Abstract
للدخول المضيف البشري، نوع فيروس الهربس البسيط 1 (HSV-1) يجب التغلب على حاجز الأسطح المخاطية والجلد، أو القرنية. HSV-1 الأهداف الكيراتينية خلال الدخول الأولي، ويضع العدوى الأولية في الظهارة، والتي تبعتها العدوى الكامنة من الخلايا العصبية. بعد تنشيط، يمكن أن الفيروسات تصبح واضحة في مواقع المخاطية الجلدية التي تظهر حويصلات أو قرحات الجلد المخاطية. كيف يغزو HSV-1 الجلد أو الغشاء المخاطي، ويصل غير مفهومة مستقبلاته. للتحقيق في الطريق غزو HSV-1 في أنسجة البشرة على المستوى الخلوي، أنشأنا فيفو السابقين نموذج إصابة البشرة الفئران، وهو ما يمثل الموقع من العدوى الأولية والمتكررة في الجلد. ويشمل الفحص إعداد الجلد الفئران. يتم فصل البشرة من الأدمة عن طريق العلاج dispase الثاني. بعد تعويم ورقة البشرة على المتوسطة التي تحتوي على الفيروس، والنسيج هو ثابت ويمكن تصور العدوى في مختلف الأوقات بعد العدوى عن طريقتلطيخ الخلايا المصابة مع الأجسام المضادة ضد HSV-1 الفوري في وقت مبكر من البروتين ICP0. معربا عن ICP0 الخلايا يمكن ملاحظتها في طبقة الخلايا الكيراتينية القاعدية بالفعل في 1.5 ساعة بعد العدوى. مع أوقات أطول العدوى، تم الكشف عن الخلايا المصابة في طبقات suprabasal، مشيرا إلى أن العدوى لا يقتصر على الخلايا الكيراتينية القاعدية، ولكن الفيروس ينتشر إلى الطبقات الأخرى في الأنسجة. باستخدام أوراق البشرة من نماذج الماوس المختلفة، وبروتوكول العدوى يسمح تحديد إشراك المكونات الخلوية التي تساهم في HSV-1 إلى غزو الأنسجة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الاختبار هو مناسبة لاختبار مثبطات في الأنسجة التي تتداخل مع خطوات دخول الأولية، وانتشار الخلايا إلى الخلايا وإنتاج الفيروس. هنا، نحن تصف خارج الجسم الحي بروتوكول الإصابة بالتفصيل وتقديم النتائج لدينا باستخدام الفئران nectin-1- أو HVEM ناقصة.
Introduction
فيروس الهربس البسيط (HSV) يمكن أن تسبب مجموعة من الأمراض لدى البشر من آفات جلدية مخاطية غير معقدة خفيفة للعدوى تهدد الحياة. نوع HSV 1 (HSV-1) يرتبط بصورة شائعة مع التهابات فموي وجهي والتهاب الدماغ، في حين HSV نوع 2 (HSV-2) أكثر عرضة يسبب الالتهابات التناسلية 1. في حين أن هناك تقدما كبيرا في فهم كيف يدخل HSV الخلايا في الثقافة، ويبدأ العدوى وينتج ذرية الفيروسية، ونحن نعرف القليل عن مسار الفيروسي الغزو (ق) في الأنسجة على المستوى الخلوي 2. للدراسات HSV الجلد أو التهابات الغشاء المخاطي، والفئران، وقد استخدمت الأرانب والخنازير الغينية كما النماذج الحيوانية. تأسست عدوى الجلد عن طريق الحقن داخل الأدمة أو خدش الجلد في وجود فيروس، وارتبط تطور المرض مع إنتاج فيروس. هذه الأساليب ساعدت على فهم الجوانب المختلفة لإمراض المرض، وتستخدم لتقييم الأدوية المضادة للفيروسات. لدراسة العدوى HSV في TISSUمستوى البريد، وقد طبقت عضوي النمط نماذج الجلد البشري. كما أن معدل الإصابة يقتصر في هذه الثقافات طوف، وقد تم نشر سوى عدد محدود من الدراسات التحقيق العدوى، وانتشار الفيروس وآثار المكونات المضادة للفيروسات 3-6.
من أجل توصيف محددات الخلوية التي تلعب دورا خلال العدوى HSV-1 في ظهارة سليمة، أنشأنا بروتوكول لالسابقين الدراسات المجراة إصابة البشرة الفئران 7. تم إعداد البشرة من الأطفال حديثي الولادة أو من ذيول فئران بالغة. منذ HSV-1 لا يمكن أن تصيب عينات الجلد كاملة، والتي كانت غارقة في المتوسط المحتوية على الفيروس، انفصلنا البشرة من الأدمة من قبل dispase II العلاج. بعد تعويم ورقة البشرة في المتوسط المحتوية على الفيروس والخلايا المصابة يمكن تصور في طبقة البشرة القاعدية في مختلف الأوقات بعد العدوى (بي) 7. لتصور الشروع في العدوى في الخلايا الفردية قبل تكاثر الفيروس لالثاني إنتاج الفيروس، ونحن ملطخة أجسام مضادة ضد بروتين الخلية المصابة 0 (ICP0)، التي تعد واحدة من البروتينات الأولى أعرب خلال العدوى HSV-1. توطين الخلوية من ICP0 يمر عبر مراحل متميزة خلال العدوى في وقت مبكر. في حين ICP0 موجود في بؤر النووي خلال مرحلة مبكرة من الفيروسية التعبير الجيني، إعادة المركزية من ICP0 إلى السيتوبلازم يشير إلى مرحلة لاحقة للإصابة 8.
استخدمنا خارج الجسم الحي الفحص إصابة أوراق البشرة من نماذج مختلفة الماوس لاختبار الدور المحتمل لمختلف العوامل الخلوية خلال العدوى. لمعالجة آثار RAC1 كمنظم رئيسي للديناميات الأكتين، ونحن إصابة البشرة من الفئران مع حذف الخلايا الكيراتينية محددة من الجين RAC1 9. هذا النموذج يسمح لنا لدراسة الآثار المترتبة على نقص RAC1 على كفاءة العدوى HSV-1 في طبقات البشرة الخلايا الكيراتينية. وبالمقارنة مع البشرة المصابة من تتزاحم التحكم إعادةvealed لا يوجد فرق كبير، مشيرا إلى أن غياب RAC1 لم يكن لها تأثير على بدء الإصابة في الطبقة القاعدية من البشرة 7. استخدام المزيد من نماذج الماوس سمح لنا لمعالجة المستقبلات الخلوية التي تتوسط دخول إلى البشرة. اصابة أوراق البشرة من أي nectin-1- أو الفئران التي تعاني من نقص HVEM مع HSV-1 كشفت أن دخول الفيروس الأولي في الأنسجة تعتمد بقوة على وجود nectin-1 10. وعلاوة على ذلك، تظهر نتائجنا أن HVEM يمكن أيضا أن تكون بمثابة مستقبلات في البشرة الفئران، على الرغم من أن أقل كفاءة من nectin-1 10.
لمعالجة التوزيع المكاني للخلايا المصابة في طبقات البشرة، ونحن تصور التعبير ICP0 في قطاعات النسيج والبشرة يتصاعد كلها (الشكل 1). في cryosections من الجلد الكامل، يتم الكشف عن أي خلايا في التعبير عن ICP0 (الشكل 1). في المقابل، cryosections من أوراق البشرة تثبت حشويةالتعبير ICP0 في الطبقة القاعدية بالفعل في 3 ساعات بي (الشكل 1). في أوقات لاحقة، نشر الفيروسية لsuprabasal طبقات يمكن تصور. التوزيع المكاني للخلايا المصابة في الطبقة القاعدية يمكن اتباعها بسهولة في البشرة يتصاعد كلها (الشكل 1). على العدوى مع HSV-1 في 100 PFU / الخلية، ما يقرب من 50٪ من الخلايا الكيراتينية القاعدية في البشرة البيني تظهر التعبير ICP0 في 1.5 ساعة بي عند هذه النقطة الوقت معظم الخلايا المصابة تعبر عن ICP0 النووي. وإعادة المركزية من ICP0 إلى السيتوبلازم يشير إلى مرحلة لاحقة من أوائل التعبير الجيني موجودة في جميع الخلايا تقريبا في 3 ساعة بي (الشكل 1). هذه الأنماط من تصور الخلايا المصابة على فيفو السابقين HSV-1 العدوى توفر فحص قوية لدراسة تأثير مثبطات أو حذف / المكونات الخلوية متحولة على دخول الفيروس وانتشاره في الأنسجة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق.
ويتم إعداد ورقة البشرة من الأضاحي وفقا صارم مع توصيات الدليل من Landesamt FÜR الناطور، UMWELT وVerbraucherschutz، Northrhine وستفاليا (ألمانيا). وتمت الموافقة على الدراسة من قبل LANUV NRW (عدد 8.84-02.05.20.13.018).
1. إعداد أدوات والثقافة وسائل الإعلام
- زراعة أوراق البشرة في المتوسط تعديل النسر Dulbecco ولل(DMEM) / الجلوكوز المرتفعة تحتوي على ثنائي الببتيد الجلوتامين، و 10٪ FCS، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين (المشار إليها فيما يلي باسم "DMEM").
- لإعداد ورقة البشرة، حل بعناية dispase II مسحوق (5 ملغ / مل) في برنامج تلفزيوني ساخنة (تصل إلى 37 درجة مئوية). مرشح الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون واستخدامها مباشرة لتلقي العلاج.
- لإعداد البشرة كلها يتصاعد 13، وإعداد حجب برتقاليإيه مع 0.5٪ مسحوق الحليب، 0.25٪ الجيلاتين من جلد أسماك المياه الباردة و 0.5٪ تريتون X-100 في TBS. السماح المواد بحل التي يحتضنها الخليط لمدة لا تقل عن 2 ساعة على RT على خلاط الدورية. إعداد أيضا 0.2٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني كما غسل العازلة. لتثبيت وإعداد 3.4٪ و 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
- لالمناعية من cryosections، وإعداد عازلة تمنع مع 5٪ مصل الماعز العادي و 0.2٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني. لتثبيت وإعداد 0.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني.
2. إعداد صحائف البشرة من الجلد الفئران
- إعداد البشرة من الجلد الخلفي الوليد للدراسات العدوى
- ضع الماوس مقطوعة الرأس (بعد 1-3 أيام من ولادته) في طبق تشريح وقطع الأطراف والذيل على مقربة من الجذع للسماح إزالة فعالة من الجلد من الجذع كاملة. خلال إزالة الحدود القصوى، في محاولة للحفاظ على تخفيضات صغيرة قدر الإمكان في القطر.
- إصلاح الجذع مع منحني ملقط غرامة لND تحرك بلطف مقص طرف حادة تحت الجلد من الجمجمة لالذيلية على طول الظهر لفصل الجلد من الجذع. شق الجلد على طول الظهر.
- لتحليل FACS وعزل الخلايا الكيراتينية أو إعداد RNA، تقشر الجلد الكامل من الجذع باستخدام ملقط لإصلاح الأنسجة ومقص طرف حادة لدفع قبالة الجذع. لإعداد cryosections أو يتصاعد كلها تأخذ قطعة فقط من الجلد مرة أخرى.
- ختم الجلد مرة أخرى مع مشرط إلى 1-2 قطع من حوالي 10 × 10 مم. وضع القطع في بئر واحدة من لوحة 6 جيدا مع ~ 1 مل PBS العقيمة. تأكد من أن الجانب الجلد يواجه القاع.
- استبدال PBS بنسبة 1.5 مل dispase الثاني (5 ملغ / مل PBS) واحتضان لمدة 30 دقيقة إما في 37 ° C (ليتصاعد كلها) أو O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. بلطف إزالة البشرة كما ورقة سليمة باستخدام ملقط واحد لإصلاح الأدمة الكامنة وملقط أخرى لرفع البشرة. استخدام مجهر لجعل هذه الخطوة EASذ. نقل ورقة البشرة في DMEM مع الجانب القاعدي نحو القاع. استخدام الأوراق على الفور لإجراء التجارب العدوى.
ملاحظة: استخدم إعداد البشرة من الجلد حديثي الولادة أساسا لتحليل FACS وعزل الخلايا الكيراتينية أو إعداد RNA. بسبب هشاشته، وإعداد الأوراق المصابة لcryosections أو يتصاعد كله هو أقل ملاءمة.
- إعداد البشرة من الجلد الذيل الكبار للدراسات العدوى
- الموت ببطء الفئران في سن 1-3 أشهر من قبل خلع عنق الرحم. اتخاذ الذيل بدلا من الجلد مرة أخرى منذ فترة طويلة جزءا لا يتجزأ من بصيلات الشعر على ظهر تعيق فصل صفائح البشرة سليمة. قطع الذيل من الفئران ضحوا وشق عليه بالطول مع مشرط.
- تقشر الجلد من العظام وختم عليها مع مشرط إلى قطع حوالي 5 × 5 مم. وضع ما يصل إلى 4 قطع في بئر واحدة والمضي قدما في الحضانة في dispase الثاني كما هو موضح تحت 2.1.5
ملاحظة: استخدام تاي الكبارل الجلد لإعداد cryosections أو يتصاعد كلها. بدلا من ذلك إلى استخدام الفوري، والذيول ويمكن تخزين أو نقل ما يقرب من 24 ساعة في 4 درجات مئوية دون أن تفقد كفاءة عدوى كبيرة. إذا كان يتم الاحتفاظ ذيول ما يصل إلى 48 ساعة، وصحائف البشرة يمكن بالكاد المصابين HSV-1.
- تفكك البشرة لتحليل FACS
ملاحظة: الكشف عن سطح بروتين تعبير عن طريق التحليل FACS تتطلب تقنيات تفارق الخلية المناسبة التي لا تضر سطح الخلية وبروتين من الفائدة.- احتضان أوراق البشرة الأطفال حديثي الولادة في لوحة 6 جيدا مع الجانب القاعدي على 1.5 مل / المؤتلف كذلك حل تفكك خلية القائم على التربسين لمدة 15 دقيقة في RT ولمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- وقف حضانة بإضافة 3 مل DMEM. فصل الخلايا القرنية باستخدام ملقط غرامة منحني للتحرك بلطف البشرة في لوحة 6 جيدا بحيث تحصل على حل الكيراتينية. جمع تعليق خلية وكرر هذه الخطوة 3 مراتدائما استخدام DMEM جديدة.
ملاحظة: هذا الإجراء التفكك هو المناسب للكشف عن nectin-1 على سطح القرنية. - بدلا من ذلك، واحتضان الأوراق البشرة على حل تفكك خلية خالية من إنزيم (CDS) لمدة 15 دقيقة في RT و 15 دقيقة عند 37 ° C. احتضان 15 دقيقة أخرى في RT لطرد بلطف خارج الخلايا الكيراتينية قبل pipetting CDS صعودا وهبوطا.
- جمع تعليق خلية وكرر الخطوة التنظيف 3 مرات باستخدام DMEM جديدة.
ملاحظة: هذا التفكك هو مناسبة للكشف عن التعبير سطح HVEM. العيب من الحل CDS هو أن أقل من الخلايا يتم فصلها من المؤتلف مع الحل تفارق الخلية على أساس التربسين. بالإضافة إلى السطح التعبير، وحرية التعبير النووي أو حشوية مثل ICP0 التعبير يمكن تحليلها من قبل FACS بعد تفكك الأوراق البشرة المصابة مع المؤتلف حل تفكك خلية القائم على التربسين.
- تفكك البشرة لعزل الخلايا الكيراتينية أو السابقينالمسالك RNA
- وضع ورقة البشرة الأطفال حديثي الولادة في لوحة 6 جيدا مع الجانب القاعدي نحو قاع الطبق الذي يحتوي على 1.5 مل / المؤتلف كذلك حل تفكك خلية القائم على التربسين. احتضان لمدة 30 دقيقة في RT. إضافة 3 مل DMEM وفصل الخلايا القرنية باستخدام ملقط غرامة منحني للتحرك بلطف البشرة في الطبق.
- جمع تعليق خلية وكرر هذه الخطوة 3 مرات باستخدام DMEM جديدة. استخدام هذا التعليق الخلية لاستخراج الحمض النووي الريبي أو الثقافة الابتدائية الخلايا الكيراتينية الفئران.
3. العدوى من صفائح البشرة مع HSV-1
- يعد حل HSV-1 وزن السلالة 17 11 في ما لا يقل عن 500 ميكرولتر DMEM واستبدالها المتوسطة من حل الفيروس الذي الأوراق البشرة تطفو. وتعرف هذه النقطة الوقت كوقت 0 12. نفذ إصابة ورقة البشرة في بئر واحدة من 24 لوحة جيدا عند 37 درجة مئوية. ويستند حساب عيار الفيروس على العدد التقديريمن الخلايا في الطبقة القاعدية لكل ورقة البشرة (حوالي 2 × 10 5 خلايا لكل ورقة 5 × 5 مم).
- تصيب مع HSV-1 في حوالي 100 وحدة لوحة تشكيل (PFU) / الخلية واستبدال المتوسطة التي تحتوي على الفيروس عن طريق DMEM في 1 ساعة بي
ملاحظة: في حالة ورقة البشرة من الجلد حديثي الولادة، ونأخذ في الاعتبار أن ورقة تبدأ في فصل أثناء الحضانة.
4. التصور من الخلايا المصابة
- يتصاعد البشرة الجامع 13
- إصلاح ورقة البشرة مع 3.4٪ الفورمالديهايد إما لمدة 2 ساعة على RT أو O / N عند 4 درجات مئوية. يغسل مرتين مع برنامج تلفزيوني ومنع مع 0.5٪ مسحوق الحليب، 0.25٪ الجيلاتين من جلد أسماك المياه الباردة و 0.5٪ تريتون X-100 في TBS لمدة 1 ساعة على RT 14.
- احتضان الأوراق O / N مع الماوس مكافحة ICP0 (الأجسام المضادة أحادية المنشأ 11060) 15 المخفف 1:60 في عرقلة العازلة في RT. لتصور شبكة خيوط المتوسطة احتضان في وقت واحد مع الأرنب بولكلونل مكافحةالماوس الكيراتين 14 (100 نانوغرام / مل).
- يغسل 4-5 مرات مع PBS 0.2٪ توين 20 خلال 4 ساعة على RT. احتضان O / N مع AF488 مترافق مكافحة الفأر مفتش (1 ميكروغرام / مل)،-AF555 مترافق مفتش المضادة للأرنب (1 ميكروغرام / مل)، ودابي (4، 6-diamidino-2-phenylindole) (100 نانوغرام / مل) في عرقلة العازلة في RT.
- يغسل مع PBS 0.2٪ توين 20 لمدة 4 ساعة على RT. ورقة البشرة جبل مع الجانب القاعدي على أعلى شريحة العينة، تغرس في الفلورسنت المتوسطة المتزايدة وتغطي مع coverslips.
- البشرة Cryosections
- كانت ثابتة ورقة البشرة الكبار في 4٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة في RT وغسلها 2 مرات مع برنامج تلفزيوني. تضمين ورقة ثابتة في الأنسجة تجميد المتوسطة وتجميد في النيتروجين السائل. قطع 8-10 ميكرون المقاطع مع cryomicrotome.
- إصلاح الأجزاء مرة أخرى مع 0.5٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT، وغسل 2 مرات مع برنامج تلفزيوني، كتلة مع 5٪ مصل الماعز العادي و 0.2٪ توين 20 في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT، ثم وصمة عار لمدة 60 دقيقة مع م[أوس] مكافحة ICP0 (الأجسام المضادة أحادية المنشأ 11060) 15 المخفف 1:60 في عرقلة العازلة، تليها 3 مرات غسل مع العازلة حظر.
- ثم احتضان مع AF488 مترافق مكافحة الفأر مفتش (1 ميكروغرام / مل) ودابي (100 نانوغرام / مل) في عرقلة العازلة لمدة 45 دقيقة في RT ويغسل 3 مرات. تضمين المقاطع في الفلورسنت المتوسطة المتزايدة، وتغطي مع coverslips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
التحدي المتمثل في طريقة لإعداد ورقة البشرة في الذي HSV-1 يمكن ان تخترق من الطبقة القاعدية. الخطوة الحاسمة هي انفصال البشرة عن الأدمة من قبل dispase II العلاج، والتي، اعتمادا على سلالة الماوس، يجب تكييفها. تركيز dispase الثاني يمكن أن تتراوح 2،5-5 ملغ / مل، والوقت من الحضانة 20-45 دقيقة. تلطيخ من خيوط المتوسط بروتين الكيراتين 14 يسمح بسهولة التنبؤ ما إذا كانت طبقة البشرة القاعدية يمكن أن يصاب أو ما إذا كان سوف تظهر سوى عدد محدود جدا من الخلايا المصابة (الشكل 2). من الناحية المثالية، ينبغي أن تلطيخ الكيراتين 14 من البشرة يتصاعد كلها تشير إلى وجود طبقة الخلايا القاعدية سليمة (الشكل 2A). في أسوأ الحالات، عطلت dispase II معالجة الطبقة القاعدية وليس هناك أي خلايا الملون في البشرة البيني مشيرا الى ان الكيراتين 14، معربا عن الخلايا الكيراتينية القاعدية يتم فصلها (الشكل 2B 16 (الشكل 2B) . فقط بعد التخفيض من dispase الثاني إلى 2.5 ملغ / مل لمدة 30 دقيقة، وحصل على الطبقة القاعدية سليمة كما تصور من قبل الكيراتين 14 تلطيخ (الشكل 2C).
بسبب بصيلات الشعر الكثيفة كما الزوائد من البشرة، والفصل بين البشرة من الأدمة هي الأكثر ملاءمة عندما يؤخذ الجلد من ذيول الفئران الكبار. بدلا من ذلك، والجلد الخلفي من الفئران حديثي الولادة مع وضع بصيلات الشعر يمكن استخدامها، على الرغم من أن هشاشة ورقة بعد الحضانة يحد من حجم مناطق للتحليل. حتى الآن، وقد لاحظت أي فرق في كفاءة العدوى HSV-1 اعتمادا على ما إذا تم أخذ البشرة من الفئران حديثي الولادة أو الكبار (الشكل 3). يتصاعد كاملة من newboالبشرة آكانيوز تصور العدوى الفعال للبشرة البيني وكذلك الخلايا المكتظ بطانة بصيلات الشعر النامي (الشكل 3). في حين أن البشرة البيني للبشرة البالغين المصابين بكفاءة، يصاب الجراثيم الشعر واجزاء فقط من الأغماد الجذر الخارجي من بصيلات الشعر (الشكل 3). هي ملطخة الغدد الدهنية تحت جذع الشعرة دائما، والتي هي، ولكن نظرا لتلطيخ غير محدد من الأجسام المضادة الثانوية كما هو مبين في الضوابط غير المصابة (الشكل 3).
باستخدام دراسات المانع نحن التحقيق، سواء الكولسترول يلعب دورا لHSV-1 دخول البشرة. تم سابقة التجهيز ورقة البشرة من فئران بالغة مع الميثيل-β-سيكلودكسترين (MβCD)، الذي يستنزف الكولسترول من الغشاء البلازمي 17-19. قبل الإصابة، وإزالة MβCD من خلال عدة خطوات الغسيل لتجنب أي تأثير المستنفدة على الكوليسترول في envel الفيروسيمكتب مستشار رئيس الوزراء. على ما قبل المعالجة مع 20 ملي MβCD تقريبا شوهدت الخلايا المصابة أي إما في البشرة البيني أو الجراثيم الشعر، ولكن لم يكن سوى تلطيخ غير محدد من الغدد الدهنية مرئية (الشكل 4A). كعنصر تحكم أن الأنسجة لم تتضرر من جراء العلاج المانع، واضاف نحن 500 ميكروغرام / مل الكولسترول لتجديد البشرة ورقة MβCD المعاملة (الشكل 4A). هذا العلاج تجديده بالكامل العدوى مما يدل على أن المعالجة مع المانع لم تتدخل مع بقاء الأنسجة.
باستخدام نماذج الماوس خاطبنا مشاركة nectin-1 وسيط دخول هربس (HVEM) كما المستقبلات الخلوية للHSV-1 في البشرة 10. ومن المعروف أن كلا من البروتينات للعمل مستقبلات فعالة بالنسبة للHSV في مختلف خطوط الخلايا 20،21، وكانت كافية لتطور المرض في الفئران (22). نحن مصممون الأدوار البشرة محددة من nectin-1 وHVEM كما HSV-1 مستقبلات 10. بعد العائمة ورقة البشرة من wildtype، nectin-1- أو HVEM التي تعاني من نقص في الفئران المتوسطة التي تحتوي على الفيروس، أعدت يتصاعد كلها في 3 ساعة بي لتصور عدد من الخلايا المصابة. المقارنة بين epidermises البيني تشير إلى أن 1 nectin نقص فقط خفضت بشكل كبير من عدد من الخلايا، معربا عن ICP0 (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك، كان انتشار الفيروس محدود نوعا ما في ظل غياب nectin-1 كما هو موضح في cryosections في 18 ساعة بي (الشكل 4C). لتقدير حجم الخلايا المصابة، فمن المهم رصد ما إذا كان عدد الخلايا المصابة وتوزع بالتساوي في جميع أنحاء البشرة البيني أو ما إذا لوحظت مجموعات من الخلايا المصابة. في البشرة-nectin 1-نقص على سبيل المثال، وكفاءة الإصابة بعدوى تنوعت٪ ما يقرب من 10 في بعض المناطق، وحوالي 30٪ في مناطق أخرى من البشرة البيني 10. وهكذا، قررنا رس لا تعطي أعداد الخلايا المصابة لإثبات انخفاض الإصابة، ولكن يتصاعد كلها موجودة كما البيانات النوعية.
الشكل 1: التصور من الخلايا المصابة في أقسام البشرة أو يتصاعد كلها الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
في الجزء العلوي هو مخطط يوضح كاملة عينات الجلد الكبار، مقاطع البشرة بعد الانفصال من الأدمة، والبشرة يتصاعد كاملة مع السطح المرئي من طبقة الخلايا الكيراتينية القاعدية. يشير السهم إلى بصيلات الشعر والنجم يشير إلى البشرة البيني. أصيب عينات الجلد والبشرة ورقة أعدت من 3 أسابيع الفئران القديمة مع HSV-1 في حوالي 100 PFU / خلية وثابتة عند 1.5 أو 3 ساعة بي عينات كانت staineد مع مكافحة ICP0 (الخضراء) بعد وهمية العدوى أو على 1.5 أو 3 ساعة بي لتصور الخلايا المصابة، وcounterstaining من نوى مع دابي (الأزرق) يوضح كل الخلايا في طبقات مختلفة. كعنصر تحكم، يتم عرض عينات وهمية المصابة الجلد كاملة بالمقارنة مع عينات المصابين في 3 ساعات مما يدل بي أي تلطيخ ICP0 (الجزء الأيسر). يتم عرض ورقة البشرة وهمية المصابة أو المصابين كما أعدت cryosections في الجزء الأوسط. وتظهر البشرة يتصاعد كلها المصابين لمدة 1.5 أو 3 ساعة على الجزء الأيمن. بار، 25 ميكرون (cryosections)، و 40 ميكرون (يتصاعد بأكملها).
تم فصل الكيراتين 14 تلطيخ البشرة يتصاعد كلها بعد الحضانة مع تركيزات مختلفة من dispase الثاني البشرة من C57BL / 6 أو B6.A2G-MX1 الفئران من الأدمة مع dispase الثاني: الرقم 2. كانت ملطخة البشرة يتصاعد كاملة مع مكافحة keratiن 14 (الحمراء)، ومع دابي (الأزرق). وحضنت ورقة البشرة مع 5 ملغ / مل (A، B) أو 2.5 ملغ / مل (C) dispase الثاني لمدة 30 دقيقة عند 37 ° C. بار، 25 ميكرون. الاختصارات: بصيلات الشعر (HF)، البشرة البيني (IFE)، الغدة الدهنية (SG) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: التصور التعبير ICP0 في يتصاعد كاملة من البشرة حديثي الولادة أو الكبار مخططات توضح البشرة يتصاعد كاملة مع بصيلات الشعر أو وضع بصيلات الشعر، مما يدل على السطح المرئي من الطبقة القاعدية من epidermises الكبار والأطفال حديثي الولادة، على التوالي. أصيب أوراق البشرة مع HSV-1 في حوالي 100 PFU / خلية، وكانت ملطخة يتصاعد كاملة معمكافحة ICP0 (الخضراء) ومع دابي (الأزرق) في 3 ساعات بي كعنصر تحكم، كانت ملطخة غير المصابة البشرة يتصاعد كلها من الجلد الذيل الكبار فقط مع الأجسام المضادة الثانوية يتظاهرون تلطيخ غير محدد من الغدد الدهنية. بار، 25 ميكرون. الاختصارات: وضع بصيلات الشعر (حمى الضنك النزفية)، بصيلات الشعر (HF)، البشرة البيني (IFE)، الغدة الدهنية (SG). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 4: تقييم تأثير العوامل الخلوية باستخدام إما MβCD المانع أو nectin-1- أو epidermises HVEM التي تعاني من نقص (A) وكانت سابقة التجهيز ورقة البشرة من الجلد الذيل الكبار من 3 أسابيع الفئران WT القديمة (C57BL / 6) مع MβCD (20 ملم) والمصابين HSV-1 في يقاربالمطاف 100 PFU / خلية. كعنصر تحكم، أصيب أوراق البشرة غير المعالجة، ويعاملون أوراق البشرة سابقة التجهيز مع 35 ملي MβCD مع 500 ميكروغرام / مل الكولسترول مسبق للإصابة. كانت ملطخة البشرة يتصاعد كاملة مع مكافحة ICP0 (الخضراء) ومع دابي (الأزرق) في 3 ساعات بي للتدليل على عدد من الخلايا المصابة بعد استنفاد الكوليسترول عن طريق العلاج MβCD. كما هو مبين في الشكل (3)، وتلطيخ الغدد الدهنية (SG) هو غير محددة. الاختصارات: HF (بصيلات الشعر)، IFE (البشرة البيني)، SG (الغدد الدهنية). بار، 150 ميكرون. (B) epidermises ذيل الكبار من وزن (C57BL / 6)، nectin-1- 23، أو HVEM-ناقص الفئران 24 (1 منذ شهر) أصيب في حوالي 100 PFU / خلية. كانت ملطخة البشرة يتصاعد كاملة مع مكافحة ICP0 (الخضراء) ومع دابي (الأزرق) في 3 ساعات بي (C) Cryosections من أوراق البشرة من وزن (C57BL / 6) أو nectin 1-ناقص كانت ملطخة الفئران 23 في 18 ساعة بي الدقةيتم تعديل ults هو مبين في (B) و (C) من مرجع 10. في A، B و C توقعات مبائر ودمج وتظهر الصور. بار، 150 ميكرون (A)، و 25 ميكرومتر (B، C). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
عندما تصاب أوراق البشرة من الجلد للبالغين من C57BL / 6 مع HSV-1 في حوالي 100 PFU / خلية، نلاحظ العدوى في كل ما يقرب من خلايا الطبقة القاعدية في البشرة البيني في حين ترتبط أقل جرعة الفيروس بخلايا أقل المصابة وأبطأ التقدم للعدوى. بشكل عام، تظهر بصيلات الشعر على عدد متغير من الخلايا المصابة. بينما يصاب معظم الخلايا الكيراتينية صغيرة بدلا بطانة بصيلات الشعر النامية، مصاب فقط جرثومة الشعر من بصيلات الشعر الكبار تماما. اعتمادا على كيفية لطيف انفصال البشرة عن طريق عائدات العلاج dispase الثاني، وأجزاء من بصيلات الشعر تضيع. في معظم الحالات، وطبقات الخلايا الكيراتينية بين الغدد الدهنية والبشرة البيني مفقودة وطبقة بطانة الأغماد الجذر الخارجي قد تعطلت. في أي حال، يمكن للإجراءات التي تفصل بين البشرة من الأدمة والكفاءة العدوى تختلف من سلالة الماوس إلى آخر ( أخذت معا، فإن التحدي من خارج الحي العدوى الاختبار هو على إعداد وصيانة للأوراق البشرة. هشاشة النسيج يتطلب معالجة دقيقة للغاية وتسيطر جيدا كيف يتم الحفاظ على الأنسجة بعد الانفصال عن الأدمة. وثمة مسألة أخرى هي جدوى محدودة من الأوراق في الثقافة. منذ بقاء الخلية النقصان مع مرور الوقت، ينبغي إجراء التجارب الإصابة على الفور أو على الأقل 3 ساعة بعد إعداد ورقة. بالإضافة إلى الجلد الفئران، وصحائف البشرة يمكن أن تكون مستعدة أيضا من الجلد أو الغشاء المخاطي العينات البشرية. تبعا لطبيعة وسمك البشرة، وعلاج dispase أن تتكيف. لمتابعة سير العدوى، فمن الأنسب لتصور الخلايا المصابة في cryosections. على المرء أن نضع في اعتبارنا أن مع ارتفاع PFU / خلية ومرات أطول من العدوى، ورقة البشرة تبدأ نوعا من disintegraنشوئها. استنادا إلى تأثير الاستسلامي، وخلايا تعتقل والحصول على عطلت الاتصالات خلية خلية. قبل 24 ساعة بي مع 100 PFU / خلية، بعض الخلايا القاعدية المصابة يمكن أن تضيع، والتي قد تعتمد أيضا على علاج dispase الثاني. مع انخفاض PFU / الخلية، ويمكن تمديد مرات الإصابة دون أن يؤدي ذلك إلى تلف الأنسجة الشديد. بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم مدى الضرر كعلامة لكيفية سلالات الفيروس المسببة للأمراض المختلفة هي. نحن نفضل أن تصور الخلايا المصابة عن طريق تلطيخ ICP0 التعبير. ميزة هي الاكتشاف المبكر جدا من الخلايا المصابة، واستنادا إلى نمط ICP0 تلطيخ الخلايا في مرحلة مبكرة خلال العدوى يمكن تمييزها عن تلك التي في مرحلة متقدمة. بدلا من ذلك، الخلايا المصابة يمكن تصور من قبل تلطيخ التعبير عن الجينات الأخرى في وقت مبكر مثل الفيروسي VP5 البروتين قفيصة والفيروسية البروتين المغلف GD. حاولنا أيضا إلى تصور جزيئات الفيروس واردة قبل الفيروسي التعبير الجيني إما عن طريق الوقود النووي المشعection مع الموسومة GFP HSV-1 أو عن طريق تلطيخ capsids في عينات ثابتة. وفقا لتجربتنا، ونمط GFP مضان أو نمط تلطيخ في أقسام الأنسجة معقدة جدا لتبين بوضوح وجود جزيئات الفيروس المنضوية. بدلا من ذلك، جزيئات الفيروس يمكن تصور بواسطة المجهر الإلكتروني، عند التتر الفيروس عالية من ~ 1000 - تستخدم 1500 PFU / خلية. في حالة جرعة الفيروس أقل، جزيئات الفيروس يمكن بالكاد الكشف عنها. بدلا من تصور الخلايا المصابة في ورقة البشرة سليمة، والبشرة يمكن فصلها لتحليل مستويات RNA أو تحديد عدد الخلايا التي تحتوي على السطح، والتعبير حشوية أو النووي للجينات من الاهتمام من خلال تحليل FACS. ونحن نفترض أن هذا خارج الجسم الحي بروتوكول العدوى يمكن تكييفها على الأقل لتلك الفيروسات التي يعرف أنها تصيب الخلايا الكيراتينية القاعدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر بيتر Staeheli لتوفير الفئران B6.A2G-MX1 وسيمرا أوتشيليك للحصول على المشورة الفنية.
وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة الأبحاث الألمانية من خلال SFB829 وKN536 / 16، وكولن فورتشن برنامج / كلية الطب، جامعة كولونيا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J.
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
