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Immunology and Infection

鼠表皮体感染单纯疱疹病毒1型

doi: 10.3791/53046 Published: August 24, 2015

Abstract

进入其人类宿主,单纯疱疹病毒1型(HSV-1),必须克服的粘膜表面,皮肤或角膜的屏障。初始进入期间HSV-1的目标的角质,并建立在该上皮,之后是神经元的潜伏感染的主要感染。激活后,病毒可出现皮肤水泡或粘膜溃疡粘膜部位变得明显。如何HSV-1侵入皮肤或黏膜和达到其受体知之甚少。调查入侵路线的HSV-1的成表皮组织在细胞水平上,我们建立鼠表皮的体感染模型,它代表的原发性和复发性感染中的皮肤的部位。该测定法包括鼠皮肤的制备。表皮从真皮层经分散酶II处理分离。浮动的表皮片含病毒的培养基上后,将组织是固定的,感染后可在不同的时间感染后由可视化用针对HSV-1的立即早期蛋白ICP0的抗体染色感染细胞。 ICP0表达细胞,可以在基底角质形成细胞层在1.5小时感染后观察到了。较长感染次,感染的细胞在基底层层检测,表明感染并不限定于基底角质形成细胞,但病毒扩散到其他的层中的组织。使用各种小鼠模型的表皮片,感染协议允许确定向HSV-1侵入到组织的细胞成分的参与。另外,该测定是合适的,以测试在组织抑制剂,与初始条目的步骤干扰,细胞至细胞的传播和病毒生产。在这里,我们详细描述的体外感染协议和使用的Nectin-1-或HVEM缺陷型小鼠呈现我们的结果。

Introduction

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单纯疱疹病毒(HSV)可引起一系列疾病从轻度无并发症的皮肤粘膜损伤到危及生命的感染人类。单纯疱疹病毒1型(HSV-1)是显性与口面部感染和脑炎相关,而HSV 2型(HSV-2)更可能导致生殖器感染1。虽然在了解HSV是如何进入细胞的培养,引发感染并产生病毒的后代显著的进步,我们知道一点关于病毒的入侵途径(S)进入组织细胞水平2。单纯疱疹病毒的皮肤或粘膜感染,小鼠的研究,兔和豚鼠已用作动物模型。皮肤感染成立通过皮内注射或通过刮擦中病毒的存在的皮肤,和疾病发展率与病毒的产生。这些方法有助于理解疾病的发病机制的各个方面,并用于评估抗病毒药。研究HSV感染的Tissu酒店E级,人体器官皮肤模型已经应用。作为感染的速率被限制在这些筏培养,研究调查感染,病毒传播和抗病毒成分的影响仅有限数量的已出版3-6。

为了表征细胞的决定因素,在HSV-1感染的完整上皮细胞发挥 ​​作用,我们建立了一个协议,用于小鼠表皮7的体外感染的研究。皮肤从新生儿或从成年小鼠的尾部制备。由于HSV-1能不感染完整的皮肤样本,它被淹没在含病毒的培养基中,我们通过分散酶II处理分离的真皮表皮。含病毒介质上浮动的表皮片材后,感染的细胞可以在不同的时间感染后(PI)的7被可视化的表皮基底层。现有可视感染个体细胞的启动病毒复制一第二病毒产生,我们用针对所述感染的细胞蛋白质0(ICP0),这是在HSV-1感染所表示的第一蛋白之一的抗体。 ICP0的细胞定位在早期感染穿过不同的阶段。而ICP0存在于核灶期间病毒基因表达的早期阶段,ICP0至细胞质的重新定位指示随后感染8的相位。

我们使用表皮片的体外感染测定从不同小鼠模型感染期间测试各种细胞因子的潜在作用。为了解决Rac1的作为肌动蛋白动力学的关键调节的影响,我们感染小鼠的表皮具有 ​​角化细胞特异性缺失RAC1基因9。此模型使我们能够研究对HSV-1感染在表皮角化层中的效率缺陷的Rac1的后果。以对照同窝感染表皮重新比较vealed无显著差异,这表明不存在的Rac1的有感染在表皮7的基底层开始没有影响。使用进一步小鼠模型使我们能够解决该细胞受体介导进入表皮。从任一的Nectin-1-或HVEM缺陷小鼠用HSV-1感染表皮片显露最初的病毒进入组织强烈依赖的Nectin-1 10的存在。此外,我们的结果表明,HVEM也可以有效地少充当受体在鼠表皮,虽然比的Nectin-1 10。

为了解决感染的细胞中的表皮层的空间分布,我们想象在组织切片和表皮全样载图1)ICP0表达。在完整皮肤的冷冻切片,没有ICP0表达细胞中检测到( 图1)。与此相反,表皮片的冷冻切片表明细胞质ICP0表达在基底层已经3小时圆周率( 图1)。在稍后时间,病毒扩散到基底层可以可视化。感染细胞在基底层的空间分布可以很容易地跟随在表皮全样载( 图1)。在感染了HSV-1在100 PFU /细胞,在滤泡表皮的基底角质形成细胞的大约50%显示在1.5小时丕ICP0表达在这个时间点最感染的细胞表达核ICP0。 ICP0的再定位至细胞质指示早期基因表达的稍后阶段存在于几乎所有细胞在3小时圆周率( 图1)。体外 HSV-1感染的可视化感染细胞的这些模式提供了有力的实验来研究对病毒的进入和扩散在组织中删除/突变的细胞成分的抑制剂或效果。

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Protocol

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伦理声明。

表皮片从处死的动物的制备是严格按照Landesamt献给NATUR,UMWELT和Verbraucherschutz,北莱茵 - 威斯特法伦(德国)的指南的建议。该研究是通过LANUV NRW(编号8.84-02.05.20.13.018)。

1.准备仪器仪表及文化传媒

  1. 培养表皮片在Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)/高葡萄糖含谷氨酰胺二肽,10%FCS,100IU / ml青霉素,和100μg/ ml链霉素(以下简称“DMEM”)。
  2. 对表皮片的制备中,仔细地溶解分散酶II粉末(5毫克/毫升)中加热的PBS(高达37℃)。过滤通过0.22微米的过滤器将溶液直接将其用于治疗。
  3. 对于表皮整体编制机构 13,准备拦截的buff尔用0.5%奶粉,从冷水鱼皮和0.5%的Triton X-100的TBS 0.25%明胶。允许物质通过至少2小时温育该混合物在RT下在旋转混合器溶解。还在PBS制备0.2%吐温20洗涤缓冲液。为固定,制备3.4%和在PBS中的4%甲醛。
  4. 用于冷冻切片的免疫染色,制备封闭缓冲液,用5%正常山羊血清和0.2%吐温20在PBS中。对于固定,准备0.5%甲醛的PBS。

从鼠皮2制备表皮片的

  1. 从新生儿背部皮肤感染的研究表皮的制备
    1. 放置一个断头小鼠(出生后1至3天)成夹层菜和切断四肢和尾靠近躯干,以允许从完全躯干有效地除去皮肤的。在去除四肢,尽量保持切口尽可能小的直径。
    2. 修正了曲细镊子一躯干ND轻轻移动钝头剪刀皮肤下面从颅沿后尾鳍到皮肤从躯干分离。狭缝沿背部皮肤。
    3. 对于FACS分析,角质形成细胞或准备RNA的分离,用钳子固定的组织和钝头剪刀推下躯干的躯干剥离完整的皮肤。对于冰冻切片或整个坐骑的准备只拿个背部皮肤。
    4. 印章的背部皮肤,用手术刀为1-2枚约10×10毫米。把碎片在一个6孔板以〜1毫升无菌PBS中的一个孔中。确保真皮侧面的底部。
    5. 更换PBS 1.5毫升分散酶II(5毫克/毫升的PBS)和孵育在37℃或者30分钟(对于整个坐骑)或O / N在4℃。用PBS洗3次。轻轻地取出表皮为使用一个镊子来解决下面的真皮和其他钳解除表皮完整片。用双眼做这一步EAS年。转移表皮片成DMEM符合其对底部的基底的一面。立即感染实验使用的床单。
      注:使用从新生儿皮肤的表皮准备主要为FACS分析,角质形成细胞或准备RNA的隔离。由于其脆弱性,编制感染薄板的冰冻切片或整个坐骑不太适合。
  2. 成人尾部皮肤感染研究表皮的制备
    1. 安乐死的小鼠在1至3个月的颈椎脱臼的年龄。取尾巴,而不是背部皮肤,因为在背面的长嵌入毛囊阻碍完好表皮片的分离。切断从处死小鼠的尾部,用手术刀切开纵向它。
    2. 剥去骨头的皮肤,用手术刀把它切成约5×5mm的碎片。竖起来4件于一体的,并在2.1.5所述继续进行孵化分散酶II
      注:使用成人泰l湿准备冰冻切片或整个坐骑。可替代地,以立即使用,尾部可以存储或在4℃下输送大约24小时,而不会失去显著感染效率。如果尾巴跟上至48小时,表皮片可以几乎不感染HSV-1。
  3. 表皮用于FACS分析的解离
    注:检测通过FACS分析表面蛋白质的表达需要适当的细胞解离技术不损害细胞表面和所关心的蛋白。
    1. 孵育1.5毫升/孔的重组胰蛋白酶的基于细胞解离15分钟,室温溶液和15分钟,在37℃的新生表皮片在一个6孔板与基底侧。
    2. 通过加入3ml DMEM停止孵育。通过使用弯曲的细镊子轻轻移动表皮在6孔板使得角质得到溶解解离的角质形成细胞。收集细胞悬液,重复此步骤3次总是用新鲜的DMEM。
      注:此分离程序是合适的检测的Nectin-1角质形成细胞的表面上。
    3. 可替代地,孵育上无酶细胞解离溶液的表皮片(CDS)15分钟,在室温和15分钟,在37℃。孵育另外15分钟,在RT下轻轻冲洗掉角质吹打CDS上下。
    4. 收集细胞悬浮液,并使用新鲜的DMEM重复冲洗步骤3次。
      注:此分解适用于检测HVEM的表面表达。在CDS溶液的缺点是,更少的细胞解离比用重组胰蛋白酶的基于细胞解离溶液。除了感染表皮片用重组胰蛋白酶的基于细胞解离溶液的离解后表面表达,核或细胞质表达如ICP0表达可以通过FACS进行分析。
  4. 表皮解离隔离角质形成细胞或前道RNA
    1. 放新生儿表皮片在一个6孔板与朝其含有1.5毫升/孔的重组胰蛋白酶的基于细胞解离溶液的培养皿底部的基底侧。孵育在室温30分钟。添加3 ml的DMEM中,并通过使用弯曲的细镊子轻轻移动的菜表皮角化细胞解离。
    2. 收集细胞悬浮液,并使用新鲜的DMEM重复此步骤3次。使用该细胞悬浮液中提取RNA或文化原代鼠角质形成细胞。

3.感染表皮片与HSV-1

  1. 制备的HSV-1重量17株11的溶液在不大于500微升DMEM中以下,由病毒溶液在其上表皮片是浮更换介质。这个时间点被定义为时间0 12。在一个24孔板的一个孔,在37℃下进行表皮片的感染。病毒滴度的计算是基于所估计的数细胞在每表皮片的基底层的(大约每5×5毫米片2×10 5个细胞)。
  2. 感染了HSV-1在约100噬斑形成单位(PFU)/细胞并更换含病毒介质由DMEM,在1小时圆周率
    注:如果从新生儿皮肤表皮片的,记住,张开始孵化过程中解离。

4.可视化感染的细胞

  1. 表皮整体机构 13
    1. 修复表皮片用3.4%的甲醛无论是2小时在室温或O / N在4℃。洗两次,用PBS和0.5%奶粉,从冷水鱼皮和0.5%的Triton X-100的TBS 1小时在室温14 0.25%明胶阻塞。
    2. 孵育板O / N小鼠抗ICP0(单克隆抗体11060)15稀释1:60在封闭缓冲液在室温下。以可视化的中间纤维网络中同时孵育兔多克隆抗鼠标角蛋白14(100纳克/毫升)。
    3. 期间4小时,在室温洗涤4〜5次,用PBS-0.2%吐温20。孵育O / N与AF488标记的抗小鼠IgG(1微克/毫升),AF555缀合的抗兔IgG(1微克/毫升),和DAPI(4',6-二脒基-2-苯基)(100纳克/毫升)在封闭缓冲液在室温下。
    4. 用PBS-0.2%Tween 20的4小时在室温洗。山表皮片与他们的标本幻灯片顶底侧,嵌入荧光封固剂,盖上盖玻片。
  2. 表皮冷冻切片
    1. 成人表皮片材在室温下固定在PBS中的4%甲醛20分钟,洗涤2次,用PBS。在组织中嵌入固定片冷冻介质和冷冻在液氮中。切8-10微米的部分用冷冻切片机。
    2. 固定再次用在PBS中的0.5%甲醛在室温10分钟的部分中,洗涤2次,用PBS,用30分钟,在室温在PBS 5%正常山羊血清和0.2%吐温20块,然后染色60分钟以米乌斯抗ICP0(单克隆抗体11060)15稀释1:60在封闭缓冲液,随后3次用封闭缓冲液洗涤。
    3. 然后用AF488标记的抗小鼠IgG(1微克/毫升)和DAPI(100毫微克/毫升)培养在封闭缓冲液在室温45分钟,洗3次。荧光封固剂嵌入部分,盖上盖玻片。

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Representative Results

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该方法的挑战是,制备表皮片到其中HSV-1可以从基底层穿透。的关键步骤是从真皮的表皮由分散酶II处理,这取决于该小鼠品系,需要调整的分离。分散酶II的浓度的范围可以从2.5至5毫克/毫升,并孵育20至45分钟的时间。的中间丝蛋白的角蛋白14的染色很容易地允许预测所述基底表皮层是否可以感染或是否会显示出感染的细胞图2)只有非常有限。理想的是,角蛋白14染色的表皮整体坐骑应指示一个完整的层的基底细胞2A)的 。在最坏的情况下,分散酶II处理打乱基底层和没有染色的细胞中的滤泡表皮指示所述角蛋白14表达基底角质形成细胞解离图2B 16(图2B) 。仅减少分散酶II的2.5毫克/毫升30分钟后,得到一个完整的基底层作为可视化由角蛋白14染色图2C)。

因为致密毛囊的表皮附属物,表皮从真皮分离是最方便的,当皮肤取自成年小鼠的尾巴。可替代地,新生小鼠与显影毛囊背部皮肤可以使用,虽然培养后片材的脆性限制了可分析的区域的大小。到目前为止,在HSV-1感染的效率没有差异取决于是否表皮新生或成年小鼠的图3)被发现。 newbo整个坐骑氡表皮形象化滤泡表皮高效感染以及密密麻麻细胞衬里显影毛囊图3)。而成人表皮的滤泡表皮有效地感染,头发病菌和毛囊外根鞘的仅部分被感染图3)。毛干下方皮脂腺总是染色,然而这是,由于第二抗体的非特异性染色如图未感染的对照图3)。

使用抑制剂的研究,我们的调查,无论是胆固醇效力于HSV-1进入表皮的作用。成年小鼠的表皮片进行预处理用甲基-β环糊精(MβCD),该耗尽胆固醇从质膜17-19。在感染前,MβCD除去几个洗涤步骤,以避免在病毒envel对胆固醇任何消耗效果OPE。经前处理用20mMMβCD几乎没有感染的细胞被认为在任一滤泡表皮或头发病菌,但皮脂腺只有非特异性染色可见( 图4A)。作为对照,该组织不是由抑制剂治疗损坏,我们加入500微克/毫升胆固醇补充MβCD处理的表皮片图4A)。这种处理完全恢复感染性表明与抑制剂的预处理不与所述组织的生存力干扰。

使用小鼠模型,我们讨论的Nectin-1与疱疹病毒条目介体(HVEM),为细胞受体的HSV-1在表皮10的参与。这两种蛋白质是众所周知的在各种细胞系20,21充当高效受体HSV,和它们足以在小鼠22疾病的发展。我们确定为HSV-的Nectin-1与HVEM的表皮特定的角色1受体10。浮动表皮片​​从野生型,的Nectin-1-或HVEM缺陷小鼠含病毒的培养基上后,整个支架的制备在3小时丕形象化感染的细胞的数目。的滤泡epidermises的比较表明,只的Nectin-1缺乏显着降低ICP0表达细胞的数量图4B)。此外,病毒的传播是相当有限的情况下的Nectin-1作为在18小时PI显示在冰冻切片 图4C)。对受感染细胞的定量,它来监控是否均匀地分布在整个滤泡表皮或是否簇感染的细胞中观察到感染的细胞的数量是非常重要的。在的Nectin-1缺失表皮,例如,感染效率变化大约10%的感染在一些地区和滤泡间表皮10的其它区域约30%。因此,我们决定牛逼○对感染的细胞的数量没有表现出感染的降低,但本全样载定性数据。

图1
图1:感染的细胞在表皮的部分或全部坐骑的可视化 ,请点击此处查看该图的放大版本。

在顶部是一个方案示出完整的成年皮肤样品,从真皮分离,并与基底角质细胞层的可见表面表皮全样载后表皮部分。箭头指向一个毛囊和星号表示滤泡表皮。从3周龄小鼠制备皮肤样本和表皮片被感染HSV-1在约100 PFU /细胞固定在1.5〜3小时PI将样品staineð用抗ICP0(绿色)后模拟感染或在1.5或3小时圆周率形象化感染细胞,细胞核用DAPI(蓝色)复染演示了所有细胞中的各个层。作为对照,模拟感染的完整皮肤样品示于比较感染的样本在3小时圆周率表明没有ICP0染色(左侧部分)。制备冷冻切片模拟感染或感染的表皮片示于中间部分。感染1.5或3小时的表皮整个坐骑显示在右侧部分。酒吧,25微米(冰冻切片),40微米(全坐骑)。

图2
图2:温育不同浓度的分散酶的第 ​​二表皮的C57BL / 6或B6.A2G-MX1小鼠后角蛋白14染色的表皮整体坐骑从真皮分离用分散酶II。表皮全坐骑沾满抗keratiN 14(红色)和用DAPI(蓝色)。表皮片孵育5毫克/毫升(A,B)或2.5毫克/毫升(C)的分散酶II进行30分钟,在37℃。酒吧,25微米。缩写:毛囊(HF),滤泡上皮(IFE),皮脂腺(SG) 点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3:在新生儿或成人表皮的全样载ICP0表达的可视化方案示出表皮全样载与毛囊或显影毛囊,示出了从成年和新生epidermises基底层的可见表面,分别。表皮片材感染HSV-1在约100 PFU /细胞,和全样载沾满抗ICP0(绿色)和用DAPI(蓝色)在3小时圆周率作为对照,从成年尾部皮肤未受感染的表皮整体坐骑染色仅与第二抗体展示出皮脂腺的非特异性染色。酒吧,25微米。简称:开发毛囊(DHF),毛囊(HF),滤泡上皮(IFE),皮脂腺(SG)。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4:通过使用该抑制剂或MβCD的Nectin-1-或HVEM缺陷epidermises评估的细胞因子的影响(A)中从成年尾部皮肤3周龄野生型小鼠(C57BL / 6)的表皮片材预处理MβCD (20毫米)和感染HSV-1在approxi三方共同100 PFU /细胞。作为对照,未处理的表皮片受到感染,和预处理35毫MβCD表皮片用500微克/毫升胆固醇在感染前进行处理。表皮整体坐骑染色用抗ICP0(绿色)和用DAPI(蓝色)在3小时圆周率证明感染的细胞的数量的胆甾醇通过MβCD治疗耗尽后。 如图3,皮脂腺(SG)的染色非特异性。简称:HF(毛囊),IFE(滤泡上皮),SG(皮脂腺)。酒吧,150微米。 (B)的成人尾epidermises重量的(C57BL / 6),的Nectin-1- 23,或HVEM缺陷型小鼠24(1月龄)感染在约100 PFU /细胞。表皮整体坐骑染色用抗ICP0(绿色)和用DAPI(蓝色)在3小时圆周率(C)的表皮片材从重量冷冻切片(C57BL / 6)或型Nectin-1缺陷小鼠23进行染色在18小时丕RES(B)和(C)中所示ULTS从参考10.改性以A,B和C的共焦凸起和合并的图像示。酒吧,150微米(A)和25微米(B,C)。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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当从C57BL / 6成人皮肤的表皮片材被感染HSV-1在约100 PFU /细胞,我们观察到感染几乎所有细胞中的基底层中的滤泡表皮而较低的病毒剂量关联与少感染的细胞和较慢的感染的进展。在一般情况下,毛囊显示可变数目的感染的细胞;而大多数的相当小的角化细胞衬显影毛囊感染,成人毛囊仅实施发胚芽被完全感染。取决于如何平缓的表皮由分散酶II处理前进的分离,毛囊的部件会丢失。在大多数情况下,皮脂腺和表皮滤泡之间的角质细胞层丢失和衬外根鞘的层可能会中断。在任何情况下,分离从真皮和感染效率表皮的程序可以从一个小鼠品系的不同而不同(

两者合计, 体外感染测定的挑战是表皮片的制备和维护。所述组织的脆弱性需要非常小心处理,并控制组织是如何以及从真皮分离后保留。另一个问题是在培养片材的有限生存力。因为细胞活力随时间降低,感染实验应立即或至少3小时制备的片材后进行。除了鼠皮肤,表皮片也可以从人的皮肤或粘膜的样品制备。根据不同的性质和表皮的厚度,分散酶处理必须适应。

跟随感染的过程中,它是可视化感染的细胞在冷冻切片最合适。人们必须记住,具有较高的PFU /细胞和感染更长的时间,在表皮片开始某种disintegra的化。基于该病变效应,细胞围捕和细胞 - 细胞接触获得打乱。通过24小时,圆周率与100 PFU /细胞,一些感染基底细胞可能会丢失,这可能也依赖于分散酶II处理。较低的PFU /细胞,感染时间可以延长而不导致严重的组织损伤。可替代地,损害的程度可以用作致病各种病毒株是如何标记。

我们更愿意通过染色ICP0表达形象化感染的细胞。其优点是相当早期检测感染的细胞,和,基于所述ICP0染色模式,细胞在感染期间的早期阶段,可以从那些时已是晚期区分。备选地,感染的细胞可以通过染色的其他早期基因表达被可视诸如病毒衣壳蛋白VP5和病毒包膜蛋白的gD。

我们也尝试以可视化传入病毒颗粒之前,病毒基因的表达或者通过INF挠度与绿色荧光蛋白标记的HSV-1或固定样本染色衣壳。根据我们的经验,GFP荧光的图案或在组织切片的染色模式太复杂,清楚地表明内化的病毒颗粒的存在。使用1500 PFU /细胞 - 可替代地,病毒颗粒可以通过电子显微镜,当〜1000的高病毒滴度可视化。在情况低病毒剂量的,病毒颗粒几乎不能检测到。

代替可视感染的细胞中完整的表皮片材,表皮可以解离来分析RNA水平或定量细胞中通过FACS分析感兴趣的基因的表面,细胞质或核表达的数量。

我们假设这种体外感染协议至少可以适于那些已知感染基底角质形成细胞的病毒。

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Acknowledgments

我们感谢彼得Staeheli提供B6.A2G-MX1小鼠和Semra Ozcelik酒店的技术咨询。

这项工作是由德国研究基金会通过SFB829和KN536 / 16,和科隆财富计划/科隆大学医学院,支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/high glucose/GlutaMAX Life Technologies 31966047 needed for cultivation of epidermal sheets
dispase II powder Roche 4942078001 has to be solved in heated PBS
enzyme-free cell dissociation solution Sigma C5914 needed for very gentle dissociation of epidermal sheets
TrypLE select cell dissociation solution Life Technologies 12563-029 needed for dissociation of epidermal sheets
chelex 100 resin Bio-Rad 142-2832 needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum
gelatin from cold water fish skin  Sigma G7765 needed for minimization of non-specific antibody binding
Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) Covance PRB-155P used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis
Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-11029 used as secondary antibodies
Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) Life Technologies A-21429 used as secondary antibodies
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride)                             (conc.: 0.1 mg/ml) Sigma 36670 used to counterstain the nucleus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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鼠表皮<em>离</em>体感染单纯疱疹病毒1型
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Rahn, E., Thier, K., Petermann, P., Knebel-Mörsdorf, D. Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1. J. Vis. Exp. (102), e53046, doi:10.3791/53046 (2015).More

Rahn, E., Thier, K., Petermann, P., Knebel-Mörsdorf, D. Ex Vivo Infection of Murine Epidermis with Herpes Simplex Virus Type 1. J. Vis. Exp. (102), e53046, doi:10.3791/53046 (2015).

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