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Chemistry

말라리아 단백질 바이오 마커 히스티딘 풍부한 단백질-II의 검출을위한 이리듐 (III) 발광 프로브

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

이 작업에는 비 발광의 합성을 설명, cyclometalated IR (III) 착물, IR (PPY) 2 (H 2 O) 2 histidine-에 배위시 급속한 수명이 긴 인광 신호를 이끌어 + (IR1), 자성 입자의 표면에 고정화 된 단백질을 함유. IR1의 합성은, 높은 수율로, / N O 완료되고 용 매화 착물의 2 당량으로 IR (III) 클로로 - 가교 다이머 cyclometalated 부모의 분할을 포함한다. 특이성을 확인하기 위해, 합성 된 프로브에 첨가 될 때 여러 아미노산 조정 활동을 위해 프로빙하고, 히스티딘은 단지 신호 응답을 이끌어 냈다. BNT-II, 말라리아 히스티딘 리치 바이오 마커 단백질 II (pfHRP-II)의 분지 된 펩티드를 모방하여, 이리듐 프로브 HRP-II 검출을위한 도구로 입증되었다. L-히스티딘 / IR1 비교할 때 급냉 효과 BNT-II / IR1 적정에서 언급 되었으나, 이러한 입체 장애 및 트리에 기인 한상태 담금질을 plet. Biolayer 간섭계는 BNT-II IR1와의 상호 작용을 실시간으로 반응 속도를 결정하는 데 사용되었다. 시스템 최적화 된 후에 프로브를 사용 rcHRP-II의 검출 한계는 용액에 12.8 nm 인 것으로 밝혀졌다. 이 단백질이 50 ㎛ 인 자성 아가 입자의 표면에 고정화 한 경우, 검출 한계는 14.5 nm였다. 강력한 시그널이 무기 프로브의 응답뿐만 아니라 용액 사용의 유연성 또는 표면에 고정화는, 진단 용도에서 이미징, 다양한 애플리케이션을 향해 빌려줄 수있다.

Introduction

비색과 형광 표지는 생화학 적 분자의 검출 및 추적을위한 중요한 방법이며 1, 2를 처리합니다. 가장 일반적인 형광 마커는 저 분자량 유기 염료 3,4- 있지만 이들 분자는 항상 이상적인 광학 특성이 없다. 형광 염료는 종종 작은 스톡스 시프트가 있고, 중첩 여기 및 발광 스펙트럼을 가질 수 photobleaching에 경향이있다. 비색 라벨은 종종 면역 정량에 유용한 5,6- 증폭 된 신호가 효소 라벨의 사용에 의해 달성된다. 이 효소는 또한 감광성, 반응 조건, 및 기판의 짧은 수명을 포함한 그들의 단점을 가지고있다. 이러한 속성은 값 비싼 시약을 사용하여 잘 통제 된 조건 하에서 수행되어야 면역 단백질 라벨링 방법을 필요로하는 경향이있다.

방사성 전이 금속 착물은 다른 표지 방법 FO으로 탐구되어왔다생화학 감지 r에. 특히, (III)은, 7-9 산소 10 감지 유기 발광 다이오드 (OLED)의 맥락에서 공부 (11)을 촉매, 및 단백질 / 세포가 12-14 염색 한 내용의 Ir을 cyclometalated. 높은 광 안정성 및 양자 효율은 프로브의이 클래스 생체 분자 검출 (15, 16)에 대한 좋은 후보를합니다. 그것은 이전의 형식, (Ⅲ) 착물의 Ir을 cyclometalated 것으로 나타났습니다 [적외선은 (C ^ N) 2 (SOLV) 2] +, 비가 역적 히스티딘을 결합하고 푸른 녹색 신호 응답 12,17을 유도. 이러한 착물은 solvento 상태 비방 출성이지만 히스티딘 용매 분자 변위와 금속 중심에 결합 될 때, 그들은 장파장 UV 조사 후의 강한 인광 신호를 방출. 이 신호는 단지 리간드 치환 한 후 발생하고, 금속 리간드 전하 이동의 활성화를 통해 기저 상태로 편안한 삼중 상태 전자의 결과 (3 ML이고CT) 및 리간드를 중심으로 전달 (3 LC)는 8,15을 진학. 이러한 복합체는 잠재적 히스티딘 - 풍부 단백질 검출 프로브로서 사용될 수있다.

히스티딘 풍부한 단백질과 규제 수준은 간경변, 암, 및 thrombic 장애를 포함, 많은 질병에 중요하다. 특히 18 말라리아 원충 히스티딘 풍부한 단백질 II (pfHRP-II)는 말라리아 기생충 감염이 잘 검증 된 바이오 마커입니다. 이 단백질은 주로 특성 AHHAHHAAD 반복 모티브 (19) 내에서 67 kDa의이며 34 % 히스티딘이 포함되어 있습니다. 이 히스티딘 반복 무료 금속 이온 (19)을 결합 할 수 있으며 헴 호스트 혈액에서 20 복합체. pfHRP-II는 일반적으로 면역 크로마토 그래피 빠른 진단 테스트 (RDTs)를 사용하여 낮은 리소스 설정에서 검출되지만, 이러한 테스트로 인해 샘플 조건, 낮은 바이오 마커의 농도, 가난한 제조 기준 및 항체 저하 (21)에 종종 부정확하다.

2 (H 2 O) 2] + (IR1)가 BNT-II, 22 탐구된다 pfHRP-II의 분지 펩티드 모방을 검출하도록. 이러한 상호 작용의 속도론은 biolayer 간섭계 기법을 사용하여 실시간으로 모니터링 하였다. 분석은 또한 나노 몰의 검출 한계가 성취에 비드 형 ELISA 포맷에 적응시켰다. 이 대신에 4-5 시간 및 일반적인 ELISA를 필요로 생물학적 시약, 항체없는 시약하에 2 시간에서 수행 될 수 있기 때문에 기존의 분석은 ELISA를 통해 장점을 보유하고있다.

Protocol

1. 이리듐의 합성 (III) 단지

  1. [2 -Cl IR (PPY)] 2, 53.6 mg의 (50 μmol)을 칭량하고 5 ml의 메틸렌 클로라이드에 녹인다. 교반 바가 장착 된 50 mL의 삼각 플라스크에 상기 용액을 추가한다.
  2. 26.2 mg의 AgOTf (100 μmol)을 칭량하고, 메탄올 5 ㎖에 용해.
  3. 용해에 AgOTf [IR (PPY) 2 -Cl]이 솔루션을 추가하고 1 시간 동안 교반.
    참고 : 크림 컬러 슬러리 발생한다.
  4. 1 시간 후, 25 X 95mm의 DRAM 바이알로 실리카 겔을 통해 슬러리를 필터링하고, 회전 증발기 (5-10 분)을 이용하여 잔류 용매를 증발시켰다.
  5. 대부분의 용매가 제거되면, 황색 오일성 잔류 물을 유리 병에 남아 있는지 확인한다. 이 잔류 물에, 생성물을 재용 해하고 황색 고체 생성물을 수득 1-2일 동결 건조하는 1 ml의 메탄올을 추가한다.
  6. <H 의해 IR (PPY) 2 (H 2 O) 2 + 생성물 (IR1)을 특성화SUP> 1 NMR, ESI 및 UV-비스 (CDCl3 중) 전술 한 바와 같이. (23)

각종 아미노산과 IR1 2. 상호 작용

  1. 메탄올 IR1의 2 mM의 용액 (MW 537.10 g / 몰) 준비합니다. 소용돌이는 고체의 완전 용해를 보장합니다.
  2. HEPES에 다음과 같은 아미노산 및 생체 분자의 100 μm의 솔루션은 그의, 일드는리스가 빼앗아가, 발을 시도 식염수 (HBS, 100 mM의 HEPES, 137 mM의 염화나트륨, pH를 7.4) 알라, ASP, 시스테인을, 버퍼 준비합니다.
  3. 블랙 96- 웰 플레이트에 각 아미노산 100 ㎕ 피펫. 빈 역할을하는 판에 HBS 100 μl를 추가합니다.
  4. 각 샘플에 2 mM의 IR1 솔루션의 2.5 μl를 추가하고 10 분 동안 접시 통에 접시를 흔들.
  5. 10 분 후, 96- 웰 플레이트 판독기 (365 EX / EM 400-700)를 사용하여 시료의 발광 스펙트럼을 획득.
    1. 악기에 접시를 놓고 새로운 실험을 설정하는 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다.
    2. 새로운 특급 설정eriment 365 나노 미터의 여기 파장 및 상부 위치에 광학 9 nm의 슬릿 폭과 형광 검사를 판독한다.
    3. 5 nm의 스텝 크기 300-700 nm의에서 방출을 읽어보십시오.
    4. 데이터 분석을위한 데이터를 내 보냅니다.
  6. 맑은 96 웰 플레이트 및 이미지 UV transilluminator가 발광을 이용한 샘플을 이동.

BNT-II와 IR1 3. 적정

  1. HBS에서 BNT-II (MW 8233.6 g / 몰)의 1 mM의 주식 솔루션뿐만 아니라 메탄올 IR1의 2 mM의 솔루션을 준비합니다.
  2. 원액에서 HBS 100 μm의 BNT-II 1 ㎖를 준비합니다. 시료가 혼합 보장하기 위해 microcentrifuge 관을 소용돌이.
  3. 직렬 1.56 μM BNT-II의 최종 농도에서 절반으로 HBS 100 μM BNT-II 희석.
  4. HBS는 96 웰 플레이트에, 빈 역할을 함께 중으로, 각 희석 100 μl를 추가합니다. 각 샘플에, 2 mM의 IR1의 2.5 μl를 추가합니다.
  5. 쉬접시 통에 10 분 동안 판 아케.
  6. 진탕 후, 96- 웰 플레이트 판독기를 사용하여 510 나노 미터 (365 nm에서 여기)에서 발광 강도를 판독.
    1. 악기에 접시를 놓고 새로운 실험을 설정하는 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다.
    2. 510 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장과 형광 엔드 포인트를 판독하는 새로운 실험을 설정한다. 상단 위치에 광학, 9nM이다에게 모두 파장의 슬릿 폭을 설정합니다.
    3. 판을 읽고 분석을 위해 데이터를 내보낼 수 있습니다.
  7. 맑은 96 웰 플레이트 및 이미지의 UV transilluminator가을 이용하여 적정을 샘플을 옮긴다.

Biolayer 간섭계를 사용하여 IR1 / BNT-II 시스템 4. 실시간 운동 분석

  1. 운동 버퍼의 200 μl를 추가, 검은 96 웰 플레이트의 첫 번째 열에 8 우물 (KB 1X 인산 0.02 % 트윈 20 완충 식염수)와 플라스틱 센서에 플레이트를 삽입홀더. 조심 팁 버퍼 웰에 현탁되도록 플라스틱 홀더에 제 8 열에 니켈 (II) NTA 바이오 센서를 옮긴다. 간섭 악기의 왼쪽에있는 플라스틱 홀더를 배치합니다.
  2. KB에서 BNT-II의 0.5 μm의 솔루션의 2 ml의를 준비합니다.
  3. KB에서 IR1의 10 μm의 솔루션의 500 μl를 준비하고, 직렬 KB에서 0.156 μM까지 절반으로 희석.
  4. 새로운 블랙 96 웰 플레이트, 피펫 열 및 C의 모든 8 우물에 KB의 200 μL로
  5. 같은 접시에, 열 B에있는 우물에 0.5 ㎛ BNT-II 솔루션의 피펫 200 μL
  6. 피펫 잘 D1에서 빈으로 KB로 시작하는 열 D에 IR1의 각 희석, 200 μL. 우물은 열 아래 IR1 농도가 증가되도록 희석을 추가합니다.
  7. 사전 - 적심을 포함하는 센서 판의 오른쪽 기기에서이 판을 놓는다.
  8. biolayer 간섭 소프트웨어에서 기본 kinet을 설정판, 분석, 센서 팁을 정의하여 IC 실험.
    1. 판을 정의하려면, 화면에 열을 선택하고 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 우물에 대한 적절한 정의를 선택합니다. 열 D에 대한 열 B에 대한 열 A와 C는 "버퍼", "로드"및 "샘플"을 선택
    2. ( "추가"를 클릭) 다음 단계를 추가하여 다음 탭에서 분석을 정의 평형 (사용자 정의), 60 초; 로드, 120 초; 베이스 라인, 60 초; 협회, 120 초; 해리, 300 초. 평형 단계를 선택하고 (B 열), 기준 (C 열), 협회 (D 열), 해리 (열 C)를 넣기 위해 열 A의 반복을 두 번 클릭합니다. 니켈 (II) NTA 센서를 선택합니다.
    3. 다음 탭으로 이동하고 센서 플라스틱 센서 홀더 컬럼에 있는지 확인합니다.
    4. , 파일 이름을 삽입, 실험이 제대로 설명되어 확인 "지연 실험"이 선택되어 있는지 확인하고 언론은 "이동합니다."
      NOTE는 : 운동 실험이 설명되면 프로그램으로 기기의 자동화 된 특성으로 인해, 단계가 발생합니다.
  9. 운동 실행이 완료되면, 제공된 프로세싱 소프트웨어에서 데이터를 처리한다.
    1. 왼쪽에있는 패널의 맨 아래 부분에 대한 관심의 파일 이름과 폴더를 더블 클릭합니다. 그런 다음, 패널의 상단 부분에 "키​​네틱"에 해당 폴더를 두 번 클릭합니다. 처리 탭으로 이동합니다.
    2. 센서 선택 화면을 엽니 다 왼쪽에있는 빼기 상자를 선택합니다. 오른쪽 잘 A4 클릭하고 참조 음에 잘 유형을 변경합니다.
    3. Y 축 정렬 옆의 확인란을 선택하고, 선택된 단계는베이스 라인되어 있는지 확인합니다. 베이스 라인의 마지막 5 초 (약 55 ~ 60 초)로 시간 범위를 지정합니다.
    4. 간 단계의 보정에 대한 상자를 선택하고 해리에 정렬을 선택합니다. Savitzky - 골 레이 필터 상자를 선택하고 Enter를 누르 "프로세스 데이터되어 있는지 확인하십시오! ̶1;
    5. 분석 탭으로 이동합니다. "협회와 해리는"분석하는 단계 및 모델이 1이 선택되어 있는지 확인 : 1. 지역 전체 착용감을 선택하고 버튼을 누르 "맞춤 곡선을!"
    6. 테이블의 모든 곡선을 선택하고 오른쪽으로 하나의 색상으로 모든 곡선을 설정합니다. 다음, 색상 및 Rmax가 센서에 의해 연결되지 않은별로 그룹화 글로벌 (전체) 맞춤을 선택합니다. 를 눌러 "맞춤 곡선!"글로벌 역학 데이터를 얻을 수있다.

5. 비드 IR1와 BNT-II의 탐지 및 rcHRP-II

  1. 1 ml의에게 트윈와 HBS에서 BNT-II와 rcHRP-II의 1 μm의 솔루션을 각각 준비 (HBST을, HBS를 0.025 % 트윈 20).
  2. 직렬 15.6 nm의 최종 농도 HBST에서 절반으로 각각의 단백질을 희석.
  3. 피펫 높은 농도 아래 열에 가장 낮은에서 순서로 희석 흰색 96 웰 플레이트에 세중의 각 희석액 100 ㎕,,,.
  4. 피펫 50 μm의 니켈의 10​​ μL (II물론 각각의 희석에) NTA 자기 아가로 오스 입자.
    1. 입자가 현탁되도록 유지하기 위해 각 피펫 후에 자성 입자를 함유하는 마이크로 원심 튜브 소용돌이.
  5. 15 분 입자 샘플을 배양하는 접시 통에 접시를 놓습니다.
  6. 이 잠복기 후, 96 웰 플레이트 자석에있는 플레이트에 배치하고 입자가 용액으로부터 당겨 30 초를 기다립니다.
  7. 멀티 채널 피펫을 사용하여 원래의 샘플을 끌어와 폐기물로 폐기합니다. 자석에서 플레이트를 제거합니다.
  8. 각 웰 멀티 채널 피펫을 사용하여 HBST 200 μl를 추가합니다. 자성 입자를 씻어 위아래로 수회 버퍼 펌프.
  9. 다시 자석 위에 접시를 놓고 입자 용액으로부터 당겨 30 초를 기다립니다.
  10. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 버퍼의 200 μl를 해내과 폐기물로 폐기합니다. 자석에서 플레이트를 제거합니다.
  11. 반복 5.8 단계를 통해 서H 5.10 두 번 입자의 세 가지 세척을 완료합니다.
  12. 2 mM의 IR1의 2.5 μL 다음 각 웰에 포함 된 자성 입자에 HBST 100 μl를 추가합니다.
  13. 1 시간 동안 접시 통에 IR1와 입자를 품어.
  14. 1 시간 후, 96 웰 플레이트 판독기를 사용하여 510 나노 미터 (365 nm에서 여기)에서 발광 강도를 판독.
    1. 악기에 접시를 놓고 새로운 실험을 설정하는 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다.
    2. 510 내지 365 nm이고, 발광 파장의 여기 파장과 형광 엔드 포인트를 판독하는 새로운 실험을 설정한다. 상단 위치에 광학, 9 nm의 두 파장의 슬릿 폭을 설정합니다.
    3. 판을 읽고 분석을 위해 데이터를 내보낼 수 있습니다.
  15. 맑은 96 웰 플레이트 및 이미지 UV transilluminator가을 이용하여 적정을 샘플을 옮긴다.

Representative Results

도 1 금속 중심 불용성의 AgCl의 형태 클로라이드의 침전에 의해 상위의 이량 클로라이드 다리 IR1 solvento 복잡한 관여의 합성 및 분리 물 분자의 관계에 도시 된 바와 같이. IR1의 형성은 1 H NMR 및 ESI에 의해 확인 하였다. 365 nm에서 여기 된 때 또한 금속 리간드 전하 이동의 특징 UV 가시 밴드 π-π * 전이 더욱 IR1의 형성을 확인하는, 스펙트럼을 할당 하였다. 이것은 복잡한 전시물을 더 방출 특성을 용해하지 않는다.


그림 1
그림 1 :.의 IR1 디클로로 (2- (2- 피리 디닐) 페닐)의 염화 다리 분할 반응 합성 및 특성 디 이리듐 (III) 아쿠아 단지의 Ir를 만들려면 (PPY) 2 (H 2 O) 2 + (IR1). 첨가시 L-그의 수성 버퍼의 아쿠아 단지에, 발광 신호가 켜집니다.

착물 합성 및 특성화되었다 일단 이전 유사한 이리듐 유사체 (17)를 이용하여 설명한 바와 같이, 아미노산 선택성, 분석 하였다.도 2a는 365 nm에서 여기 된 경우에만 히스티딘, 510 nm에서 신호 응답을 유도 것을 보여준다.


그림 2
그림 2 : 아미노산, 선택도, 히스티딘 풍부한 펩타이드와 IR1의 적정 (A) 50 μm의 다양한 아미노산 (시스테인, 빼앗아, ASP, 글루,의 Phe,리스,의 Arg, 티르, TRP, 그의) 200 μM의 상호 작용. HBS에서 IR1. 스펙트럼 스캔 블랙 96 웰 플레이트에 365 nm 인 여기 파장 400-700 nm 내지 촬영 하였다. 모든 아미노산 B의 상대 형광 단위로 신호 (RFU)esides 히스티딘 (점선 블랙 추적) 무시할 수 있었다. BNT-II (▪) 및 rcHRP-II (♦)의 (B) 나노 몰 농도는 HBS에서 IR1으로 적정 하였다. 히스티딘 풍부한 펩티드는 365 nm의 빛 여기 후 510 nm에서 방출을 읽기 전에 용액에서 15 분 동안 프로브와 함께 배양 하였다. 검출 한계는 y는 3σ를 비워 = x의 값으로 계산 하였다.

히스티딘이 조정되었을 때의 Ir의 단일 여기 상태 (1 MLCT / 1 LC)이 (III) bioconjugate는 삼중 항 여기 상태 (3 MLCT)에 간 교차을 거쳐 때문에 이리듐 프로브의 인광이 "ON 스위치는"발생 금속 중심에. 이 프로브는 BNT-II에 말라리아 원충 히스티딘 풍부한 단백질 II (HRP-II PF) 말라리아 바이오 마커의 모방 펩타이드를 적용 하였다. IR1와 BNT-II의 적정에서 농도 의존적​​ 신호 응답이 관찰되었다 ( D는 니켈 (II) NTA 표면에 고정화는 2.05 μM (도 3) 인 것으로 밝혀졌다.

그림 4

그림 3 :. 니켈 (II) NTA 유리 센서의 표면에 BNT-II의 결합 IR1의 다양한 농도의 운동 분석을위한 BNT-II Biolayer 간섭과 IR1의 실시간 운동 분석. KB (지역)에 센서를 평형화 후, 센서는 0.5 μm의 BNT-II (지역 B)와 함께로드됩니다. 펩티드를 센서에 탑재되면,베이스 라인은 종래 BNT-II (지역 D) 내지 (IR1)의 관계를 측정하는 (C 영역)에 설정된다. 후협회의 기간은, 센서는 해리 (지역 E)를 측정하기 위해 KB에 다시 배치됩니다. 전체 운동 분석 프로세스 미만 30 분 소요됩니다.

자성 입자 플랫폼 용액 기반 분석법에서 전환하는 경우, 시스템 내의 입자의 복잡성 고려되어야했다. 에서 볼 수 있듯이 그것은, 위의 설명 (24) 블랙 형광 판 솔루션 분석을 위해 잘 작동했다. 이들 입자가 효율적으로 말라리아 바이오 마커 PF HRP-II를 결합하는 것으로, 이전의 연구에서 알려져 있지만 흰색 플레이트에 입자 검출 플랫폼에 더 적합했다되었다 도 4a. 화이트 판, 광 따라서 입자의 표면에 결합하여 더 IR1 흡광도 있도록 다시 샘플로 반사된다. 온 - 입자 분석에서, rcHRP-II의 검출 한계는 14.5 nM의 (도 4B)로 측정되었다. rcHRP-II에 대한 검출 한계 솔루션과 온 - 비드 statis했다짝 t 검정 (p = 0.731가)에 기초하여 동일한 학적.

그림 5
그림 5


그림 4 :. 검은 50 μm의 니켈의 표면에 BNT-II에 결합 IR1에서 검출 된 신호 사이에 비드 BNT-II와 HRP-II의 감지 () 차이 (II) NTA 자기 아가 입자 96 잘 흰색 96 웰 플레이트 (점선) 대 판 (실선). 입자는 365 nm의 광으로 여기하여, 발광은 510 nm에서 측정 하였다. rcHRP-II의 (B) 적정 자성 입자에 고정 및 IR1을 이용하여 검출. 검출 한계는 다음과 같이 계산 하였다 VAX의 루는 Y는 3σ를 비워 = 때.

그림 5

그림 5 : IR1와 rcHRP-II의 온 - 비드 검출의 도식 표현 니켈 (II) NTA 입자와 IR1 표지의 표면에 결합 HRP-II의 일반 계획.. 입자를 15 분 동안 히스티딘 풍부 펩티드와 함께 배양된다. 이 배양 기간 후, 입자 HBST이 용액으로부터 입자를 끌어하기 위하여, 자석을 이용하여 세척한다. 마지막으로, 펩티드 결합 입자는 종래 365 nm의 광으로 여기 한 후 510 nm에서 발광을 판독을 1 시간 동안 IR1 함께 배양된다.

Discussion

미립자 기반 진단 도구 현대 진단 기술의 선두에 올 때, 직접 입자의 표면에 표적 생체 분자의 검출은 큰 장점이다. 이러한 PCR ELISA와 같은 전통적인 분자 검출 방법, 즉 그들이 검출부 (25)의 매우 낮은 한도를 달성 할 수있는, 유리하다. 그러나 이러한 분석은 광범위한 시약 및 긴 프로토콜을 필요로한다. 이러한 분석은 시간 및 시약의 요구 (도 5)없이 ELISA 샌드위치 형 상호 작용을 모방하도록 디자인되었다. 일반적인 ELISA에 대한 항체의 비용은 샘플 당 $ 0.20-0.30 반면 또한, 샘플 당 IR1 프로브의 비용은, 페니 주위로 추정되었다.

위에서 설명한 방법은 말라리아 바이오 마커의 검출을위한 cyclometalated 이리듐 프로브에 의존하기 때문에,이 프로브는 다른 검출 방법에 공통 고장 모드 (예. 형광의 quenchi에 감염되지 않을 것NG 항체 / 효소 분해). 히스티딘은 금속 결합 특성에 고유합니다. 요약 일 금속 함유 착물 일반적인 ELISA 샌드위치 항체를 대체함으로써이 현상을 이용한다. 니켈 (II) NTA는 입자의 표면에 rcHRP-II를 캡처하고 IR1은 단백질의 존재를 신호. 분석에서 가장 중요한 단계는 자성 입자가 샘플과 프로브와 혼합 할 수 있도록되어있다. 96- 웰 플레이트 ELISA에서, 생체 분자 및 시약은 웰의 바닥의 2 차원 표면과 평형에 도달한다. 자기 입자 때문에 가능한 결합 부위를 줄일 자신의 조밀 한 철 산화물 코어에 솔루션에서 정착하는 경향이있다. 따라서, 입자는 최대 결합되도록하여 분석 시간 동안 혼합한다.

질병 진단 시약을 설계 할 때, 하나 염두에 환자 샘플의 형태뿐만 아니라, 바이오 마커의 생리 학적 농도를 유지한다. 용말라리아 환자의 혈액에서 PF HRP-II의 농도가 높은 나노 몰을 둘러 피코 몰에서 다를 수 있습니다. 이 분석법은 높은 수준의 감염에 대한 임상 적으로 중요한 반면, 검출 한계가 낮은 피코 몰 HRP-II PF 순환와 무증상 환자를 검출하기 위해 개선 될 필요가있다. 위에서 설명 된 방법에서, "스위치 온"IR1 의해 생성 된 신호는 히스티딘의 존재하에 일어난다. 말라리아 바이오 마커는 히스티딘 풍부하지만, 인간 혈청 알부민과 히스티딘 풍부 당 단백질과 같은 다른 혈청 단백질, 프로브 신호 반응을 유도한다. 이것은 차례로 위양성 진단으로 이어질 것입니다. 이것은 유익한 단계, 즉 관심 단백질이 급속하게 환자 시료로부터 추출 될 수있는 입자의 표면에 단백질을 포획한다. 또한 관능 검사를 설계 강력한 분자 인식 요소에 결합 히스티딘 풍부 펩티드 (즉. 앱 타머 그), 분석 특이성의 또 다른 레이어를 추가 할 수 있습니다. 펩타이드는 앱 타머에 연결하기 전에 이리듐로드 될 것이다. 앱 타머와 표적 특이성을 달성하면서 이러한 설계에서, 안정된 IR1 프로브는 여전히 이용 될 수있다. 이것은 복잡한 매트릭스 (즉. 혈장 또는 전혈) 네이티브 HRP-II 감지하고 비특이적 결합 효과를 줄이기 위해 프로브의 적용을 허용한다. 더욱 신속한 진단 테스트 신호를 향상시키기 위해, 분석은 PF HRP-II가 전기 (26), 판독 RDTs 검출 될 수 전기 화학 발광 (ECL) 시스템에 통합 될 수있다. 이 차세대 이리듐 프로브는 크게 질병 바이오 마커의 검출에 대한 우리의 온 - 비드 ELISA 분석을 향상시킬 것입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

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References

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Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

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