Abstract
כדי להיכנס למארח האנושי שלה, סוג נגיף הרפס סימפלקס 1 (HSV-1) חייב להתגבר על המחסום של משטחים, עור, או קרנית רירית. HSV-1 מטרות קרטינוציטים בכניסה ראשונית וקובעות זיהום עיקרי באפיתל, שאחריו זיהום סמוי של תאי עצב. לאחר הפעלה מחדש, וירוסים יכולים להיות ברורים באתרי mucocutaneous המופיעים כשלפוחית עור או כיבים ברירית. איך HSV-1 פולש עור או רירי ומגיע הקולטנים שלו הוא הבין היטב. כדי לחקור את מסלול הפלישה של HSV-1 לרקמת אפידרמיס ברמה התאית, הקמנו מודל vivo לשעבר זיהום של עור בעכברים, המייצג את האתר של זיהום ראשוני וחוזר בעור. Assay כולל הכנת העור בעכברים. האפידרמיס מופרד מהעור על ידי טיפול dispase השני. לאחר צף גיליונות אפידרמיס על מדיום המכיל וירוס, הרקמה היא קבועה וזיהום יכול להיות דמיין בpostinfection זמנים שונים על ידימכתים תאים נגועים בנוגדן נגד חלבון ICP0 HSV-1 מוקדם המיידי. להביע ICP0 תאים ניתן להבחין בשכבת keratinocyte הבסיסית כבר ב1.5 postinfection שעות. עם זמני זיהום יותר, תאים נגועים מתגלים בשכבות suprabasal, מצביעים על כך שהזיהום אינו מוגבל לקרטינוציטים הבסיסיים, אבל הווירוס מתפשט לשכבות אחרות ברקמות. שימוש בגיליונות אפידרמיס של מודלים עכבר שונים, פרוטוקול הזיהום מאפשר קביעת המעורבות של מרכיבים תאיים שתורמים לפלישת HSV-1 לרקמות. בנוסף, assay מתאים לבחון מעכבים ברקמה שמפריעים לצעדי כניסה הראשוניים, התפשטות תא אל התא וייצור וירוס. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול זיהום vivo לשעבר בפירוט ולהציג את התוצאות שלנו באמצעות עכברי nectin-1- או HVEM הלקוי.
Introduction
וירוס הרפס סימפלקס (HSV) עלול לגרום למגוון של מחלות בבני אדם מנגעי mucocutaneous מסובכים קלים לזיהומים מסכני חיים. סוג HSV 1 (HSV-1) קשור דומיננטי עם זיהומים ודלקת המוח orofacial, ואילו HSV מסוג 2 (HSV-2) סביר יותר גורם לזיהומים באברי המין 1. אמנם יש התקדמות משמעותית בהבנה כיצד HSV נכנס תאים בתרבית, יוזם זיהום ומייצר צאצאים נגיפיים, אנחנו יודעים מעט מאוד על מסלול ויראלי הפלישה (ים) לתוך רקמה ברמה התאית 2. ללימודים של עור HSV או זיהומים ברירית, עכברים, ארנבות ושרקנים שימשו כמודלים של בעלי חיים. דלקת עור הוקמה על ידי הזרקה תוך-או על ידי מגרד את העור בנוכחות של וירוס, והתפתחות מחלה הייתה מתואמת עם ייצור וירוס. שיטות אלה עזרו להבין היבטים שונים של היווצרות מחלה, והם משמשים להערכת תרופות אנטי. ללמוד זיהום HSV בtissuרמת ה, מודלים עור אנושיים organotypic יושמו. כשיעור הזיהום מוגבל בתרבויות רפסודה אלה, רק מספר מוגבל של מחקרים חוקרים זיהום, התפשטות נגיפית ואת ההשפעות של רכיבים אנטי פורסמו 3-6.
כדי לאפיין גורמים סלולריים שמשחקים תפקיד בזיהום HSV-1 באפיתל שלם, הקמנו פרוטוקול ללימודי זיהום vivo לשעבר של האפידרמיס עכברי 7. עור הוכן מתינוקות או מהזנבות של עכברים בוגרים. מאז HSV-1 לא יכל להדביק דגימות עור מלאים, שהיו שקועים במדיום המכיל וירוס, נפרדנו מהאפידרמיס הדרמיס על ידי הטיפול השני dispase. לאחר צף של גיליונות אפידרמיס על מדיום המכיל וירוס, ניתן דמיינו תאים נגועים בשכבת בסיס אפידרמיס בpostinfection השונים פעמים (PI) 7. כדי להמחיש את החניכה של זיהום בתאים בודדים לפני שכפול נגיפיND ייצור וירוס, אנחנו מוכתמים עם נוגדן נגד החלבון נגוע תא 0 (ICP0), שהוא אחד מהחלבונים הראשונים הביעו במהלך זיהום HSV-1. הלוקליזציה הסלולרית של ICP0 עוברת דרך שלבים ברורים בזיהום מוקדם. בעוד ICP0 נמצא במוקדי גרעין בשלב מוקדם של ביטוי גנים נגיפי, relocalization של ICP0 לציטופלסמה מציין שלב הבא של זיהום 8.
אנו משמשים assay זיהום vivo לשעבר של גיליונות אפידרמיס ממודלי עכבר שונים על מנת לבחון את התפקיד הפוטנציאלי של גורמים סלולריים שונים במהלך הדבקה. כדי לטפל בהשפעה של Rac1 כרגולטור מרכזי של דינמיקה אקטין, אנחנו נגועים האפידרמיס של עכברים עם מחיקת keratinocyte הספציפית של גן Rac1 9. מודל זה מאפשר לנו ללמוד את ההשלכות של Rac1 הלקוי על היעילות של זיהום HSV-1 בשכבות keratinocyte אפידרמיס. ההשוואה לעור נגוע של המלטת שליטה מחדשvealed אין הבדל משמעותי, מצביע על כך שהעדר Rac1 לא היה השפעה על תחילתו של זיהום בשכבת הבסיס של האפידרמיס 7. השימוש במודלים של עכברים נוספים אפשרו לנו לטפל בי קולטנים סלולריים לתווך כניסה לאפידרמיס. הדבקת גיליונות אפידרמיס משני nectin-1- או עכברי HVEM לקויים עם HSV-1 עולה כי הכניסה הנגיפית הראשונית לרקמה מאוד תלויה בנוכחותו של nectin-1 10. יתר על כן, התוצאות שלנו מראות כי HVEM גם יכול לשמש כקולטן בעור בעכברים, אם כי בצורה פחות יעיל מאשר nectin-1 10.
כדי לטפל בפריסה המרחבית של תאים נגועים בשכבות אפידרמיס, אנחנו לדמיין ביטוי ICP0 בסעיפים רקמות וmounts אפידרמיס השלם (איור 1). בcryosections של עור מלא, לא להביע תאי ICP0 מזוהים (איור 1). לעומת זאת, cryosections של גיליונות אפידרמיס להפגין cytoplasmicביטוי ICP0 בשכבת הבסיס כבר בשעת 3 pi שעות (איור 1). בתקופות מאוחרות יותר, נגיפי מתפשט לsuprabasal שכבות ניתן דמיין. הפריסה המרחבית של תאים נגועים בשכבת הבסיס יכולה להיות בקלות מיושמת בmounts אפידרמיס השלם (איור 1). על זיהום HSV-1 ב 100 PFU / תא, כ -50% מקרטינוציטים הבסיס באפידרמיס interfollicular להראות ביטוי ICP0 1.5 pi משאבי אנוש בנקודה זו בזמן תאים הנגועים ביותר להביע ICP0 הגרעיני. Relocalization של ICP0 לציטופלסמה המציין שלב מאוחר יותר של ביטוי גנים המוקדם נמצא כמעט בכל התאים בשעה 3 pi (איור 1). מצבים אלה של הדמיה תאים נגועים על זיהום HSV-1 vivo לשעבר מספקים assay רב עוצמה כדי לחקור את ההשפעה של מעכבים או של רכיבים סלולריים מוטציה נמחקו / בכניסת ויראלי והתפשטות ברקמה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת אתיקה.
הכנת גיליונות אפידרמיס מחיות הקריבו מתבצעת בהתאם קפדן עם ההמלצות של המדריך של Landesamt für נאטור, Umwelt וVerbraucherschutz, Northrhine-וסטפליה (גרמניה). המחקר אושר על ידי LANUV NRW (מספר 8.84-02.05.20.13.018).
1. הכנה של מכשירים ותרבות מדיה
- לטפח גיליונות אפידרמיס במדיום של הנשר שונה Dulbecco (DMEM) / גלוקוז גבוהה המכיל Dipeptide גלוטמין, FCS 10%, 100 IU / פניצילין מיליליטר, 100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין (להלן "DMEM").
- להכנת גיליונות אפידרמיס, לפזר בזהירות dispase השנייה אבקה (5 מ"ג / מיליליטר) ב- PBS המחוממת (עד 37 מעלות צלזיוס). סנן את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר ולהשתמש בו באופן ישיר לטיפול.
- להכנת כל אפידרמיס mounts 13, להכין חסימת חובבאה עם 0.5% אבקת חלב, ג'לטין 0.25% מעור דג מים קרים ו 0.5% Triton X-100 ב TBS. הרשה חומרים לפזר ידי דוגרים התערובת לפחות שעת 2 ב RT על מיקסר מסתובב. כמו כן להכין 0.2% Tween 20 בPBS כחיץ כביסה. לקיבעון, להכין 3.4% ו -4% בפורמלדהיד PBS.
- לimmunostaining של cryosections, להכין חיץ חסימה עם 5% בסרום נורמלי עז ושל 0.2% Tween 20 בPBS. לקיבעון, להכין פורמלדהיד 0.5% ב- PBS.
2. הכנת גיליונות עוריות מעור Murine
- הכנת עור מעור חזרה זה עתה נולד ללימודי זיהום
- הנח עכבר ערוף (1 עד 3 ימים לאחר לידה) לתוך צלחת לנתיחה ומנותקת גפיים והזנב קרוב לגוף כדי לאפשר ההסרה יעילה של העור מהגוף השלם. במהלך ההסרה של הגפיים, מנסה לשמור על החתכים קטנים ככל האפשר בקוטר.
- תקן את פלג הגוף העליון עם מלקחיים בסדר מעוקליםnd בעדינות להזיז מספריים קצה קהים מתחת לעור מגולגולת לזנב לאורך הגב להפריד את העור מהגוף. שיסף את העור לאורך הגב.
- לניתוח FACS, הבידוד של קרטינוציטים או הכנה של RNA, לקלף את העור המלא מהגוף באמצעות מלקחיים כדי לתקן את הרקמות ומספרי קצה הקהים לדחוף את פלג הגוף העליון. להכנת cryosections או כל mounts לקחת חתיכות של עור הגב בלבד.
- קוצצים את עור הגב עם אזמל לתוך 1-2 חתיכות של כ 10 x 10 מ"מ. שים את חתיכות ובאחד 6-גם צלחת עם ~ 1 מיליליטר סטרילי PBS. ודא שצד העור פונה לתחתית.
- החלף PBS על ידי 1.5 מיליליטר dispase השני (5 מ"ג / מיליליטר PBS) ודגירה או 30 דקות ב 37 ° C (לכל mounts) או O / N ב 4 ° C. לשטוף 3 פעמים עם PBS. הוצא בעדינות את העור כגיליון שלם באמצעות אחד מלקחיים כדי לתקן את העור הבסיסי ומלקחיים האחרים כדי להרים את העור. השתמש במשקפת כדי להפוך EAS שלב זהy. העבר את גיליון לאפידרמיס DMEM עם הצד הבסיסי שלה לתחתית. השתמש בגיליונות מייד לניסויי זיהום.
הערה: השתמש בהכנת עור מעור יילוד בעיקר לניתוח FACS, בידוד של קרטינוציטים או הכנה של RNA. בגלל השבריריות שלה, הכנת גיליונות נגועים לcryosections או כל mounts היא פחות מתאימה.
- הכנת עור מעור זנב בוגר ללימודי זיהום
- להרדים את העכברים בגיל 1 עד 3 חודשים על ידי נקע בצוואר הרחם. קח זנב במקום עור גב מאז זקיקי שיער הארוך המוטבעים על הגב להפריע הפרדת גיליונות אפידרמיס בשלמותה. חותך את הזנב מעכברים הקריבו ושיסף אותו לאורכו עם אזמל.
- לקלף את העור מהעצם וקוצצים אותו עם אזמל לחתיכות של כ -5 X 5 מ"מ. לשים עד 4 חתיכות ובאחד ולהמשיך בדגירה בdispase השנייה כאמור ב2.1.5
הערה: טאי המבוגר השתמשתי בעור l להכין cryosections או כל mounts. לחלופין לשימוש המיידי, ניתן לאחסן זנבות או מועברים לכ 24 שעות על 4 מעלות צלזיוס מבלי לאבד יעילות זיהום משמעותית. אם זנבות נשמרים עד 48 שעות, גיליונות אפידרמיס יכולים להיות כמעט נגוע HSV-1.
- ניתוק של האפידרמיס לניתוח FACS
הערה: איתור של ביטוי חלבון פני השטח על ידי ניתוח FACS דורשת טכניקות ניתוק התא מתאימות שאינו פוגעות בתא השטח והחלבון של עניין.- דגירה גיליונות אפידרמיס יילוד בצלחת 6 גם עם הצד הבסיסי על 1.5 מיליליטר פתרון / גם רקומביננטי מבוסס טריפסין תא דיסוציאציה במשך 15 דקות ב RT ובמשך 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס.
- לעצור את הדגירה על ידי הוספת 3 מיליליטר DMEM. לנתק קרטינוציטים באמצעות מלקחיים בסדר מעוקלים להעביר את האפידרמיס בעדינות בצלחת 6-כך טובה שקרטינוציטים לקבל מומסים. אסוף את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו 3 פעמיםתמיד באמצעות DMEM הטרי.
הערה: הליך ניתוק זה הוא מתאים כדי לזהות nectin-1 על פני השטח של קרטינוציטים. - לחלופין, דגירה גיליונות אפידרמיס על פתרון תא דיסוציאציה ללא אנזים (CDS) במשך 15 דקות ב RT ו- 15 דקות על 37 מעלות צלזיוס. דגירה 15 דקות נוספות ב RT כדי לשטוף את עדינות קרטינוציטים ידי pipetting CDS למעלה ולמטה.
- אסוף את ההשעיה התא ולחזור על שלב השטיפה 3 פעמים באמצעות DMEM הטרי.
הערה: ניתוק זה מתאים כדי לזהות ביטוי פני השטח של HVEM. החסרון של פתרון ה- CDS הוא שפחות תאים הם ניתקו מאשר עם פתרון תא דיסוציאציה מבוסס טריפסין רקומביננטי. בנוסף למשטח ביטוי, ניתן לנתח ביטוי גרעיני או cytoplasmic כגון ביטוי ICP0 ידי FACS לאחר הניתוק של גיליונות אפידרמיס הנגועים עם פתרון תא דיסוציאציה מבוסס טריפסין רקומביננטי.
- ניתוק של האפידרמיס כדי לבודד קרטינוציטים או לשעברRNA בדרכי
- שים גיליונות אפידרמיס יילוד בצלחת 6 גם עם צד הבסיס לכיוון החלק התחתון של המנה המכילה 1.5 מיליליטר / פתרון תא דיסוציאציה מבוסס טריפסין גם רקומביננטי. דגירה של 30 דקות ב RT. להוסיף 3 מיליליטר DMEM ולנתק קרטינוציטים באמצעות מלקחיים בסדר מעוקלים להזיז בעדינות את העור בצלחת.
- אסוף את ההשעיה התא ולחזור על פעולה זו 3 פעמים באמצעות DMEM הטרי. השתמש השעיה תא זה כדי לחלץ RNA או לקרטינוציטים עכברי עיקרי תרבות.
3. זיהום של גיליונות עוריות עם HSV-1
- הכן פתרון של מתח WT HSV-1 17 11 בלא פחות מ -500 μl DMEM ולהחליף את המדיום על ידי פתרון הווירוס שבגיליונות אפידרמיס צפים. נקודת זמן זו מוגדרת כזמן 0 12. בצע זיהום של גיליון אפידרמיס ובאחד של צלחת 24 גם ב 37 מעלות צלזיוס. החישוב של כייל הנגיף מבוסס על המספר המשוערשל תאים בשכבת הבסיס לגיליון אפידרמיס (כ 2 x 10 5 תאים בגיליון 5 X 5 מ"מ).
- להדביק עם HSV-1 בכ -100 יחידות פלאק ויוצרים (PFU) / תא ולהחליף את המדיום המכיל וירוס על ידי DMEM בpi שעה 1
הערה: במקרה של גיליונות אפידרמיס מעור תינוק, יש לזכור כי גיליונות להתחיל לנתק במהלך דגירה.
4. ויזואליזציה של תאים נגועים
- אפידרמיס השלם 13 Mounts
- תקן גיליונות אפידרמיס עם פורמלדהיד 3.4% גם עבור שעה 2 ב RT או O / N ב 4 מעלות צלזיוס. לשטוף פעמיים עם PBS ולחסום עם 0.5% אבקת חלב, ג'לטין 0.25% מעור דג מים קרים ו 0.5% Triton X-100 בכפות עבור שעה 1 בגיל 14 RT.
- דגירה הגיליונות O / N עם אנטי-ICP0 עכבר (נוגדנים חד שבטיים 11060) 15 מדוללים 1:60 בחיץ חסימה ב RT. כדי להמחיש את רשת נימה ביניים דגירה בו זמנית עם הארנב polyclonal אנטיקרטין העכבר 14 (מיליליטר / 100 ng).
- לשטוף 4 עד 5 פעמים עם Tween%-0.2 PBS 20 במהלך 4 שעות ב RT. דגירה O / N עם IgG אנטי עכבר (1 מיקרוגרם / מיליליטר), IgG נגד הארנב AF555 מצומדות- (1 מיקרוגרם / מיליליטר), וDAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) (100 ng AF488 מצומדות- / מיליליטר) בחסימת המאגר ב RT.
- לשטוף עם Tween%-0.2 PBS 20 במשך 4 שעות ב RT. גיליונות אפידרמיס הר עם הצד הבסיסי שלהם על גבי שקופית דגימה, להטביע במדיום הרכבה ניאון ולכסות עם coverslips.
- אפידרמיס cryosections
- גיליונות אפידרמיס מבוגרים היו קבועים בפורמלין 4% ב- PBS עבור 20 דקות ב RT ורחצו 2 פעמים עם PBS. להטביע גיליונות קבועים ברקמות הקפאה בינוניות והקפאה בחנקן נוזלי. חותך 8-10 מיקרומטר חלקים עם cryomicrotome.
- לתקן את הסעיפים שוב עם פורמלדהיד 0.5% ב PBS במשך 10 דקות ב RT, לשטוף 2 פעמים עם PBS, בלוק עם 5% בסרום נורמלי עז ושל 0.2% Tween 20 בPBS למשך 30 דקות ב RT, ולאחר מכן כתם דקות 60 מ 'עםהאוז אנטי-ICP0 (נוגדנים חד שבטיים 11060) 15 מדוללים 1:60 במאגר חסימה, ואחריו 3 פעמים כביסה עם חיץ החסימה.
- אז דגירה עם IgG AF488 מצומדות- אנטי עכבר (1 מיקרוגרם / מיליליטר) וDAPI (100 ng / ml) בחסימת חיץ במשך 45 דקות ב RT ולשטוף 3 פעמים. שבץ סעיפים בהרכבה בינונית ניאון ולכסות עם coverslips.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
האתגר של השיטה הוא להכין גיליונות אפידרמיס שלתוכו HSV-1 יכול לחדור משיכבת הבסיס. השלב הקריטי הוא ההפרדה של האפידרמיס מהדרמיס על ידי טיפול dispase השני, אשר, בהתאם לזן העכבר, צריך להיות מותאמות. הריכוז של dispase השנייה יכול לנוע 2.5-5 מ"ג / מיליליטר, וזמן דגירה 20-45 דקות. ההכתמה של קרטין חלבון נימה ביניים 14 בקלות מאפשרת ניבוי אם שכבת האפידרמיס הבסיסית יכולה להיות נגועה או אם היא תציג מספר מאוד מצומצם של תאים נגועים (איור 2). באופן אידיאלי, צביעת קרטין 14 של כל mounts אפידרמיס צריכה לציין שכבה שלמה של תאי בסיס (איור 2 א). במקרה הגרוע ביותר, טיפול השני dispase שיבש את שכבת הבסיס ואין תאים המוכתמים באפידרמיס interfollicular המציין כי קרטין 14 להביע קרטינוציטים בסיסיים הם ניתקו (איור 2 16 (איור 2) . רק לאחר ההפחתה של dispase השנייה ל -2.5 מ"ג / מיליליטר במשך 30 דקות, שכבת בסיס שלמה הייתה מתקבלת כמדמיינים ידי קרטין 14 צביעה (איור 2 ג).
בגלל זקיקי שיער הצפופים כנספחים של האפידרמיס, ההפרדה של האפידרמיס מהדרמיס היא נוחה ביותר כאשר העור נלקח מהזנבות של עכברים בוגרים. לחלופין, ניתן להשתמש בגב העור של עכברים ילודים עם פיתוח זקיקי שיער, למרות שאת השבריריות של הגיליונות לאחר הדגירה מגבילה את גודלם של שטחים לאנליזה. עד כה, לא נמצא הבדל ביעילות של זיהום HSV-1 היה שם לב, תלוי אם האפידרמיס נלקח מעכברים שזה עתה נולדו או מבוגר (איור 3). mounts כל newboהאפידרמיס rn לדמיין זיהום יעיל של האפידרמיס interfollicular כמו גם של התאים הצפופים המצפים את זקיקי שיער פיתוח (איור 3). בעוד האפידרמיס interfollicular של האפידרמיס מבוגרים נגוע ביעילות, חיידקי שיער ורק חלקים מנדני השורש החיצוניים של זקיקי שיער נגועים (איור 3). בלוטות החלב מתחת לשערה תמיד מוכתמות, שהוא, לעומת זאת, בשל כתמים הלא ספציפיים של הנוגדנים משני, כפי שמוצגות בבקרה נגוע (איור 3).
באמצעות מחקרי המעכב חקרנו, אם כולסטרול משחק תפקיד לכניסה HSV-1 לאפידרמיס. גיליונות אפידרמיס של עכברים בוגרים היו קודם לכן בתיל-β-cyclodextrin (MβCD), אשר מכלה כולסטרול מקרום הפלזמה 17-19. לפני הזיהום, MβCD הוסר על ידי כמה צעדי כביסה כדי למנוע כל השפעה על כולסטרול וכלה בenvel הנגיפיאופ. על הטיפול מראש עם 20 מ"מ MβCD כמעט תאים נגועים לא נראו בכל האפידרמיס interfollicular או חיידקי שיער, אבל הכתמים שאינם ספציפיים רק של בלוטות החלב היה (איור 4 א) נראה לעין. כביקורת שהרקמה לא נפגעה על ידי טיפול מעכב, הוספנו 500 כולסטרול מיקרוגרם / מיליליטר כדי לחדש את הגיליונות שטופלו MβCD אפידרמיס (איור 4 א). טיפול זה שוחזר לחלוטין infectivity הוכחה כי הטיפול המקדים עם המעכב לא להפריע ליכולת קיום של הרקמה.
שימוש במודלים של עכברים שהתייחסנו למעורבות של nectin-1 ומגשר כניסת הרפס (HVEM) כקולטניים סלולארי לHSV-1 בעור 10. שני החלבונים ידועים לפעול קולטנים יעילים כעבור HSV בשורות תאים שונים 20,21, והם מספקים להתפתחות מחלה בעכברים 22. אנחנו נקבע את תפקידי עור ספציפי של nectin-1 וHVEM כHSV-1 קולטנים 10. לאחר צף גיליונות אפידרמיס מwildtype, העכברים nectin-1- או HVEM הלקוי במדיום המכיל וירוס, mounts כל הוכנו בשעה 3 pi לדמיין את מספר התאים נגועים. ההשוואה של epidermises interfollicular מצביעה על כך שnectin-1 מחסור רק באופן דרמטי הקטין את מספר התאים לבטא-ICP0 (איור 4). בנוסף, ההתפשטות נגיפית הייתה מוגבלת למדי בהעדר nectin-1, כפי שמוצג בcryosections ב 18 שעות pi (איור 4C). לכימות של התאים הנגועים, חשוב לפקח אם מספר התאים הנגועים מופץ באופן שווה על פני עור interfollicular או אם אשכולות של תאים נגועים הם נצפו. באפידרמיס nectin-1-לקוי לדוגמא, את יעילות הזיהום מגוונת עם כ 10% זיהום באזורים מסוימים וכ -30% באזורים אחרים של האפידרמיס interfollicular 10. לפיכך, החלטנו לאo לתת לא מספרים של תאים נגועים כדי להדגים את הירידה של זיהום, אבל כל mounts הנוכחי כנתונים איכותיים.
איור 1:. ויזואליזציה של תאים נגועים בסעיפים אפידרמיס או כל mounts אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בחלק העליון היא תכנית הממחישה דגימות עור מבוגר מלאים, חלקי אפידרמיס לאחר הפרדה מהדרמיס, וכל mounts אפידרמיס עם המשטח הגלוי של שכבת keratinocyte הבסיסית. נקודות החצים כדי זקיק שיער והכוכב מציינת את האפידרמיס interfollicular. דגימות עור וגיליונות אפידרמיס הוכנו מעכברים ישנים 3 שבועות נדבקו HSV-1 בכ -100 PFU / תא וקבוע על 1.5 או 3 דוגמאות pi שעה היו staineד עם אנטי-ICP0 (ירוק) לאחר מדומה זיהום או 1.5 או 3 pi שעות לדמיין תאים נגועים, וcounterstaining של הגרעינים עם DAPI (כחול) מדגים את כל התאים בשכבות השונות. כביקורת, דגימות עור מלאים נגוע מדומה מוצגות בהשוואה לדגימות נגועות בשעה 3 pi מפגין לא מכתים ICP0 (חלק שמאלי). גיליונות אפידרמיס מוק-נגועים או נגועים הוכנו כcryosections מוצגים בחלק האמצעי. כל mounts אפידרמיס הנגוע תמורת 1.5 או 3 שעות מוצג בחלק הימני. בר, 25 מיקרומטר (cryosections), ו -40 מיקרומטר (mounts כל).
איור 2:. מכתים קראטין 14 של כל mounts אפידרמיס לאחר דגירה עם ריכוזים שונים של dispase השנייה אפידרמיס מC57BL / 6 או עכברי B6.A2G-MX1 הופרד מעור עם dispase השנייה. כל mounts אפידרמיס הוכתמו אנטי-keratin 14 (אדום) ועם DAPI (כחול). גיליונות אפידרמיס הודגרו עם 5 מ"ג / מיליליטר (A, B) או 2.5 מ"ג / מיליליטר dispase (ג) השני למשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס. בר, 25 מיקרומטר. קיצורים:. זקיק שיער (HF), האפידרמיס interfollicular (ife), בלוטת החלב (SG) אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3:. יזואליזציה של ביטוי ICP0 בmounts של האפידרמיס יילוד או מבוגר כל ערכות הממחישות mounts כל אפידרמיס עם זקיקי שיער או פיתוח זקיקי שיער, המראה את פני השטח נראה לעין של שכבת הבסיס מepidermises מבוגרים והתינוק, בהתאמה. גיליונות אפידרמיס נדבקו HSV-1 בכ -100 PFU / תא, וכל mounts הוכתמואנטי-ICP0 (ירוק) ועם DAPI (כחול) בשעה 3 pi כשליטה, mounts כל נגוע אפידרמיס מעור זנב בוגר היו מוכתם רק עם נוגדנים משני מדגימים הצביעה הלא הספציפית של בלוטות החלב. בר, 25 מיקרומטר. קיצורים: פיתוח זקיק שיער (DHF), זקיק שיער (HF), האפידרמיס interfollicular (ife), בלוטת החלב (SG). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4:. הערכת ההשפעה של גורמים סלולריים באמצעות אחת MβCD המעכב או nectin-1- או epidermises HVEM הלקוי () גיליונות עוריות מעור זנב בוגר של עכברי 3 בשבוע ישן WT (C57BL / 6) היו קודם לכן בMβCD (20 מ"מ) ונגוע HSV-1 בapproxiשלו של דבר 100 PFU / תא. כביקורת, גיליונות אפידרמיס מטופל נדבקו, וגיליונות אפידרמיס pretreated עם 35 מ"מ MβCD טופלו עם 500 מיקרוגרם / מיליליטר כולסטרול לפני ההדבקה. כל mounts אפידרמיס הוכתמו אנטי-ICP0 (ירוק) ועם DAPI (כחול) בשעה 3 pi כדי להדגים את מספר התאים הנגועים לאחר הדלדול של כולסטרול על ידי טיפול MβCD. כפי שניתן לראות באיור 3, הכתמה של בלוטות החלב (SG) היא לא ספציפית. קיצורים: HF (זקיק שיער), ife (האפידרמיס interfollicular), SG (בלוטת החלב). בר, 150 מיקרומטר. (ב) epidermises זנב למבוגרים של WT (C57BL / 6), nectin-1- 23, או HVEM לקוי עכברי 24 (1 בן חודש) נדבקו בכ -100 PFU / תא. כל mounts אפידרמיס הוכתמו אנטי-ICP0 (ירוק) ועם DAPI (כחול) בשעה 3 pi (C) cryosections של גיליונות אפידרמיס מWT (C57BL / 6) או nectin-1-לקוי עכברים 23 היו מוכתמים בגיל 18 pi שעות מילאולטס מוצג ב( ב) ו- (ג) הם שונה מהתייחסות 10. בהיטלי confocal, B ו- C והתמזג תמונות מוצגות. בר, 150 מיקרומטר (א) ו -25 מיקרומטר (B, C). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כאשר גיליונות אפידרמיס של עור בוגר מC57BL / 6 נגועים HSV-1 בכ -100 PFU / תא, אנו רואים זיהום כמעט בכל תאים של שכבת הבסיס באפידרמיס interfollicular בעוד מינונים נמוכים וירוס לתאם עם תאים נגועים פחות ואיטי יותר התקדמות של זיהום. באופן כללי, זקיקי שיער להראות מספר משתנה של תאים נגועים; בעוד רוב קרטינוציטים הקטנים למדי המצפים את זקיקי שיער פיתוח נגועים, רק נבט השיער של זקיק השיער הבוגר נגוע לחלוטין. בהתאם לאופן עדין את ההפרדה של האפידרמיס ידי תמורת טיפול dispase השנייה, חלקים של זקיקי שיער לאיבוד. ברוב המקרים, שכבות keratinocyte בין בלוטות החלב והאפידרמיס interfollicular חסרות והשכבה המרפדות את נדני שורש החיצוניים עשויה להיות מופרת. בכל מקרה, ההליך של הפרדת העור מהדרמיס ויעילות זיהום יכול להשתנות מזן עכבר אחד למשנהו ( יחדיו, האתגר של vivo לשעבר assay הזיהום הוא ההכנה והתחזוקה של גיליונות אפידרמיס. השבריריות של הרקמה דורשת טיפול זהיר מאוד ושולטת היטב הרקמה נשמרה לאחר הפרדה מהדרמיס. נושא נוסף הוא יכולת הקיום המוגבלת של הגיליונות בתרבות. מאז כדאיות תא פוחתות עם זמן, יש לבצע ניסויי זיהום מייד או לפחות 3 שעות לאחר ההכנה של הגיליונות. בנוסף לעור בעכברים, גיליונות אפידרמיס ניתן גם הכינו מדגימות עור או רירית אדם. בהתאם לאופי והעובי של האפידרמיס, טיפול dispase יש להיות מותאם. לעקוב אחר המהלך של זיהום, הוא מתאים ביותר כדי להמחיש תאים נגועים בcryosections. אחד יש לזכור כי עם PFU / תא גבוה ופעמים יותר של זיהום, גיליונות אפידרמיס להתחיל איזשהו disintegration. בהתבסס על השפעה cytopathic, תאים עגולים ואנשי קשר תאי תאים מקבלים שיבשו. על ידי pi שעות 24 עם 100 PFU / תא, כמה תאי בסיס נגועים יכולים ללכת לאיבוד, אשר עשוי להיות תלויים גם בטיפול dispase השני. עם נמוך PFU / תא, ניתן להאריך פעמים זיהום מבלי שהוביל לניזק לרקמות קשות. לחלופין, את מידת נזק יכולה לשמש כסמן של כמה זני וירוס שונים פתוגניים הם. אנחנו מעדיפים לדמיין תאים נגועים על ידי צביעת ביטוי ICP0. היתרון הוא גילוי מוקדם למדי של תאים נגועים, ו, המבוססים על דפוס מכתים ICP0, ניתן להבחין בתאים בשלב מוקדם במהלך זיהום מאלה בשלב מתקדם. לחלופין, ניתן דמיינו תאים נגועים על ידי צביעת ביטוי של גנים מוקדמים אחרים כגון VP5 חלבון קפסיד הנגיפי וקב"ה חלבון מעטפת הנגיפי. גם אנחנו ניסינו לדמיין חלקיקי נגיף נכנסים לפני ביטוי גנים נגיפי או על ידי INFהשתקפות עם מתויג GFP HSV-1 או על ידי צביעת capsids בדגימות קבועות. על פי ניסיוננו, הדפוס של ה- GFP-הקרינה או דפוס מכתים בסעיפים רקמות מורכב מכדי להפגין הנוכחות של חלקיקי וירוס הפנימו באופן ברור. לחלופין, ניתן דמיינו חלקיקי נגיף על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים, כאשר titers וירוס הגבוה של ~ 1,000 - 1,500 PFU / תא משמש. במקרה של מינון נמוך יותר וירוס, חלקיקי וירוס יכולים להיות כמעט זוהה. במקום לדמיין תאים נגועים בגיליונות אפידרמיס שלמים, יכול להיות מנותק האפידרמיס לנתח רמות RNA או לכמת את מספר התאים עם משטח ביטוי, cytoplasmic או גרעיני של הגנים של עניין על ידי ניתוח FACS. אנו מניחים כי vivo לשעבר פרוטוקול זיהום זה יכול להיות מותאם לפחות לאלה וירוסים שידועים כי הם להדביק קרטינוציטים בסיסיים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים פיטר Staeheli למתן עכברי B6.A2G-Mx1 וSemra Özcelik לייעוץ טכני.
עבודה זו נתמכה על ידי קרן המחקר הגרמנית דרך SFB829 וKN536 / 16, וקלן Fortune תכנית / הפקולטה לרפואה, אוניברסיטת קלן.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J.
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
