Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
이 작업에는 비 발광의 합성을 설명, cyclometalated IR (III) 착물, IR (PPY) 2 (H 2 O) 2 histidine-에 배위시 급속한 수명이 긴 인광 신호를 이끌어 + (IR1), 자성 입자의 표면에 고정화 된 단백질을 함유. IR1의 합성은, 높은 수율로, / N O 완료되고 용 매화 착물의 2 당량으로 IR (III) 클로로 – 가교 다이머 cyclometalated 부모의 분할을 포함한다. 특이성을 확인하기 위해, 합성 된 프로브에 첨가 될 때 여러 아미노산 조정 활동을 위해 프로빙하고, 히스티딘은 단지 신호 응답을 이끌어 냈다. BNT-II, 말라리아 히스티딘 리치 바이오 마커 단백질 II (pfHRP-II)의 분지 된 펩티드를 모방하여, 이리듐 프로브 HRP-II 검출을위한 도구로 입증되었다. L-히스티딘 / IR1 비교할 때 급냉 효과 BNT-II / IR1 적정에서 언급 되었으나, 이러한 입체 장애 및 트리에 기인 한상태 담금질을 plet. Biolayer 간섭계는 BNT-II IR1와의 상호 작용을 실시간으로 반응 속도를 결정하는 데 사용되었다. 시스템 최적화 된 후에 프로브를 사용 rcHRP-II의 검출 한계는 용액에 12.8 nm 인 것으로 밝혀졌다. 이 단백질이 50 ㎛ 인 자성 아가 입자의 표면에 고정화 한 경우, 검출 한계는 14.5 nm였다. 강력한 시그널이 무기 프로브의 응답뿐만 아니라 용액 사용의 유연성 또는 표면에 고정화는, 진단 용도에서 이미징, 다양한 애플리케이션을 향해 빌려줄 수있다.
비색과 형광 표지는 생화학 적 분자의 검출 및 추적을위한 중요한 방법이며 1, 2를 처리합니다. 가장 일반적인 형광 마커는 저 분자량 유기 염료 3,4- 있지만 이들 분자는 항상 이상적인 광학 특성이 없다. 형광 염료는 종종 작은 스톡스 시프트가 있고, 중첩 여기 및 발광 스펙트럼을 가질 수 photobleaching에 경향이있다. 비색 라벨은 종종 면역 정량에 유용한 5,6- 증폭 된 신호가 효소 라벨의 사용에 의해 달성된다. 이 효소는 또한 감광성, 반응 조건, 및 기판의 짧은 수명을 포함한 그들의 단점을 가지고있다. 이러한 속성은 값 비싼 시약을 사용하여 잘 통제 된 조건 하에서 수행되어야 면역 단백질 라벨링 방법을 필요로하는 경향이있다.
방사성 전이 금속 착물은 다른 표지 방법 FO으로 탐구되어왔다생화학 감지 r에. 특히, (III)은, 7-9 산소 10 감지 유기 발광 다이오드 (OLED)의 맥락에서 공부 (11)을 촉매, 및 단백질 / 세포가 12-14 염색 한 내용의 Ir을 cyclometalated. 높은 광 안정성 및 양자 효율은 프로브의이 클래스 생체 분자 검출 (15, 16)에 대한 좋은 후보를합니다. 그것은 이전의 형식, (Ⅲ) 착물의 Ir을 cyclometalated 것으로 나타났습니다 [적외선은 (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, 비가 역적 히스티딘을 결합하고 푸른 녹색 신호 응답 12,17을 유도. 이러한 착물은 solvento 상태 비방 출성이지만 히스티딘 용매 분자 변위와 금속 중심에 결합 될 때, 그들은 장파장 UV 조사 후의 강한 인광 신호를 방출. 이 신호는 단지 리간드 치환 한 후 발생하고, 금속 리간드 전하 이동의 활성화를 통해 기저 상태로 편안한 삼중 상태 전자의 결과 (3 ML이고CT) 및 리간드를 중심으로 전달 (3 LC)는 8,15을 진학. 이러한 복합체는 잠재적 히스티딘 – 풍부 단백질 검출 프로브로서 사용될 수있다.
히스티딘 풍부한 단백질과 규제 수준은 간경변, 암, 및 thrombic 장애를 포함, 많은 질병에 중요하다. 특히 18 말라리아 원충 히스티딘 풍부한 단백질 II (pfHRP-II)는 말라리아 기생충 감염이 잘 검증 된 바이오 마커입니다. 이 단백질은 주로 특성 AHHAHHAAD 반복 모티브 (19) 내에서 67 kDa의이며 34 % 히스티딘이 포함되어 있습니다. 이 히스티딘 반복 무료 금속 이온 (19)을 결합 할 수 있으며 헴 호스트 혈액에서 20 복합체. pfHRP-II는 일반적으로 면역 크로마토 그래피 빠른 진단 테스트 (RDTs)를 사용하여 낮은 리소스 설정에서 검출되지만, 이러한 테스트로 인해 샘플 조건, 낮은 바이오 마커의 농도, 가난한 제조 기준 및 항체 저하 (21)에 종종 부정확하다.
<p class="jove_content"> 등의 cyclometalated의 Ir 등의 금속 기반의 인광 프로브 (Ⅲ) 상기 복합체 인해 히스티딘 자신의 선택적 결합과 안정된 효율적으로 방출 특성에 pfHRP-II의 검출을위한 매력적인 옵션입니다. 본 논문에서는 사용 [IR (PPY) 2 (H 2 O) 2] + (IR1)가 BNT-II, 22 탐구된다 pfHRP-II의 분지 펩티드 모방을 검출하도록. 이러한 상호 작용의 속도론은 biolayer 간섭계 기법을 사용하여 실시간으로 모니터링 하였다. 분석은 또한 나노 몰의 검출 한계가 성취에 비드 형 ELISA 포맷에 적응시켰다. 이 대신에 4-5 시간 및 일반적인 ELISA를 필요로 생물학적 시약, 항체없는 시약하에 2 시간에서 수행 될 수 있기 때문에 기존의 분석은 ELISA를 통해 장점을 보유하고있다.미립자 기반 진단 도구 현대 진단 기술의 선두에 올 때, 직접 입자의 표면에 표적 생체 분자의 검출은 큰 장점이다. 이러한 PCR ELISA와 같은 전통적인 분자 검출 방법, 즉 그들이 검출부 (25)의 매우 낮은 한도를 달성 할 수있는, 유리하다. 그러나 이러한 분석은 광범위한 시약 및 긴 프로토콜을 필요로한다. 이러한 분석은 시간 및 시약의 요구 (도 5)없이 ELISA 샌드위치 형 상호 작용을 모방하도록 디자인되었다. 일반적인 ELISA에 대한 항체의 비용은 샘플 당 $ 0.20-0.30 반면 또한, 샘플 당 IR1 프로브의 비용은, 페니 주위로 추정되었다.
위에서 설명한 방법은 말라리아 바이오 마커의 검출을위한 cyclometalated 이리듐 프로브에 의존하기 때문에,이 프로브는 다른 검출 방법에 공통 고장 모드 (예. 형광의 quenchi에 감염되지 않을 것NG 항체 / 효소 분해). 히스티딘은 금속 결합 특성에 고유합니다. 요약 일 금속 함유 착물 일반적인 ELISA 샌드위치 항체를 대체함으로써이 현상을 이용한다. 니켈 (II) NTA는 입자의 표면에 rcHRP-II를 캡처하고 IR1은 단백질의 존재를 신호. 분석에서 가장 중요한 단계는 자성 입자가 샘플과 프로브와 혼합 할 수 있도록되어있다. 96- 웰 플레이트 ELISA에서, 생체 분자 및 시약은 웰의 바닥의 2 차원 표면과 평형에 도달한다. 자기 입자 때문에 가능한 결합 부위를 줄일 자신의 조밀 한 철 산화물 코어에 솔루션에서 정착하는 경향이있다. 따라서, 입자는 최대 결합되도록하여 분석 시간 동안 혼합한다.
질병 진단 시약을 설계 할 때, 하나 염두에 환자 샘플의 형태뿐만 아니라, 바이오 마커의 생리 학적 농도를 유지한다. 용말라리아 환자의 혈액에서 PF HRP-II의 농도가 높은 나노 몰을 둘러 피코 몰에서 다를 수 있습니다. 이 분석법은 높은 수준의 감염에 대한 임상 적으로 중요한 반면, 검출 한계가 낮은 피코 몰 HRP-II PF 순환와 무증상 환자를 검출하기 위해 개선 될 필요가있다. 위에서 설명 된 방법에서, "스위치 온"IR1 의해 생성 된 신호는 히스티딘의 존재하에 일어난다. 말라리아 바이오 마커는 히스티딘 풍부하지만, 인간 혈청 알부민과 히스티딘 풍부 당 단백질과 같은 다른 혈청 단백질, 프로브 신호 반응을 유도한다. 이것은 차례로 위양성 진단으로 이어질 것입니다. 이것은 유익한 단계, 즉 관심 단백질이 급속하게 환자 시료로부터 추출 될 수있는 입자의 표면에 단백질을 포획한다. 또한 관능 검사를 설계 강력한 분자 인식 요소에 결합 히스티딘 풍부 펩티드 (즉. 앱 타머 그), 분석 특이성의 또 다른 레이어를 추가 할 수 있습니다. 펩타이드는 앱 타머에 연결하기 전에 이리듐로드 될 것이다. 앱 타머와 표적 특이성을 달성하면서 이러한 설계에서, 안정된 IR1 프로브는 여전히 이용 될 수있다. 이것은 복잡한 매트릭스 (즉. 혈장 또는 전혈) 네이티브 HRP-II 감지하고 비특이적 결합 효과를 줄이기 위해 프로브의 적용을 허용한다. 더욱 신속한 진단 테스트 신호를 향상시키기 위해, 분석은 PF HRP-II가 전기 (26), 판독 RDTs 검출 될 수 전기 화학 발광 (ECL) 시스템에 통합 될 수있다. 이 차세대 이리듐 프로브는 크게 질병 바이오 마커의 검출에 대한 우리의 온 – 비드 ELISA 분석을 향상시킬 것입니다.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |