Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Chemistry

Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe

doi: 10.3791/52856 Published: July 7, 2015

Abstract

Bu çalışma olmayan bir yayım sentezini ana hatlarıyla cyclometalated Ir (III) kompleksi, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 histidine- koordine olduğunda hızlı, uzun ömürlü fosforlu sinyali ortaya çıkarmaktadır + (IR1), manyetik parçacığın yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmiş protein ihtiva etmektedir. IR1 sentezi, yüksek verimlerle, / K tam bir O ve solvatlanmış kompleks iki eşdeğer olarak Ir (III) 'ün kloro-köprülü dimer cyclometalated ebeveynin bölme içerir. Özgünlüğünü teyit etmek için, sentezlenmiş prob ilave edildiğinde çeşitli amino asitler koordinasyon aktivitesi için problandı ve sadece histidin sinyal karşılığını ortaya çıkardı. BNT-II, sıtma belirteç Histidin zengin protein II (pfHRP-II) 'in bir dallı peptit taklidi gibi davranır kullanarak, iridyum prob HRP II tespiti için bir araç olarak doğrulanmıştır. L-Histidin / IR1 kıyasla söndürme etkisi BNT-II / IR1 titrasyonu dikkat çekildi, ancak bu sterik engel ve tri atfedilmiştirdevlet su verme plet. Biolayer interferometri BNT-II ile IR1 etkileşimi gerçek zaman kinetiklerini belirlemek için kullanılmıştır. Sistem optimize sonra, prob kullanılarak rcHRP-II 'nin tespit limiti çözeltisi içinde 12.8 nM olduğu tespit edilmiştir. Bu protein, bir 50 um, manyetik agaroz parçacık yüzeyi üzerinde immobilize edildi, algılama sınırı 14.5 nM idi. Sağlam sinyali, bu inorganik prob tepki olarak çözelti içinde kullanım esnekliği ya da bir yüzey üzerinde immobilize, diagnostik kullanım görüntülemeye, çeşitli uygulamalarda doğru elverişli olabilir.

Introduction

Kolorimetrik ve floresan etiketleme biyokimyasal moleküllerin tespiti ve takibi için önemli bir yöntemdir ve 1,2 işler. En yaygın fluoresan işaretleyiciler, düşük molekül ağırlıklı organik boyalar 3,4, ancak bu moleküller her zaman ideal optik özelliklere sahip değildir. Floresan boyalar genellikle küçük Stokes kaymalar, ve üst üste binen uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip olabilir, ışıkla ağartma yatkındır. Kolorimetrik markalama genellikle bağışıklık miktar 5,6 yararlı olan güçlendirilmiş bir sinyal enzimatik etiketler, kullanımı ile elde edilir. Bu enzimler aynı zamanda fotosensitivite, reaksiyon koşulları ve kısa alt-tabaka raf ömrü dahil olmak üzere kendi dezavantajları vardır. Bu özellikler masraflı belirteçleri kullanarak iyi kontrollü şartlar altında yapılması gereken immün ve protein etiketleme yöntemleri gerektiren eğilimindedir.

Yayıcı geçiş metali kompleksleri, alternatif etiketleme yaklaşımı FO olarak araştırılmıştırBiyokimyasal algılama r. Özellikle, (III), 7-9 oksijen 10 algılama organik ışık yayan diyotlar (OLED) kapsamında incelenen 11 kataliz ve protein / hücre 12-14 boyama olmuştur Ir cyclometalated. Yüksek fotostabilite ve kuantum verimliliği sondaları bu sınıf biyomolekülün tespiti 15,16 için iyi bir aday olun. Bu, daha önce formun, (III) kompleksleri Ir cyclometalated olduğu tespit edilmiştir [Ir (Cı ^ K) 2 (Solv) 2] +, geri dönüşü olmayan histidin bağlanan ve mavi-yeşil bir sinyal yanıtı 12,17 neden olabilir. Bu kompleksler solvento halde olmayan yayım, ancak histidin çözücü moleküllerini değiştirir ve metal merkezine bağlandığı zaman, uzun dalga UV ışınımı sonrasında yoğun bir fosforlu sinyali bırakın. Bu sinyal, yalnızca ligand ikamesi sonra oluşur ve metal ligand yük transferi aktivasyonu yoluyla zemin durumuna rahatlatıcı bir üçlü devlet elektronun sonucu (3 ML olduğunuBT) ve ligand merkezli transferi (3 LC) 8,15 yolaklarıyla. Bu kompleksler, potansiyel olarak histidin bakımından zengin proteinleri için algılama sondalar olarak kullanılabilir.

Histidin bakımından zengin proteinler ve regülasyon seviyeleri karaciğer sirozu, kanser ve trombik bozukluklar da dahil olmak üzere, pek çok hastalıkta önemlidir. Özellikle 18 Plasmodium falciparum Histidin zengin protein II (pfHRP-II) 'sıtma paraziti enfeksiyonu için iyi olarak geçerliliği biyomarkerdir. Bu protein en çok karakteristik AHHAHHAAD tekrar motifler 19 içinde, 67 kDa ve 34% histidin içerir. Bu histidin tekrarlar ücretsiz metal iyonlarını 19 bağlayabilir ve heme konak kanda 20 kompleksleri. pfHRP-II yaygın immunokromatografik hızlı tanı testleri (RDTs) kullanarak düşük kaynak ortamlarda algılandı ancak bu testler nedeniyle numune koşulları, düşük biyobelirteç konsantrasyonu, kötü üretim standartları ve antikor bozulması 21 genellikle yanlıştır.

2 (H2O) 2] + (IR1) BNT-II, 22 keşfedilmeden pfHRP-II dallı bir peptid taklidi gibi davranır algılamak için. Bu etkileşimin kinetik biolayer interferometre teknikleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edildi. Tahlil ayrıca tespit nanomolar limitleri elde edildi bir on-boncuk ELISA-tipi biçimi, adapte edildi. Bunun yerine, 4-5 saat ve tipik ELISA ile istenen biyolojik reaktifler, antikor içermeyen reaktifler ile, 2 saat altında gerçekleştirilebilir, çünkü bu deney, geleneksel ELISA fazla avantajlar tutar.

Protocol

1. iridyum Synthesis (III) kompleksi

  1. [2, -Cl Ir (polipirol)] 2 ve 53.6 mg (50 umol) tartılır ve metilen klorür, 5 ml içinde çözülür. Bir karıştırma çubuğu ile donatılmış 50 ml'lik bir Erlenmeyer şişesi, bu solüsyonu ekleyin.
  2. AgOTf 26.2 mg (100 umol) tartılır ve 5 ml metanol içinde çözülür.
  3. Çözündürüldü için AgOTf [Ir (polipirol) 2, -Cl] 2 çözeltisi ilave edin ve 1 saat karışması sağlandı.
    Not: Krem renkli bulamaç, sonuçlanmalıdır.
  4. 1 saat sonra, bir 25 x 95 mm dirhemlik bir ampule silika jel içinden bulamaç filtre edilir ve döner bir buharlaştırıcı (5-10 dakika) kullanılarak geri kalan çözücü buharlaştırılır.
  5. Çözücünün çoğu çıkarıldıktan sonra, yağlı bir tortu, san bir şişede kalmasını kontrol edin. Bu kalıntıya, ürün yeniden çözülür ve sarı bir katı ürün elde etmek üzere 1-2 gün liyofilize metanolün 1 ml.
  6. <H Ir (ppy) 2 (H2O) 2 + ürünü (IR1) karakterizesup> 1 NMR ESI UV-Vis (CDCI3 içinde), daha önce tarif edildiği gibi. 23

Çeşitli Amino Asitler ile IR1 2. etkileşimler

  1. Metanol IR1 bir 2 mM solüsyonu (MW 537,10 g / Mol) hazırlayın. Girdap, katının tam olarak çözünmesini sağlamak için.
  2. HEPES, aşağıdaki amino asit ve biyomoleküllerin 100 uM çözeltiler His, İle, Lys, Ser, Val deneyin tuzlu su (HBS, 100 mM HEPES, 137 mM NaCI, pH 7.4), Ala, Asp, Cys, tamponlu hazırlayın.
  3. Siyah 96 oyuklu bir plakaya her bir amino asit, 100 ul pipet. Bir boş olarak hizmet etmek üzere plakaya HBS'de 100 ul ekle.
  4. Her bir örnek için, 2 mM IR1 çözeltinin 2.5 ul ilave edin ve 10 dakika boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plaka sallayın.
  5. 10 dakika sonra, 96 oyuklu bir plaka okuyucusu (365 ex / 400-700 em) kullanarak numune emisyon spektrumlarına sahip olur.
    1. Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın.
    2. Yeni exp ayarlaeriment 365 nm'lik bir eksitasyon dalga boyu ve en üst pozisyonda optik ile 9 nm bir yarık genişliğine sahip bir floresan tarama okuyun.
    3. 5 nm'lik bir adım büyüklüğü 300-700 nm emisyon okuyun.
    4. Veri analizi için veri verir.
  6. Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanılarak emisyon örnekleri aktarın.

BNT-II ile IR1 3. Titrasyon

  1. HBS'de BNT-II (MW 8233,6 g / mol) 'in bir 1 mM stok solüsyonu olarak metanol içinde IR1 bir 2 mM çözelti hazırlayın.
  2. Stok solüsyonu, HBS 100 mcM BNT-II 1 ml hazırlamak. Numune karışık olduğundan emin olmak için ependorf tüp Vortex.
  3. Seri olarak 1.56 uM BNT-II 'nin nihai bir konsantrasyona kadar HBS'de yarı yarıya 100 uM BNT-II seyreltin.
  4. HBS 96 oyuklu bir plakanın kuyularına, boş olarak hizmet veren, üç kopya halinde, her seyreltme oranından 100 ul ekle. Her numune için, 2 mM IR1 2.5 ul ekleyin.
  5. Shbir plaka karıştırıcısı üzerinde 10 dakika boyunca plaka ücadele.
  6. Çalkalamadan sonra, 96 oyuklu bir plaka okuyucu kullanılarak 510 nm'de (365 nm'de uyanm) emisyon yoğunluğunun okuyun.
    1. Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın.
    2. 510 nm, 365 nm ve emisyon dalga boyunda bir eksitasyon dalga boyunda bir flüoresan bitiş noktası okumak için yeni bir deney seti. Üst pozisyonda optik, 9nm hem dalga boyları için yarık genişliğini ayarlayın.
    3. Plaka okuma ve analiz için veri ihracat.
  7. Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanarak titrasyon örnekleri aktarın.

Biolayer İnterferometre kullanma IR1 / BNT-II Sistemi 4. Gerçek zamanlı Kinetik Analizi

  1. Kinetik tampon 200 ul ilave et; siyah 96 oyuklu plakanın birinci sütunda 8 oyuklara (KB 1x Fosfat% 0.02 Tween-20 ile tamponlanmış tuzlu su) ve plastik sensör içine plaka eklemetutucu. Dikkatli bir şekilde ipuçları tampon kuyu içerisinde süspanse edilir, öyle ki plastik tutucu ilk sütun 8, Ni (II) NTA biyosensörler aktarın. Interferometri enstrümanın sol tarafında plastik tutucu yerleştirin.
  2. KB BNT-II 'nin, bir 0.5 uM çözeltisi 2 ml hazırlayın.
  3. KB IR1 bir 10 uM solüsyon 500 ul hazırlayın ve seri KB cinsinden 0.156 mcM aşağı yarıya sulandırmak.
  4. Yeni bir siyah 96 oyuklu bir plaka, bir pipet kolon A ve C sınırlarındaki 8 çukurlara KB 200 ul
  5. Aynı plaka, sütun B'de kuyulara 0,5 um BNT-II çözeltisi pipet 200 ul
  6. Pipet kuyu D1 boş olarak KB ile başlayan kolon D içine IR1 her seyreltme, 200 ul. Kuyu sütununda aşağı aralıklı toparlanma seviye 1 konsantrasyonunda artış böylece dilüsyonları ekleyin.
  7. Ön ıslatma sensörleri içeren plaka sağ cihazda bu plaka koyun.
  8. Biolayer interferometri yazılımında, temel Kinet kurmakplaka, tahlil ve sensör ipuçları tanımlayarak ic deneyi.
    1. Plaka tanımlamak için, ekrandaki bir sütun seçin sağ tıklatın ve kuyular için uygun bir tanım seçin. Sütun D. sütun B sütunları A ve C için "Buffer", "Load" ve "Sample" seçiniz
    2. ("Add" düğmesine tıklayın) aşağıdaki adımları ekleyerek sonraki sekmesinde tahlil tanımlayın: Dengeleme (Özel), 60 saniye; Yükleniyor, 120 sn; Baseline, 60 saniye; Dernek, 120 sn; ve ayrışma, 300 sn. Dengelenme adımı seçin ve (B sütununu), Temel (sütun C), Derneği (kolon D) ve Ayrışma (sütun C) Loading sütun A. tekrarlayın çift tıklayın. Ni (II) NTA sensörleri seçin.
    3. Bir sonraki sekmeye geçmek ve sensörler plastik sensör tutucu A sütununda olduğunu onaylayın.
    4. Bir dosya adı eklemek, deney doğru özetlenen Onayla "gecikme deneyi" işaretli olduğundan emin olun ve basın "gidin."
      NOT: kinetik deney özetlenen sonra programlandığı gibi enstrümanın otomatik doğası nedeniyle, adımlar meydana gelecektir.
  9. Kinetik çalışma tamamlandıktan sonra, verilen işleme yazılımı verileri işlemek.
    1. Soldaki panelinin alt kısmının ilgi dosya ile klasörü çift tıklatın. Ardından, panelin üst kısmında "Kinetik" başlığı altında gelen klasörü çift tıklatın. İşleme sekmesine geçin.
    2. Sensör seçimi ekranını açmak için soldaki Çıkarma kutusunu işaretleyin. Sağ de A4 tıklayın ve Referans Well iyi türünü değiştirin.
    3. Y ekseni hizalama yanındaki kutuyu işaretleyin ve seçilen adım Baseline olduğundan emin olun. Başlangıçta son beş saniye (yaklaşık 55-60 sn) olmak üzere zaman aralığını belirtin.
    4. Inter-adım Düzeltme için kutuyu işaretleyin ve Ayrışma için Hizala'yı seçin. Savitzky-Golay Filtreleme kutusunun işaretli ve basın "Süreç Verileri emin olun! ̶1 'dir;
    5. Analiz sekmesine geçin. "Dernek ve Ayrılma" analiz adımlar için ve Model 1 olduğu seçim olduğundan emin olun: 1. Yerel Tam uyum seçiniz ve basın "Fit Curves!"
    6. Tablodaki tüm eğrileri vurgulayın ve doğru bir renk tüm eğrileri ayarlamak için tıklatın. Sonraki, renk ve Rmax Sensör Unlinked göre gruplandırılmış Global (Full) uyum seçin. Basın "Fit Curves!" Küresel kinetik verileri elde etmek.

5. On-boncuk IR1 ile BNT-II Algılama ve rcHRP-II

  1. 1 mi Tween ile HBS'de BNT-II ve rcHRP-II 'nin bir 1 uM her bir çözelti hazırlayın (HBST; HBS% 0.025 Tween 20).
  2. Seri olarak 15.6 nM'lik nihai bir konsantrasyona kadar HBST yarı yarıya her protein seyreltin.
  3. Pipet yüksek konsantrasyon aşağı sütunu düşük sırayla seyreltileri ile beyaz bir 96-çukurlu plaka içinde üç kopya halinde her seyreltme oranından 100 ul,,,.
  4. Pipet 50 um Ni 10 ul (IIHer bir seyreltme içine) NTA manyetik agaroz parçacıklar.
    1. Parçacıklar askıya kalmak emin olmak için her pipetleme sonra manyetik parçacıklar içeren ependorf tüp Vortex.
  5. 15 dakika parçacıklarla örnekleri inkübe için, bir plaka karıştırıcısı üzerinde plaka koyun.
  6. Bu inkübasyon süresinden sonra, 96 oyuklu bir plaka mıknatıs üzerinde plaka yerleştirmek ve parçacıklar çözeltinin dışarı çekmek için 30 saniye bekle.
  7. Bir çok kanallı pipet kullanarak, özgün örnek çekin ve atık olarak atın. Mıknatıstan plakasını sökün.
  8. Her bir kuyunun çok kanallı pipet kullanarak HBST 200 ul ekleyin. Manyetik parçacıkların yıkamak için yukarı ve aşağı birkaç kez tampon Pompa.
  9. Geri mıknatıs üzerine plaka koyun ve parçacıklar çözümün çekin için 30 saniye bekleyin.
  10. Çok kanallı pipet kullanarak, tampon 200 ul koparmak ve atık olarak atın. Mıknatıstan plakasını sökün.
  11. Yineleyin 5.8 Throug adımlarıH 5.10, iki katı parçacıkların üç yıkamadan tamamlayın.
  12. 2 mM IR1 2.5 ul ve ardından her bir oyuğa içeren manyetik partiküllere HBST 100 ul ekle.
  13. 1 saat boyunca, bir plaka karıştırıcısı üzerinde IR1 ile parçacıklar inkübe edin.
  14. 1 saat sonra, 96-çukurlu bir plaka okuyucusu kullanılarak 510 nm'de (365 nm'de uyanm) emisyon yoğunluğunun okuyun.
    1. Enstrüman plaka koyun ve yeni bir deneme kurmak için plaka okuyucu yazılımını açın.
    2. 510 nm, 365 nm ve emisyon dalga boyunda bir eksitasyon dalga boyunda bir flüoresan bitiş noktası okumak için yeni bir deney seti. Üst pozisyonda optik, 9 nm her iki dalga boyları için yarık genişliğini ayarlayın.
    3. Plaka okuma ve analiz için veri ihracat.
  15. Berrak bir 96-çukurlu plaka ve görüntü UV transilluminator kullanarak titrasyon örnekleri aktarın.

Representative Results

Şekil 1, metal merkezine çözünmeyen AgCl şeklinde klorür çökelmesi ile ana dimer klorid köprünün IR1 solvento kompleks ilgili bölme sentezi ve su moleküllerinin birlikte gösterildiği gibi. IR1 oluşumu, H 1 NMR ve ESI ile teyit edilmiştir. 365 nm'de uyarıldığında, ayrıca metal ligandı yük transferi karakteristik UV-görünür bant ve π-π * geçişler daha IR1 oluşumunu doğrulamak, spektrum tahsis edilmiştir. Bu kompleks sergilemeyen bir yayıcı karaktere solvatlanmış.


Şekil 1
Şekil 1:. Bölgesinin IR1 Dichlorotetrakis (2- (2-piridinil) fenil) Klorür köprüsü bölme reaksiyon sentezi ve karakterizasyonu diiridium (III) Akuo kompleksi Ir oluşturmak için (ppy) 2 (H2O) 2 + (IR1). Ilave edildikten sonra, L-His sulu tampon içinde Akuo kompleksi, lüminesan sinyal açılır.

Kompleksi sentezlenmiş ve karakterize edilmiştir kez daha önce benzer bir iridyum analog 17 kullanılarak tarif edildiği gibi, bir amino asit seçiciliği, analiz edilmiştir. Şekil 2A, 365 nm'de uyarıldığında, sadece histidin, 510 nm'de bir sinyal yanıtı ortaya göstermektedir.


Şekil 2,
Şekil 2: Amino Asit Seçiciliği ve histidin bakımından zengin peptitler ile IR1 Titrasyonu (A), 50 uM ile, çeşitli amino asitler (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His), 200 uM etkileşimi. HBS IR1. Spektral taramalar siyah 96 oyuklu bir plaka içerisinde 365 nm'lik bir uyarma dalga boyunda 400-700 nm alınmıştır. Tüm amino asitler b nispi floresans birimleri Sinyal (RFU)esides histidin (kesikli siyah iz) yok denecek kadar azdı. BNT-II (▪) ve rcHRP-II (♦) ve (B), nanomolar konsantrasyonlarda HBS'de IR1 ile titre edildi. histidin bakımından zengin peptitler 365 nm ışık ile uyarma sonrasında 510 nm'de emisyon okumadan önce çözelti içinde 15 dakika için sonda ile inkübe edilmiştir. Algılama limiti Y 3σ boş = x değeri olarak hesaplandı.

Histidin koordine edildiğinde Ir singlet uyarılmış durum (1 MLCT / 1 LC) (III) Bioconjugate üçlü uyarılmış duruma (3 MLCT) için sistemler arası geçiş uğrar çünkü iridyum probunun fosforesans Bu "on-switch" oluşur Metal merkezine. Bu prob BNT-II Plasmodium falciparum Histidin Zengin Protein II (HRP-II pf) sıtma belirteç mimik bir peptid uygulanmıştır. IR1 ile BNT-II 'nin, bir titrasyon olarak, konsantrasyon bağımlı bir sinyal tepkisi gözlendi ( Kd bir Ni (II), NTA yüzeyi üzerinde hareketsiz 2.05 uM (Şekil 3) olduğu bulunmuştur.

Şekil 4,

Şekil 3:. Bir Ni (II), NTA, cam sensörünün yüzeyi üzerinde BNT-II bağlanmasını IR1 çeşitli konsantrasyonlarda kinetik analizi için BNT II Biolayer interferometri ile IR1 gerçek zamanlı Kinetik Analizi. KB (Bölge A) sensörleri dengelenmesinden sonra, sensörler 0.5 uM BNT-II (Bölge B) ile yüklenir. Peptit sensörleri üzerinde yüklendikten sonra, bir temel öncesinde BNT-II (Bölge D) IR1 dernek ölçme (Bölge C) kuruldu. SonraDerneğin bir süre, sensörler ayrışma (Bölge E) ölçmek için KB geri yerleştirilir. Bütün kinetik analiz süreci az 30 dakika sürer.

Bir manyetik parçacık platformuna çözeltisi tabanlı testte geçtiğinde, sistem içinde parçacığın ilave karmaşıklığı göz önüne alınması gerekiyordu. Görüldüğü gibi, yukarıda tarif 24 Siyah floresan plakalar çözüm tahlil için çalıştı. Bu parçacıklar verimli sıtma biyogösterge pf HRP-II bağlamak olduğunu, daha önceki çalışmalar ile bilinen, ancak beyaz plakalar üzerinde parçacık algılama platformu için daha uygun idi Şekil 4A. Beyaz bir levha, ışık ve böylece parçacığın yüzeyine bağlanmış IR1 ile daha iyi bir emiş sağlayan geri numune içine yansıtılmaktadır. Üzerinde parçacık tahlilde, rcHRP-II 'nin tespit limiti 14.5 nM (Şekil 4B) olduğu belirlenmiştir. rcHRP-II için tespit limiti solüsyonu-in ve on-boncuk statis vardıBir eşleştirilmemiş t-testi (p = 0,731) dayalı olarak an- aynı.

Şekil 5,
Şekil 5,


Şekil 4: a. Siyah 50 um Ni yüzeyinde BNT-II'ye bağlanan IR1 alınan sinyal arasındaki üzerinde boncuk BNT-II ve HRP-II Saptanması (A) fark (II), NTA, manyetik agaroz parçacıkları 96- de beyaz 96-kaynak plaka (kesikli çizgi) karşı plaka (düz çizgi). parçacıklar 365 nm ışık ile ikaz edilmiş ve emisyon 510 nm'de ölçülmüştür. RcHRP-II 'nin (B)' titrasyon manyetik parçacıklar üzerinde hareketsiz ve IR1 ile tespit edildi. Algılama limiti va olarak hesaplanmıştırx Lue y 3σ boş = olduğunda.

Şekil 5,

Şekil 5: IR1 ile rcHRP-II üzerinde boncuk Algılama şematik temsili Ni (II), NTA parçacıklar ve IR1 ile etiketlenmiş yüzeyine bağlaması, HRP-II 'nin genel şeması.. tanecikler, 15 dakika boyunca bir histidin açısından zengin peptid ile inkübe edilir. Bu inkübasyon süresinden sonra, parçacıklar HBST çözeltiden parçacıkları çekmek için, bir mıknatıs kullanılarak yıkanır. Son olarak, peptid bağlanan parçacıklar önce, 365 nm ışık ile uyarma sonrasında 510 nm'de emisyon okuma 1 saat boyunca IR1 ile inkübe edilir.

Discussion

Mikropartikül tabanlı tanılama araçları modern tanı teknolojinin ön plana gelmek gibi, doğrudan parçacığın yüzeyi üzerinde hedef biyomoleküllerin tespiti önemli bir avantajdır. ELISA ve PCR gibi geleneksel moleküler tanı yöntemleri, şöyle ki algılama 25 arasında çok düşük limitler elde edilebilir, avantajlıdır. Ancak, bu deneyler geniş reaktifler ve uzun protokoller gerektirir. Bu deney süresi ve reaktif koşulları (Şekil 5) olmadan, ELISA tipi bir sandviç etkileşimleri taklit etmek için tasarlanmıştır. Tipik bir ELISA için antikorların maliyeti numune başına $ 0,20-0,30 ise ek olarak, numune başına IR1 prob maliyeti, peni civarında olduğu tahmin edilmiştir.

Yukarıda tarif edilen yöntemler, sıtma belirteç saptanması için bir cyclometalated iridyum prob dayandığı bu sondanın, diğer algılama yöntemlerinin ortak arıza modu (örn. Fluorofor quenchi duyarlı olmayacaktırNG ve antikor / enzim parçalanma). Histidin metal bağlanma özellikleri açısından benzersizdir. özetlenen işleme metal ihtiva eden kompleksleri ile, tipik bir ELISA sandviç antikorları değiştirerek bu fenomenin yararlanır. Ni (II), NTA, parçacığın yüzeyi üzerinde rcHRP-II 'yi yakalar ve IR1 proteinin varlığını işaret eder. tahlilde en kritik adım manyetik partiküller numune ve sonda ile karıştırmak için izin veriyor. 96 oyuklu bir plaka ELISA, biyomoleküllerin ve reaktifler de alt kısmının, iki boyutlu bir yüzey ile dengeye ulaşır. Manyetik parçacıklar nedeniyle mevcut bağlanma siteleri azaltacaktır onların yoğun demir-oksit çekirdek, çözümün dışında yerleşmek eğilimi var. Bu nedenle, parçacıklar maksimum bağlanma sağlamak için deney süresince karıştırılmalıdır.

Hastalığın teşhis için bir ayıraç tasarlarken, akılda hasta numunesinin formu gibi bir belirteç fizyolojik konsantrasyon tutmalıdır. Içinmalarya, hastanın kanında pf HRP-II konsantrasyonu, yüksek nanomolar düşük pikomolardan değişebilir. Bu deney, enfeksiyonun daha yüksek seviyeleri için klinik olarak anlamlı iken, tespit limiti, düşük pikomolar HRP-II pf sirküle olan asemptomatik hastaların tespit etmek için geliştirilmiş olması gerekiyor. Yukarıda ana hatları çizilen yöntemler, in "Çalıştırma" IR1 tarafından üretilen sinyal histidin varlığında meydana gelir. Sıtma biyomarker histidin açısından zengin iken, insan serum albümini ve histidin bakımından zengin glikoproteinin gibi serum proteinleri, prob ile, bir sinyal tepkisine neden olacaklardır. Bu da yanlış pozitif tanılara yol açacak. Bu yararlı bir aşama olması ile ilgili protein hızlı bir hasta numunesinden elde edilebilir parçacığın yüzeyi üzerinde protein yakalama yapar. Ayrıca, iki fonksiyonlu prob tasarımı sağlam bir moleküler tanıma elemanına çiftler histidin zengin peptid (yani. Aptamer olduğunu) Tahlile özgüllük bir tabaka eklenebilir. peptid aptamer bağlanmadan önce iridyum yüklenmiş olacaktır. Aptamer hedef özgüllük elde ederken böyle bir tasarımda, istikrarlı IR1 prob hala kullanılabilir. Bu kompleks matris (örn., Plazma ya da bütün kan) yerli HRP II algılamak ve spesifik olmayan bağlanma etkilerini azaltmak için prob uygulanması için izin verecektir. Daha hızlı bir tanısal testlerin sinyalini geliştirmek için, deney pf HRP II elektrokimyasal okuma 26 ile RDTs tespit edilebilir bir elektrokemilüminesan (ECL) sistemi içine dahil edilebilir. Bu yeni nesil iridyum probu büyük ölçüde hastalık biyobelirteçlerinin tespiti için bizim on-boncuk ELISA testi artıracaktır.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III)  Sigma-Aldrich 658383
silver trifluoromethanesulfonate Sigma-Aldrich 176435
Silica gel Sigma-Aldrich 6858
L-Amino acids Fisher Scientific varies
HEPES Sigma-Aldrich H3375
BNT-II peptide Synthesized in house N/A
recombinant HRPII Immunology Consultants Laboratory inc. AGPF-55
Costar black polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-567
Costar white polypropylene 96-well plate Fisher Scientific 07-200-589
Grenier black polypropylene 96-well plate VWR 89089-582
Ni(II)NTA magnetic agarose particles Qiagen 36111
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors ForteBio 18-5101
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet ForteBio
Biotek Synergy H4 Microplate Reader Biotek
Fisher Biotech Transilluminator Fisher Scientific FBDLT-88

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gubala, V., Harris, L. F., Ricco, A. J., Tan, M. X., Williams, D. E. Point of Care Diagnostics: Status and Future. Analytical Chemistry. 84, 487-515 (2011).
  2. Kuzmenko, A., et al. Single molecule tracking fluorescence microscopy in mitochondria reveals highly dynamic but confined movement of Tom40. Scientific Reports. 1, (2011).
  3. Sassolas, A., Leca-Bouvier, B. D., Blum, L. J. DNA Biosensors and Microarrays. Chemical Reviews. 108, 109-139 (2007).
  4. Miyawaki, A., Sawano, A., Kogure, T. Review: Lighting up cells: labelling proteins with fluorophores. Nature Cell Biology. 5, S1-S7 (2003).
  5. Liu, M., et al. Highly sensitive protein detection using enzyme-labeled gold nanoparticle probes. Analyst. 135, 327-331 (2010).
  6. Almeida, M., Carabineiro, S. C. The role of nanogold in human tropical diseases: research, detection and therapy. Gold Bulletin. 46, 65-79 (2013).
  7. Holder, E., Langeveld, B. M. W., Schubert, U. S. New Trends in the Use of Transition Metal–Ligand Complexes for Applications in Electroluminescent Devices. Advanced Materials. 17, 1109-1121 (2005).
  8. Wagenknecht, P. S., Ford, P. C. Metal centered ligand field excited states: Their roles in the design and performance of transition metal based photochemical molecular devices. Coordination Chemistry Reviews. 255, 591-616 (2011).
  9. Lamansky, S., et al. Highly Phosphorescent Bis-Cyclometalated Iridium Complexes: Synthesis, Photophysical Characterization, and Use in Organic Light Emitting Diodes. Journal of the American Chemical Society. 123, 4304-4312 (2001).
  10. Ho, M. -L., et al. Synthesis, structure and oxygen-sensing properties of Iridium(iii)-containing coordination polymers with different cations. Dalton Transactions. 41, 2592-2600 (2012).
  11. McDaniel, N. D., Coughlin, F. J., Tinker, L. L., Bernhard, S. Cyclometalated Iridium(III) Aquo Complexes: Efficient and Tunable Catalysts for the Homogeneous Oxidation of Water. Journal of the American Chemical Society. 130, 210-217 (2007).
  12. Ma, D. -L., et al. A Highly Selective Luminescent Switch-On Probe for Histidine/Histidine-Rich Proteins and Its Application in Protein Staining. Angewandte Chemie International Edition. 47, 3735-3739 (2008).
  13. Ma, D. -L., He, H. -Z., Leung, K. -H., Chan, D. S. -H., Leung, C. -H. Bioactive Luminescent Transition-Metal Complexes for Biomedical Applications. Angewandte Chemie International Edition. 52, 7666-7682 (2013).
  14. Leung, C. -H., et al. A Metal-Based Inhibitor of Tumor Necrosis Factor-α. Angewandte Chemie International Edition. 51, 9010-9014 (2012).
  15. You, Y., Nam, W. Photofunctional triplet excited states of cyclometalated Ir(iii) complexes: beyond electroluminescence. Chemical Society Reviews. 41, (21), 7061-7084 (2012).
  16. Zhao, Q., et al. Cationic Iridium(III) Complexes with Tunable Emission Color as Phosphorescent Dyes for Live Cell Imaging. Organometallics. 29, 1085-1091 (2010).
  17. Li, C., et al. A Nonemissive Iridium(III) Complex That Specifically Lights-Up the Nuclei of Living Cells. Journal of the American Chemical Society. 133, 11231-11239 (2011).
  18. Jones, A. L., Hulett, M. D., Parish, C. R. Histidine-rich glycoprotein: A novel adaptor protein in plasma that modulates the immune, vascular and coagulation systems. Immunology, & Cell Biology. 83, 106-118 (2005).
  19. Panton, L. J., et al. Purification and partial characterization of an unusual protein of Plasmodium falciparum: histidine-rich protein II. Molecular and Biochemical Parasitology. 35, 149-160 (1989).
  20. Schneider, E. L., Marletta, M. A. Heme Binding to the Histidine-Rich Protein II from Plasmodium falciparum. Biochemistry. 44, 979-986 (2004).
  21. Mabey, D., Peeling, R. W., Ustianowski, A., Perkins, M. D. Tropical infectious diseases: Diagnostics for the Developing World. Nature Reviews Microbiology. 2, 231-240 (2004).
  22. Ziegler, J., Chang, R. T., Wright, D. W. Multiple-Antigenic Peptides of Histidine-Rich Protein II of Plasmodium falciparum: Dendrimeric Biomineralization Templates. Journal of the American Chemical Society. 121, 2395-2400 (1999).
  23. Schmid, B., Garces, F. O., Watts, R. J. Synthesis and characterizations of cyclometalated iridium(III) solvento complexes. Inorganic Chemistry. 33, 9-14 (1994).
  24. Davis, K. M., Swartz, J. D., Haselton, F. R., Wright, D. W. Low-Resource Method for Extracting the Malarial Biomarker Histidine-Rich Protein II To Enhance Diagnostic Test Performance. Analytical Chemistry. 84, 6136-6142 (2012).
  25. Giljohann, D. A., Mirkin, C. A. Drivers of biodiagnostic development. Nature. 462, 461-464 (2009).
  26. Li, M. -J., et al. High electrochemiluminescence of a new water-soluble iridium(iii) complex for determination of antibiotics. Analyst. 136, 205-210 (2011).
Malarya Protein Biyomarker Histidin Zengin Protein-II Tespiti için İridyum (III) Lüminesans Probe
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).More

Davis, K. M., Bitting, A. L., Markwalter, C. F., Bauer, W. S., Wright, D. W. Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II. J. Vis. Exp. (101), e52856, doi:10.3791/52856 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter