Robust detection reagents are of increasing necessity for developing new malaria diagnostic tools. An iridium(III) probe was designed that emits long-lasting luminescent signal in the presence of a histidine-rich malarial protein biomarker. Detection of the protein either in solution or immobilized on a magnetic particle affords flexibility in application.
Bu çalışma olmayan bir yayım sentezini ana hatlarıyla cyclometalated Ir (III) kompleksi, Ir (ppy) 2 (H2O) 2 histidine- koordine olduğunda hızlı, uzun ömürlü fosforlu sinyali ortaya çıkarmaktadır + (IR1), manyetik parçacığın yüzeyi üzerinde hareketsizleştirilmiş protein ihtiva etmektedir. IR1 sentezi, yüksek verimlerle, / K tam bir O ve solvatlanmış kompleks iki eşdeğer olarak Ir (III) 'ün kloro-köprülü dimer cyclometalated ebeveynin bölme içerir. Özgünlüğünü teyit etmek için, sentezlenmiş prob ilave edildiğinde çeşitli amino asitler koordinasyon aktivitesi için problandı ve sadece histidin sinyal karşılığını ortaya çıkardı. BNT-II, sıtma belirteç Histidin zengin protein II (pfHRP-II) 'in bir dallı peptit taklidi gibi davranır kullanarak, iridyum prob HRP II tespiti için bir araç olarak doğrulanmıştır. L-Histidin / IR1 kıyasla söndürme etkisi BNT-II / IR1 titrasyonu dikkat çekildi, ancak bu sterik engel ve tri atfedilmiştirdevlet su verme plet. Biolayer interferometri BNT-II ile IR1 etkileşimi gerçek zaman kinetiklerini belirlemek için kullanılmıştır. Sistem optimize sonra, prob kullanılarak rcHRP-II 'nin tespit limiti çözeltisi içinde 12.8 nM olduğu tespit edilmiştir. Bu protein, bir 50 um, manyetik agaroz parçacık yüzeyi üzerinde immobilize edildi, algılama sınırı 14.5 nM idi. Sağlam sinyali, bu inorganik prob tepki olarak çözelti içinde kullanım esnekliği ya da bir yüzey üzerinde immobilize, diagnostik kullanım görüntülemeye, çeşitli uygulamalarda doğru elverişli olabilir.
Kolorimetrik ve floresan etiketleme biyokimyasal moleküllerin tespiti ve takibi için önemli bir yöntemdir ve 1,2 işler. En yaygın fluoresan işaretleyiciler, düşük molekül ağırlıklı organik boyalar 3,4, ancak bu moleküller her zaman ideal optik özelliklere sahip değildir. Floresan boyalar genellikle küçük Stokes kaymalar, ve üst üste binen uyarma ve emisyon spektrumlarına sahip olabilir, ışıkla ağartma yatkındır. Kolorimetrik markalama genellikle bağışıklık miktar 5,6 yararlı olan güçlendirilmiş bir sinyal enzimatik etiketler, kullanımı ile elde edilir. Bu enzimler aynı zamanda fotosensitivite, reaksiyon koşulları ve kısa alt-tabaka raf ömrü dahil olmak üzere kendi dezavantajları vardır. Bu özellikler masraflı belirteçleri kullanarak iyi kontrollü şartlar altında yapılması gereken immün ve protein etiketleme yöntemleri gerektiren eğilimindedir.
Yayıcı geçiş metali kompleksleri, alternatif etiketleme yaklaşımı FO olarak araştırılmıştırBiyokimyasal algılama r. Özellikle, (III), 7-9 oksijen 10 algılama organik ışık yayan diyotlar (OLED) kapsamında incelenen 11 kataliz ve protein / hücre 12-14 boyama olmuştur Ir cyclometalated. Yüksek fotostabilite ve kuantum verimliliği sondaları bu sınıf biyomolekülün tespiti 15,16 için iyi bir aday olun. Bu, daha önce formun, (III) kompleksleri Ir cyclometalated olduğu tespit edilmiştir [Ir (Cı ^ K) 2 (Solv) 2] +, geri dönüşü olmayan histidin bağlanan ve mavi-yeşil bir sinyal yanıtı 12,17 neden olabilir. Bu kompleksler solvento halde olmayan yayım, ancak histidin çözücü moleküllerini değiştirir ve metal merkezine bağlandığı zaman, uzun dalga UV ışınımı sonrasında yoğun bir fosforlu sinyali bırakın. Bu sinyal, yalnızca ligand ikamesi sonra oluşur ve metal ligand yük transferi aktivasyonu yoluyla zemin durumuna rahatlatıcı bir üçlü devlet elektronun sonucu (3 ML olduğunuBT) ve ligand merkezli transferi (3 LC) 8,15 yolaklarıyla. Bu kompleksler, potansiyel olarak histidin bakımından zengin proteinleri için algılama sondalar olarak kullanılabilir.
Histidin bakımından zengin proteinler ve regülasyon seviyeleri karaciğer sirozu, kanser ve trombik bozukluklar da dahil olmak üzere, pek çok hastalıkta önemlidir. Özellikle 18 Plasmodium falciparum Histidin zengin protein II (pfHRP-II) 'sıtma paraziti enfeksiyonu için iyi olarak geçerliliği biyomarkerdir. Bu protein en çok karakteristik AHHAHHAAD tekrar motifler 19 içinde, 67 kDa ve 34% histidin içerir. Bu histidin tekrarlar ücretsiz metal iyonlarını 19 bağlayabilir ve heme konak kanda 20 kompleksleri. pfHRP-II yaygın immunokromatografik hızlı tanı testleri (RDTs) kullanarak düşük kaynak ortamlarda algılandı ancak bu testler nedeniyle numune koşulları, düşük biyobelirteç konsantrasyonu, kötü üretim standartları ve antikor bozulması 21 genellikle yanlıştır.
<p class="Jove_content"> örneğin cyclometalated Ir gibi metal tabanlı fosforlu sondalar (III) 'ün yukarıda tarif edilen kompleksler nedeniyle histidin seçici bağlayıcı ve stabil ve etkili bir emisyon özellikleri pfHRP-II' nin tespiti için çekici bir seçenek vardır. Bu yazıda, kullanılması [ir (ppy) 2 (H2O) 2] + (IR1) BNT-II, 22 keşfedilmeden pfHRP-II dallı bir peptid taklidi gibi davranır algılamak için. Bu etkileşimin kinetik biolayer interferometre teknikleri kullanılarak gerçek zamanlı olarak takip edildi. Tahlil ayrıca tespit nanomolar limitleri elde edildi bir on-boncuk ELISA-tipi biçimi, adapte edildi. Bunun yerine, 4-5 saat ve tipik ELISA ile istenen biyolojik reaktifler, antikor içermeyen reaktifler ile, 2 saat altında gerçekleştirilebilir, çünkü bu deney, geleneksel ELISA fazla avantajlar tutar.Mikropartikül tabanlı tanılama araçları modern tanı teknolojinin ön plana gelmek gibi, doğrudan parçacığın yüzeyi üzerinde hedef biyomoleküllerin tespiti önemli bir avantajdır. ELISA ve PCR gibi geleneksel moleküler tanı yöntemleri, şöyle ki algılama 25 arasında çok düşük limitler elde edilebilir, avantajlıdır. Ancak, bu deneyler geniş reaktifler ve uzun protokoller gerektirir. Bu deney süresi ve reaktif koşulları (Şekil 5) olmadan, ELISA tipi bir sandviç etkileşimleri taklit etmek için tasarlanmıştır. Tipik bir ELISA için antikorların maliyeti numune başına $ 0,20-0,30 ise ek olarak, numune başına IR1 prob maliyeti, peni civarında olduğu tahmin edilmiştir.
Yukarıda tarif edilen yöntemler, sıtma belirteç saptanması için bir cyclometalated iridyum prob dayandığı bu sondanın, diğer algılama yöntemlerinin ortak arıza modu (örn. Fluorofor quenchi duyarlı olmayacaktırNG ve antikor / enzim parçalanma). Histidin metal bağlanma özellikleri açısından benzersizdir. özetlenen işleme metal ihtiva eden kompleksleri ile, tipik bir ELISA sandviç antikorları değiştirerek bu fenomenin yararlanır. Ni (II), NTA, parçacığın yüzeyi üzerinde rcHRP-II 'yi yakalar ve IR1 proteinin varlığını işaret eder. tahlilde en kritik adım manyetik partiküller numune ve sonda ile karıştırmak için izin veriyor. 96 oyuklu bir plaka ELISA, biyomoleküllerin ve reaktifler de alt kısmının, iki boyutlu bir yüzey ile dengeye ulaşır. Manyetik parçacıklar nedeniyle mevcut bağlanma siteleri azaltacaktır onların yoğun demir-oksit çekirdek, çözümün dışında yerleşmek eğilimi var. Bu nedenle, parçacıklar maksimum bağlanma sağlamak için deney süresince karıştırılmalıdır.
Hastalığın teşhis için bir ayıraç tasarlarken, akılda hasta numunesinin formu gibi bir belirteç fizyolojik konsantrasyon tutmalıdır. Içinmalarya, hastanın kanında pf HRP-II konsantrasyonu, yüksek nanomolar düşük pikomolardan değişebilir. Bu deney, enfeksiyonun daha yüksek seviyeleri için klinik olarak anlamlı iken, tespit limiti, düşük pikomolar HRP-II pf sirküle olan asemptomatik hastaların tespit etmek için geliştirilmiş olması gerekiyor. Yukarıda ana hatları çizilen yöntemler, in "Çalıştırma" IR1 tarafından üretilen sinyal histidin varlığında meydana gelir. Sıtma biyomarker histidin açısından zengin iken, insan serum albümini ve histidin bakımından zengin glikoproteinin gibi serum proteinleri, prob ile, bir sinyal tepkisine neden olacaklardır. Bu da yanlış pozitif tanılara yol açacak. Bu yararlı bir aşama olması ile ilgili protein hızlı bir hasta numunesinden elde edilebilir parçacığın yüzeyi üzerinde protein yakalama yapar. Ayrıca, iki fonksiyonlu prob tasarımı sağlam bir moleküler tanıma elemanına çiftler histidin zengin peptid (yani. Aptamer olduğunu) Tahlile özgüllük bir tabaka eklenebilir. peptid aptamer bağlanmadan önce iridyum yüklenmiş olacaktır. Aptamer hedef özgüllük elde ederken böyle bir tasarımda, istikrarlı IR1 prob hala kullanılabilir. Bu kompleks matris (örn., Plazma ya da bütün kan) yerli HRP II algılamak ve spesifik olmayan bağlanma etkilerini azaltmak için prob uygulanması için izin verecektir. Daha hızlı bir tanısal testlerin sinyalini geliştirmek için, deney pf HRP II elektrokimyasal okuma 26 ile RDTs tespit edilebilir bir elektrokemilüminesan (ECL) sistemi içine dahil edilebilir. Bu yeni nesil iridyum probu büyük ölçüde hastalık biyobelirteçlerinin tespiti için bizim on-boncuk ELISA testi artıracaktır.
The authors have nothing to disclose.
Support for this work was provided by the Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health: Develop Technologies That Allow Assessment of Multiple Conditions and Pathogens at Point-of-Care. K.M.D. was supported by an NSF Graduate Research Fellowship (2012095464).
Dicholortetrakis(2-(2-pyridinyl)phenyl)diiridium(III) | Sigma-Aldrich | 658383 | |
silver trifluoromethanesulfonate | Sigma-Aldrich | 176435 | |
Silica gel | Sigma-Aldrich | 6858 | |
L-Amino acids | Fisher Scientific | varies | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
BNT-II peptide | Synthesized in house | N/A | |
recombinant HRPII | Immunology Consultants Laboratory inc. | AGPF-55 | |
Costar black polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-567 | |
Costar white polypropylene 96-well plate | Fisher Scientific | 07-200-589 | |
Grenier black polypropylene 96-well plate | VWR | 89089-582 | |
Ni(II)NTA magnetic agarose particles | Qiagen | 36111 | |
Ni(II)NTA biolayer interferometry sensors | ForteBio | 18-5101 | |
Octet Red96 Biolayer Interferometry Instrumet | ForteBio | ||
Biotek Synergy H4 Microplate Reader | Biotek | ||
Fisher Biotech Transilluminator | Fisher Scientific | FBDLT-88 |