Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
この作品は、非発光の合成を概説し、シクロメタル化イリジウム(III)錯体、IR(PPY)2(H 2 O)2ヒスチジンに配位したときに迅速な、長寿命のリン光信号を誘発+(Ir1を)、磁性粒子の表面に固定化されたタンパク質を含有します。高収率でIr1をの合成は、完全なO / Nであり、親の分割を含む溶媒和複合体の2当量にイリジウム(III)クロロ架橋二量体をシクロメタル化。 特異性を確認するために、合成されたプローブを添加した場合にいくつかのアミノ酸は、配位活性についてプローブした、唯一のヒスチジンは、信号応答を誘発しました。 BNT-II、マラリアバイオマーカーヒスチジンリッチプロテインII(pfHRP-II)の分岐鎖状ペプチド模倣を使用して、イリジウムプローブは、HRP-IIを検出するためのツールとして確認されました。 L-ヒスチジン/ Ir1をと比較した場合、消光効果はBNT-II / Ir1を滴定で認められたが、これらは立体障害及びトリに帰属し、plet状態消光。生物層干渉はBNT-IIとの相互作用のIr1をリアルタイム動態を決定しました。システムを最適化した後、プローブを使用してrcHRP-IIの検出限界は、溶液中で12.8 nMであることが見出されました。このタンパク質は、50ミクロンの磁性アガロース粒子の表面上に固定化した場合には、検出限界は14.5 nMでした。堅牢な信号この無機プローブの応答だけでなく、溶液中での使用の柔軟性や表面上に固定化は、診断での使用からの撮像に、種々の用途に向けて自分自身を貸すことができます。
比色および蛍光標識は、生化学分子の検出と追跡のための重要な方法であり、1,2を処理します。最も一般的な蛍光マーカーは、低分子量の有機色素3,4あるが、これらの分子は、常に理想的な光学特性を有していません。蛍光色素は、多くの場合、小さなストークスシフトを有し、重複励起及び発光スペクトルを有していてもよく、光退色する傾向があります。比色標識は、多くの場合、イムノアッセイ定量5,6において有用な増幅された信号を持っている酵素標識の使用によって達成されます。これらの酵素はまた、感光性、反応条件、およびショート基板の貯蔵寿命を含む、それらの欠点を有します。これらの特性は、高価な試薬を用いて十分に制御された条件下で行われるイムノアッセイ及びタンパク質標識法を必要とする傾向があります。
発光遷移金属錯体は、FO代替標識アプローチとして検討されています生化学的検出rを。具体的には、イリジウム(III)が10、触媒11、及びタンパク質/細胞染色12-14を感知ダイオード(OLED)7-9酸素有機発光との関連で研究されているシクロメタル化。高い光と量子効率は、プローブのこのクラスの生体分子検出15,16のための良好な候補を作ります。これは、以前に、不可逆的にヒスチジンを結合して、青緑色の信号応答12,17を引き出す+形のシクロメタル化イリジウム(III)錯体、こと[2 IR(C ^ N)2(SOLV)]が見つかりました。これらの複合体はsolvento状態で非発光であるが、ヒスチジンが溶媒分子を置換し、金属中心に結合する場合、それらは長波長のUV照射後の強いリン光信号を放出します。このシグナルは、リガンドの置換の後に発生し、三重項状態の電子の結果は、金属配位子電荷移動(3 MLの活性化を介して基底状態に弛緩されCT)とリガンド中心転送(3 LC)は8,15の経路。これらの複合体は、潜在的に、ヒスチジンが豊富なタンパク質の検出用プローブとして用いることができます。
ヒスチジンに富むタンパク質およびそれらの規制値は、肝硬変、癌、および血栓性疾患を含む、多くの疾患において重要である。18熱帯熱マラリア原虫のヒスチジンリッチプロテインII(pfHRP-II)、特にマラリア原虫感染症によく検証バイオマーカーです。このタンパク質は、主に特性AHHAHHAAD繰り返しモチーフ19内に、67 kDaであり、34%のヒスチジンが含まれています。これらのヒスチジン反復は、ホスト、血液中の遊離金属イオン19とヘム複合体20を結合することができます。 pfHRP-IIは、一般的に免疫クロマトグラフィ迅速診断テスト(RDTs)を用いた低リソースの設定で検出されましたが、これらのテストが原因サンプル条件、低バイオマーカー濃度、貧しい製造基準、および抗体の劣化21にしばしば不正確です。
<p class=「jove_content ">例えば、上記のシクロメタル化イリジウム(III)錯体のような金属ベースの燐光プローブが原因でヒスチジンおよびそれらの安定的かつ効率的な発光特性の彼らの選択的結合にpfHRP-IIの検出のための魅力的なオプションです。本論文では、BNT-IIを検出するために[IR(PPY)2(H 2 O)2] +(Ir1を)の使用は、pfHRP-IIの分岐鎖状ペプチド模倣は、22を検討しています。この相互作用の速度論は、生物層の干渉技術を使用してリアルタイムでモニターしました。アッセイは、検出のナノモル限界が達成された上でビーズELISA型のフォーマットに適合させました。それは代わりに4-5時間、典型的なELISAを用いて、必要な生物学的試薬の、抗体を含まない試薬を用いて、2時間未満で行うことができるので、このアッセイは、伝統的なELISA法を超える利点を保持しています。微粒子ベースの診断ツールは、現代の診断技術の最前線に来ているように、直接、粒子の表面上の標的生体分子の検出は、大きな利点です。そのようなELISAおよびPCRなどの従来の分子検出法は、その中にそれらが検出25の非常に低い限界を達成することができ、有利で す。しかし、これらのアッセイは、広範囲な試薬および長いプロトコルが必要です。このアッセイは、時間および試薬の要求( 図5)なしにELISA型サンドイッチの相互作用を模倣するように設計されました。典型的なELISA用抗体のコストはサンプルあたり$ 0.20から0.30であるのに対し、さらに、サンプルあたりIr1をプローブのコストは、ペニーの周りにあると推定されました。
上記の方法は、マラリア、バイオマーカーの検出のためのシクロメタル化イリジウムプローブに依存しているので、このプローブは、 すなわち (他の検出方法に共通の故障モードの影響を受けやすいではありません。フルオロフォアquenchiNGおよび抗体/酵素分解)。ヒスチジンは、その金属結合特性に独特です。概説仕事は、金属含有錯体を有する典型的なELISAサンドイッチに抗体を置き換えることによって、この現象を利用しています。ニッケル(II)、NTAは、粒子の表面上にrcHRP-IIを捕捉し、Ir1を、タンパク質の存在を示します。アッセイの中で最も重要なステップは、磁性粒子は、サンプルとプローブと混合することを可能にします。 96ウェルELISAプレートにおいて、生体分子および試薬は、ウェルの底部の二次元表面に平衡に達します。磁性粒子は、利用可能な結合部位を減少させるそれらの緻密な酸化鉄コアに溶液から沈降する傾向があります。したがって、粒子は、最大結合を確認するためにアッセイ時間中に混合しなければなりません。
疾患の診断のための試薬を設計するとき、人は心の中で、患者試料の形だけでなく、バイオマーカーの生理的濃度を維持する必要があります。のためにマラリア、患者の血液中のPF HRP-IIの濃度が高いナノモルの低いピコモルから変化させることができます。このアッセイは、感染のより高いレベルのために臨床的に関連するが、検出限界は、PF HRP-II循環低いピコモルで無症候性の患者を検出するために改善する必要があります。上記に概説した方法では、「スイッチオン」Ir1をによって生成された信号は、ヒスチジンの存在下で起こります。マラリアのバイオマーカーは、ヒスチジンが豊富であるが、例えば、ヒト血清アルブミンおよびヒスチジンリッチ糖タンパク質のような他の血清タンパク質は、プローブの信号応答を誘発するであろう。これにより、偽陽性の診断につながります。これは有益なステップは、その中で目的のタンパク質を迅速に患者試料から抽出することができる粒子の表面上のタンパク質の捕捉を行います。さらに、二機能性プローブの設計、堅牢な分子認識素子に結合ヒスチジンリッチなペプチド( すなわち 。アプタマーこと)、アッセイに特異性の別の層を追加することができます。ペプチドは、アプタマーに結合する前に、イリジウムでロードされることになります。アプタマーと標的特異性を達成しながら、このような設計では、安定したIr1をプローブは依然として利用することができます。これは、複雑なマトリックス( すなわち、血漿又は全血)中に、ネイティブHRP-IIを検出し、非特異的結合効果を低減するためのプローブの適用を可能にします。さらに急速な診断テスト信号を高めるために、アッセイは、PF HRP-IIは、電気化学的読み出し26としてRDTsに検出することができる電気化学発光(ECL)システムに組み込むことができます。この次世代イリジウムプローブが大幅疾患バイオマーカーの検出のための私達の上にビーズELISAアッセイを高めるであろう。
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |