorteil Schritt, dass das Protein von Interesse kann schnell von einer Patientenprobe extrahiert werden. Zusätzlich Gestaltung eines bifunktionellen Sonde, dass Paare eine Histidin-reiche Peptid zu einem robusten molekulares Erkennungselement (dh. Aptamer), Könnte eine weitere Ebene der Spezifität des Tests hinzufügen. Das Peptid würde mit Iridium geladen werden, bevor die Kopplung an das Aptamer. Bei einer solchen Konstruktion kann die stabile Ir1 Sonde immer noch verwendet werden, während eine Zielspezifität mit dem Aptamer. Dies würde für die Anwendung der Sonde an nativen HRP-II in einer komplexen Matrix (d. Plasma oder Vollblut) zu ermitteln und verringern unspezifische Bindung Effekte erlauben. Um das Signal des schnellen Diagnosetests weiter zu verbessern, könnte der Test in eine elektrochemilumineszente (ECL) System, bei dem PF-HRP-II auf der RDTs als elektroAuslese 26 erfaßt werden eingearbeitet werden. Diese nächste Generation Iridium Sonde würde erheblich verbessern unsere On-Bead-ELISA-Test zum Nachweis von Biomarkern Krankheit.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Iridium (III) Lumineszierende Sonde zum Nachweis von Malaria-Protein Biomarker Histidin Rich Protein-II
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Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

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