Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Este trabalho descreve a síntese de um não-emissiva, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H2O) 2 + (IR1), o que provoca um sinal fosforescente rápida, de longa duração, quando coordenado com um histidine- contendo proteína imobilizada na superfície de uma partícula magnética. Síntese de IR1, com rendimentos elevados, é completa S / N e envolve a cisão do pai cyclometalated Ir (III) de dímero com ponte de cloro em dois equivalentes do complexo solvatado. Para confirmar a especificidade, vários ácidos aminados foram sondadas para a actividade de coordenação, quando adicionados à sonda sintetizada, e apenas histidina induziu uma resposta de sinal. Usando BNT-II, um mímico péptido ramificado do biomarcador da malária proteína rica em histidina (pfHRP-II), a sonda de irídio foi validada como uma ferramenta para a detecção de HRP-II. Têmpera efeitos foram observados na titulação BNT-II / IR1 quando comparado com L-Histidina / IR1, mas estes foram atribuídos a impedimento estérico e triplet têmpera estado. Biolayer interferometria foi utilizado para determinar a cinética em tempo real de interacção de IR1 com BNT-II. Uma vez que o sistema foi optimizado, o limite de detecção de rcHRP-II, utilizando a sonda se verificou ser 12,8 nM em solução. Quando esta proteína foi imobilizada na superfície de uma partícula magnética de agarose de 50 um, o limite de detecção foi de 14,5 nM. O sinal de resposta robusta esta sonda inorgânico, bem como a sua flexibilidade de utilização, em solução ou imobilizados sobre uma superfície, pode prestar-se para uma variedade de aplicações, de utilização de diagnóstico para imagiologia.
Rotulagem e colorimétrico fluorescente é um método importante para a detecção e rastreamento de moléculas bioquímicas e processa 1,2. Os marcadores fluorescentes mais comuns são de baixo peso molecular corantes orgânicos 3,4, mas estas moléculas nem sempre têm propriedades ópticas ideais. Corantes fluorescentes são propensos a fotodegradação, têm, frequentemente, pequenos desvios de Stokes, e pode ter sobreposição de excitação e os espectros de emissão. Rotulagem colorimétrico é muitas vezes conseguida através da utilização de marcadores enzimáticos, que têm um sinal amplificado útil na quantificação imunoensaio 5,6. Estas enzimas também têm os seus inconvenientes, incluindo fotossensibilidade, condições de reação, e vida útil curta substrato. Estas propriedades tendem a exigir imunoensaios e métodos de marcação de proteínas para ser feito sob condições bem controladas utilizando reagentes dispendiosos.
Complexos de metais de transição emissivas têm sido explorados como uma abordagem de etiquetagem alternativa for detecção bioquímico. Em particular, cyclometalated Ir (III) foi estudado no contexto de diodos emissores de luz orgânicos (OLEDs) 7-9 oxigénio de detecção 10, 11 catálise, e de proteína / célula coloração 12-14. Alta fotoestabilidade e eficiência quântica fazer esta classe de sondas de um bom candidato para a detecção de biomoléculas 15,16. Foi encontrado que anteriormente cyclometalated complexos Ir (III), sob a forma de [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, liguem irreversivelmente histidina e eliciar uma resposta de sinal azul-verde 12,17. Estes complexos são não-emissiva no estado solvento, mas quando histidina desloca as moléculas de solvente e liga-se ao centro metálico, que libertam um sinal fosforescente intensa após a irradiação com UV de onda longa. Este sinal ocorre apenas após a substituição do ligando, e é o resultado de um estado de tripleto que relaxa de electrões para o estado fundamental, através da activação de metal de transferência de carga ligando (3 MLCT) e transferência centrado ligando (3 LC) Vias 8,15. Estes complexos podem potencialmente ser utilizados como sondas de detecção de proteínas ricas em histidina.
Proteínas ricas em histidina e seus níveis de regulação são importantes em muitas doenças, incluindo cirrose hepática, câncer e distúrbios trombótico. 18 Plasmodium falciparum proteína rica em histidina (pfHRP-II), em especial, é um biomarcador bem validado para a infecção pelo parasita da malária. Esta proteína é 67 kDa e contém 34% de histidina, na maior parte dentro característicos AHHAHHAAD repetindo 19 motivos. Essas repetições de histidina pode ligar iões metálicos livres 19 e 20 complexos heme no sangue do hospedeiro. pfHRP-II é comumente detectada em ambientes de baixa renda por meio de testes de diagnóstico rápido imunocromatogr�icas (RDTs), mas estes testes são muitas vezes imprecisas, devido às condições de amostra, baixa concentração de biomarcadores, normas de fabricação pobres, ea degradação do anticorpo 21.
<p class="Jove_content"> sondas fosforescentes à base de metal, tal como o cyclometalated Ir (III), complexos descritos acima são opções atraentes para a detecção de pfHRP-II, devido à sua ligação selectiva de histidina e suas propriedades de solidez e de emissão eficiente. Neste papel, a utilização de [Ir (ppa) 2 (H2O) 2] + (IR1) para detectar BNT-II, um mímico péptido ramificado de pfHRP II-22 é explorado. Cinética desta interacção foram monitorizados em tempo real usando técnicas biolayer interferometria. O ensaio também foi adaptado a um formato de ELISA de tipo sobre-cordão, em que foram obtidos limites nanomolares de detecção. Este ensaio realiza vantagens sobre os tradicionais, pois os testes ELISA pode ser realizada em menos de 2 horas com reagentes isento de anticorpos, em vez de a 4-5 horas e reagentes biológicos necessários com ELISAs típicos.Como ferramentas de diagnóstico à base de micropartículas vir para a frente de tecnologia moderna de diagnóstico, detecção de biomoléculas alvo directamente sobre a superfície da partícula é uma grande vantagem. Métodos de detecção molecular tradicionais, tais como ELISA e PCR, são vantajosas, na medida em que pode atingir muito baixos limites de detecção 25. No entanto, estes ensaios necessitam de reagentes e protocolos extensas longas. Este ensaio foi concebido para mimetizar as interacções sanduíche de ELISA de tipo sem o tempo e os requisitos de reagente (Figura 5). Além disso, o custo da sonda IR1 por amostra foi estimado em cerca de uma moeda, enquanto que o custo de anticorpos para um ELISA típico é $ 0,20-0,30 por amostra.
Uma vez que os métodos descritos acima dependem de uma sonda para a detecção de irídio cyclometalated do biomarcador da malária, esta sonda não seria susceptível a modos de falha comuns a outros métodos de detecção (ou seja. Fluoróforo quenching e degradação anticorpo / enzima). Histidina é único em suas propriedades de ligação de metal. O trabalho delineado tira proveito deste fenómeno, substituindo os anticorpos em um sanduíche típico de ELISA com complexos metálicos contendo. Ni (II) NTA captura rcHRP-II na superfície da partícula e IR1 sinaliza a presença da proteína. O passo mais importante no ensaio é permitir que as partículas magnéticas para misturar com a amostra e a sonda. Numa placa de 96 poços de ELISA, as biomoléculas e reagentes atingir o equilíbrio com a superfície bidimensional do fundo do poço. Partículas magnéticas têm a tendência para assentar a partir da solução, devido à sua densidade de núcleo de óxido de ferro, o que reduziria os locais de ligação disponíveis. Assim, as partículas devem ser misturados durante o tempo de ensaio para garantir a máxima ligação.
Ao conceber um reagente para diagnóstico de doenças, deve-se ter em mente a forma de amostra do paciente, bem como a concentração fisiológica do biomarcador. Paraa malária, a concentração de HRP-PF II no sangue de um paciente pode variar a partir de baixo para alto picomolar nanomolar. Embora este ensaio é clinicamente relevante para os níveis mais elevados de infecção, o limite de detecção deve ser melhorada a fim de detectar pacientes assintomáticos com baixo picomolar circulante PF HRP-II. Nos métodos acima descritos, o "switch-on" sinal gerado por IR1 ocorre na presença de histidina. Enquanto o biomarcador da malária é rica em histidina, outras proteínas do soro, tais como albumina do soro humano e glicoproteína rica em histidina, iria provocar uma resposta de sinal com a sonda. Este, por sua vez levar a diagnósticos falso-positivos. Isso faz com que a captura da proteína sobre a superfície da partícula de um passo benéfico, em que a proteína de interesse pode ser rapidamente extraída a partir de uma amostra do paciente. Além disso, projetar uma sonda bifuncional, que os casais uma rica peptídeo histidina a um elemento robusto reconhecimento molecular (ie. Aptamer), Poderia adicionar outra camada de especificidade para o ensaio. O péptido seria carregado com irídio antes do acoplamento para o aptâmero. Nesse projeto, a sonda ir1 estável ainda pode ser utilizado ao conseguir especificidade alvo com o aptâmero. Isto iria permitir a aplicação da sonda para detectar nativa HRP-II numa matriz complexa (isto é. De plasma ou de sangue total) e reduzir os efeitos de ligação não específica. A fim de aumentar ainda mais o sinal de testes de diagnóstico rápidos, o ensaio pode ser incorporado num sistema de electroquimioluminescência (ECL), onde PF HRP-II pode ser detectada no RDTs como uma leitura electroquimica 26. Esta sonda irídio próxima geração iria melhorar muito o nosso ensaio on-talão ELISA para a detecção de biomarcadores de doenças.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |