Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Questo lavoro descrive la sintesi di un non-emissivi, ciclometallati Ir (III), Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 + (IR1), che provoca una rapida, segnale fosforescenti longeva quando coordinate per un histidine- contenente proteina immobilizzata sulla superficie di una particella magnetica. Sintesi di Ir1, in alte rese, è completo O / N e prevede la separazione del genitore ciclometallati Ir (III) dimero cloro-ponte in due equivalenti del complesso solvatato. Per confermare la specificità, diversi aminoacidi sono stati sondati per l'attività di coordinamento quando aggiunto alla sonda sintetizzato, e solo istidina suscitato un segnale di risposta. Utilizzando BNT-II, un peptide mimica ramificato del biomarker malarica Istidina Rich Protein II (pfHRP-II), la sonda di iridio è stata convalidata come strumento per il rilevamento HRP-II. Effetti tempra sono stati notati nella titolazione BNT-II / Ir1 rispetto alla L-istidina / Ir1, ma questi sono stati attribuiti al sterico e triPlet tempra Stato. Biolayer interferometria stata utilizzata per determinare la cinetica in tempo reale di interazione di Ir1 con BNT-II. Una volta che il sistema è stato ottimizzato, il limite di rilevazione di rcHRP-II utilizzando la sonda è risultato essere 12,8 nM in soluzione. Quando questa proteina era immobilizzato sulla superficie di una particella magnetica agarosio 50 micron, il limite di rilevazione era 14,5 nM. La risposta forte segnale di questa sonda inorganico, nonché la flessibilità di impiego in soluzione o immobilizzato su una superficie, possono prestarsi verso una varietà di applicazioni, da uso diagnostico all'imaging.
Etichettatura colorimetrica e fluorescenti è un metodo importante per l'individuazione e la localizzazione di molecole biochimiche e dei processi 1,2. I marcatori fluorescenti più comuni sono a basso peso molecolare, coloranti organici 3,4, ma queste molecole non hanno sempre proprietà ottiche ideali. Coloranti fluorescenti sono inclini a photobleaching, spesso hanno piccoli spostamenti Stokes, e può avere sovrapposizioni di eccitazione e spettri di emissione. Etichettatura colorimetrico è spesso raggiunto con l'uso di etichette enzimatiche, che hanno un segnale amplificato utile immunodosaggio quantificazione 5,6. Questi enzimi hanno anche i loro svantaggi, tra cui fotosensibilità, condizioni di reazione, e la shelf life breve substrato. Queste proprietà tendono a richiedere saggi immunologici e metodi di etichettatura di proteine deve essere fatto in condizioni ben controllate utilizzano reagenti costosi.
Complessi di metalli di transizione emissivi sono stati esplorati come un approccio di etichettatura alternativa for rilevamento biochimica. In particolare, ciclometallati Ir (III) è stata studiata nel contesto di diodi luminosi organici (OLED) di rilevamento 7-9 ossigeno 10, Catalisi 11, e proteine / cella colorazione 12-14. Alta fotostabilità ed efficienza quantica rendono questa classe di sonde un buon candidato per il rilevamento di biomolecole 15,16. In precedenza era emerso che ciclometallati Ir (III), nella forma [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, irreversibilmente legano istidina e suscitare una risposta del segnale blu-verde 12,17. Questi complessi sono non emissive nello stato solvento, ma quando istidina sposta le molecole di solvente e si lega al centro metallico, rilasciano un segnale fosforescente intenso dopo irradiazione onde lunghe UV. Questo segnale si verifica solo dopo sostituzione del legante, ed è il risultato di un elettrone tripletto relax allo stato fondamentale attraverso l'attivazione di trasferimento di carica metallo legante (3 MLCT) e trasferimento al centro ligando (3 LC) percorsi 8,15. Questi complessi possono potenzialmente essere usati come sonde di rilevamento per le proteine ricche di istidina.
Proteine ricche di istidina e dei loro livelli di regolazione sono importanti in molte malattie, tra cui la cirrosi epatica, cancro e disordini thrombic. 18 Plasmodium falciparum istidina Rich Protein II (pfHRP-II), in particolare, è un biomarcatore ben validato per l'infezione parassita della malaria. Questa proteina è 67 kDa e contiene il 34% istidina, per lo più all'interno di caratteristici AHHAHHAAD ripetendo motivi 19. Queste ripetizioni istidina possono legare ioni metallici liberi 19 e 20 eme complessi nel sangue dell'ospite. pfHRP-II è comunemente rilevato in ambienti con scarsa risorsa utilizzando immunocromatografici test di diagnosi rapida (RDTs), ma questi test sono spesso imprecisi a causa delle condizioni del campione, bassa concentrazione di biomarker, standard di produzione poveri e la degradazione degli anticorpi 21.
<p class="Jove_content"> sonde fosforescenti a base di metallo, come il ciclometallati Ir (III) di cui sopra sono opzioni interessanti per la rilevazione di pfHRP-II a causa della loro legame selettivo di istidina e le loro proprietà stabili e di emissione efficiente. In questo lavoro, l'uso di [Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2] + (IR1) per rilevare BNT-II, un peptide mimica ramificata di pfHRP-II viene esplorata 22. Cinetica di questa interazione sono stati monitorati in tempo reale utilizzando le tecniche di interferometria biolayer. Il dosaggio è stato anche adattato per un on-tallone formato ELISA-tipo, dove sono stati raggiunti i limiti nanomolari di rilevamento. Questo test detiene vantaggi rispetto ELISA tradizionali perché può essere eseguito in meno di 2 ore con i reagenti senza anticorpi, invece del 4-5 hr e reagenti biologici richiesti con ELISA tipici.Come strumenti diagnostici basati su microparticelle vengono alla ribalta della tecnologia diagnostica moderna, l'individuazione di biomolecole bersaglio direttamente sulla superficie della particella è un grande vantaggio. Metodi di rilevamento molecolari tradizionali, come ELISA e PCR, sono vantaggiosi, in quanto possono raggiungere molto bassi limiti di rilevazione 25. Tuttavia, questi test richiedono ampi reagenti e protocolli lunghi. Questo test è stato progettato per simulare le interazioni di tipo ELISA a sandwich senza il tempo ei requisiti reagenti (Figura 5). Inoltre, il costo della sonda Ir1 per campione è stato stimato a circa un centesimo, mentre il costo di anticorpi per un tipico ELISA è $ 0,20-0,30 per campione.
Poiché i metodi sopra descritti si basano su una sonda iridio ciclometallati per il rilevamento del biomarker malarica, questa sonda non sarebbe suscettibile di modi di guasto comune ad altri metodi di rilevamento (es. Fluoroforo quenching e la degradazione degli anticorpi / enzima). Istidina è unico nelle sue caratteristiche di legame metallo. Il lavoro descritto sfrutta questo fenomeno sostituendo gli anticorpi in un tipico panino ELISA con contenenti metalli complessi. Ni (II) NTA cattura rcHRP-II sulla superficie della particella e Ir1 segnala la presenza della proteina. La fase più critica nel saggio sta permettendo le particelle magnetiche per mescolare con il campione e la sonda. In una piastra a 96 pozzetti ELISA, biomolecole e reagenti raggiungono l'equilibrio con la superficie bidimensionale del fondo del pozzo. Particelle magnetiche hanno la tendenza a stabilirsi dalla soluzione per il loro nucleo di ferro-ossido denso, che ridurrebbe i siti di legame disponibili. Così, le particelle devono essere miscelati durante il tempo di saggio per garantire la massima vincolante.
Nel progettare un reagente per la diagnosi di malattia, bisogna tenere presente forma di campione del paziente come pure la concentrazione fisiologica del biomarker. Permalaria, la concentrazione di pf HRP-II nel sangue di un paziente può variare da basso a alto picomolare nanomolare. Mentre questo saggio è clinicamente rilevante per i livelli più alti di infezione, il limite di rilevamento deve essere migliorata al fine di individuare i pazienti asintomatici con basso picomolare circolante pf HRP-II. Nei metodi descritti sopra, la "switch-on" segnale generato da Ir1 si verifica in presenza di istidina. Mentre il biomarker malarica è ricca di istidina, altre proteine del siero, come albumina di siero umano e istidina ricca glicoproteina, risulterebbe in una risposta di segnale con la sonda. Ciò a sua volta portare a diagnosi di falsi positivi. Questo rende la cattura della proteina sulla superficie della particella un passo vantaggioso, in quanto la proteina di interesse può essere rapidamente estratto da un campione clinico. Inoltre, la progettazione di una sonda bifunzionale, che le coppie un ricco peptide istidina ad un elemento di riconoscimento molecolare robusta (es. Aptamer), Potrebbe aggiungere un altro strato di specificità del test. Il peptide dovrebbe essere caricato con iridio prima dell'accoppiamento al aptamer. In tale disegno, la sonda stabile Ir1 può ancora essere utilizzata mentre il raggiungimento dell'obiettivo specificità con aptamer. Ciò consentirebbe l'applicazione della sonda per rilevare nativa HRP-II in una matrice complessa (es. Plasma o sangue intero) e ridurre gli effetti vincolanti non specifici. Al fine di migliorare ulteriormente il segnale di test diagnostici rapidi, il dosaggio potrebbe essere incorporato in un sistema electrochemiluminescent (ECL), dove pf HRP-II può essere rilevata sulla RDTs come un visualizzatore 26 elettrochimica. Questa sonda generazione iridio successivo sarebbe migliorare notevolmente la nostra on-bead ELISA per la rilevazione di biomarcatori di malattia.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |