Abstract
Чтобы ввести свой человеческий хозяина, вирус простого герпеса типа 1 (ВПГ-1), должны преодолеть барьер слизистой оболочки поверхностей, кожи, или роговицы. ВПГ-1 кератиноцитов цели во время начальной записи и устанавливает первичной инфекции в эпителии, за которым следует латентной инфекции нейронов. После реактивации, вирусы могут стать очевидным при кожно-сайтов, которые появляются, как пузырьки кожи и слизистых язв. Как ВПГ-1 поражает кожу или слизистую оболочку и достигает его рецепторы плохо понял. Для исследования вторжения маршрут ВПГ-1 в эпидермальной ткани на клеточном уровне, мы установили экс естественных условиях инфекция модель мышиных эпидермиса, который представляет сайт первичной и рецидивирующей инфекции в коже. Анализ включает в себя подготовку мышиной кожи. Эпидермис отделен от дермы путем обработки диспаза II. После плавающей эпидермиса листа на вирус среде, содержащей, ткань является фиксированной и инфекция может быть визуализированы в разное время по постинфекционныеокрашивания инфицированных клеток с антителами против ВПГ-1 немедленного раннего ICP0 белка. ICP0-экспрессирующих клеток может наблюдаться в базальном слое кератиноцитов уже на 1,5 ч постинфекционные. С более длительным временем инфекции, инфицированные клетки обнаружены в супрабазальных слоев, указывая, что инфекция не ограничивается базальных кератиноцитов, но вирус распространяется на другие слои в ткани. Использование эпидермиса листы различных мышиных моделях, протокол инфекции позволяет определить участие клеточных компонентов, которые способствуют ВПГ-1 в ткани вторжения. Кроме того, анализ подходит для тестирования ингибиторов в тканях, которые мешают начальных шагов входа, распространение клетки к клетке и производство вирусов. Здесь мы опишем экс естественных условиях протокол инфекции в деталях и представить наши результаты, используя nectin-1- или Hvem-дефицитных мышей.
Introduction
Вирус простого герпеса (ВПГ) может вызвать целый ряд заболеваний у людей с умеренными неосложненных поражений слизистых до угрожающих жизни инфекций. ВПГ 1 (HSV-1) преимущественно связана с орофациальных инфекций и энцефалита, тогда как ВПГ 2 (HSV-2), более вероятно вызывает генитальные инфекции 1. В то время как существует значительный прогресс в понимании того, как ВПГ входит в культуре клеток, инициирует инфекции и производит потомство вирусной, мы мало знаем о вирусной инвазии пути (ов) в ткани на клеточном уровне 2. Для изучения HSV кожи или слизистой оболочки, инфекции мышей, кроликов и морских свинок были использованы в качестве модельных животных. Инфекции кожи был создан внутрикожной инъекцией или царапин кожи в присутствии вируса, и развитие болезни коррелирует с продукции вируса. Эти методы помогли понять различные аспекты патогенеза заболевания, и используются для оценки противовирусные препараты. Для изучения HSV-инфекции в Tissuе уровня, органотипической модели кожи человека были применены. Как скорость распространения инфекции ограничен в этих плот культур, лишь ограниченное число исследований следственных инфекции, распространение вируса и последствий антивирусных компонентов были опубликованы 3-6.
Для того чтобы охарактеризовать клеточные детерминанты, которые играют роль в HSV-1 инфекции в неповрежденной эпителия, мы создали протокол для бывших естественных инфекции исследований мышиных эпидермиса 7. Кожа получали из новорожденных или из хвостов взрослых мышей. Так ВПГ-1 не может инфицировать полные образцы кожи, которые были погружены в вирус-содержащей среде, мы разделены эпидермис от дермы путем обработки диспаза II. После плавающей эпидермиса листов на вирус среде, содержащей, инфицированные клетки могут быть визуализированы в эпидермального базального слоя в разное время постинфекционные (PI) 7. Для визуализации инициации инфекции в отдельных клетках до вирусной репликации аго производство вируса, мы окрашивали антителами против зараженной клетки-белка 0 (ICP0), который является одним из первых белков, выраженных в ходе HSV-1 инфекции. Клеточная локализация ICP0 проходит через различные фазы в начале инфекции. В то время как ICP0 присутствует в ядерной очагов на ранней стадии экспрессии вирусных генов, релокализации ICP0 в цитоплазму указывает более позднюю фазу инфекции 8.
Мы использовали экс естественных условиях инфекция анализа эпидермиса листов из разных мышиных моделях, чтобы проверить потенциальную роль различных клеточных факторов во время инфекции. Для устранения последствий Rac1 в качестве ключевого регулятора динамики актина, мы заражены эпидермис мышей с кератиноцитов конкретных удаление гена Rac1 9. Эта модель позволила нам изучить последствия недостаточного Rac1 на эффективность ВПГ-1 инфекции в эпидермального кератиноцитов слоев. Сравнение с зараженных эпидермиса управления помета повторноне ружены никакого существенного различия, указывая, что отсутствие Rac1 не имели никакого эффекта на инициации инфекции в базального слоя эпидермиса 7. Использование дополнительных мышиных моделях позволили нам обратиться, какие клеточные рецепторы опосредуют вступления в эпидермисе. Заражение эпидермальные листов или из nectin-1- или HVEM-дефицитных мышей с ВПГ-1 показали, что начальная проникновение вируса в ткани сильно зависит от наличия nectin-1 10. Кроме того, наши результаты показывают, что HVEM может также служить в качестве рецептора в мышиных эпидермиса, хотя менее эффективно, чем nectin-1 10.
Для решения пространственное распределение инфицированных клеток в эпидермального слоев, мы представляем себе ICP0 выражение в срезах тканей и эпидермиса тотальных (рисунок 1). В криосрезов полной кожи, не ICP0-экспрессирующие клетки не обнаружены (рисунок 1). В противоположность этому, криосрезы эпидермальных листов демонстрируют цитоплазматическиеICP0 выражение в базального слоя уже в 3 часа пи (рисунок 1). В более поздние времена, вирусная распространяется на супрабазальных слои могут быть визуализированы. Пространственное распределение зараженных клеток базального слоя могут быть легко проследить в эпидермальных тотальных (рисунок 1). После инфицирования ВПГ-1 при 100 КОЕ / клетку, примерно 50% из базальных кератиноцитов в эпидермисе межфолликулярного показать ICP0 выражение в 1,5 ч пи В этот момент времени большинство инфицированных клетки экспрессируют ядерный ICP0. Релокализации ICP0 в цитоплазму с указанием более поздней стадии выражения начале гена присутствует почти во всех клетках в 3 ч пи (рисунок 1). Эти режимы визуализации инфицированные клетки при экс естественных условиях ВПГ-1 инфекции дают мощный анализ для изучения влияния ингибиторов или удаленных / мутантных клеточных компонентов на проникновения вируса и распространения в тканях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Заявление по этике.
Подготовка эпидермиса листов из жертвенных животных осуществляется в строгом соответствии с рекомендациями Руководства по Landesamt für Umwelt, Natur и Verbraucherschutz, Северный Рейн-Вестфалия (Германия). Исследование было одобрено LANUV NRW (номер 8.84-02.05.20.13.018).
1. Подготовка инструментов и культуры Медиа
- Выращивают эпидермальные листов в среде Игла в модификации Игла (DMEM) / высокий уровень глюкозы, содержащий глутамин дипептид, 10% FCS, 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина (именуемое в дальнейшем "DMEM").
- Для приготовления эпидермальных листов, тщательно растворить диспаза II порошок (5 мг / мл) в PBS с подогревом (до 37 ° C). Фильтр решение через 0,22 мкм фильтр и использовать его непосредственно на лечение.
- Для получения эпидермиса целом монтирует 13, подготовить блокирования баффэр 0,5% сухого молока, 0,25% желатина от холодной воды рыбьей кожи и 0,5% Triton X-100 в TBS. Разрешить растворение веществ путем инкубации смеси в течение по крайней мере 2 ч при комнатной температуре на ротационном смесителе. Также приготовьте 0,2% Твин-20 в PBS, как промывочного буфера. Для фиксации, подготовить 3,4% и 4% формальдегида в PBS.
- Для иммунным криосрезах, подготовить блокирующий буфер с 5% нормальной козьей сыворотки и 0,2% Tween 20 в PBS. Для фиксации, подготовить 0,5% формальдегида в PBS.
2. Подготовка эпидермиса листа из мышиной кожи
- Подготовка эпидермиса от новорожденного кожу спины для инфекции исследований
- Поставьте обезглавленное мышь (от 1 до 3 дней после рождения) в рассечение блюдо и отрезать конечности и хвост близко к туловищу, чтобы эффективное удаление кожи из полного туловища. Во время удаления конечностей, старайтесь держать сокращения как можно в диаметре.
- Закрепите торс с изогнутой тонкой щипцов аND осторожно двигаться тупые ножницы наконечник под кожей от головы к хвосту вдоль спины, чтобы отделить кожу от туловища. Разрежьте кожу вдоль спины.
- Для FACS анализа, выделения кератиноцитов или подготовки РНК, снимите кожу полную от туловища с помощью щипцов для фиксации ткани и тупые ножницы наконечника оттолкнуться туловище. Для приготовления криосрезах или тотальных принимать только куски кожу спины.
- Чоп заднюю кожу скальпелем в 1-2 кусков приблизительно 10 х 10 мм. Поместите части в одну лунку 6-луночного планшета с ~ 1 мл стерильной PBS. Убедитесь, что кожный сторона сталкивается дно.
- Заменить PBS с 1,5 мл диспаза II (5 мг / мл PBS) и инкубируют в течение либо 30 мин при 37 ° С (для крепления) целых или O / N при 4 ° С. Промыть 3 раза ЗФР. Аккуратно снимите эпидермис как нетронутыми листа с использованием одного щипцы, чтобы исправить основные дермы и другие щипцы, чтобы поднять эпидермиса. Используйте бинокль, чтобы этот шаг EASу. Передача эпидермальный лист в DMEM с базальной стороне в направлении нижней части. Сразу Используйте листы для инфекции экспериментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте подготовку эпидермиса от новорожденного кожи, главным образом, для FACS анализа, выделения кератиноцитов или подготовки РНК. Из-за его хрупкости, подготовка инфицированных листов для криосрезах или тотальных менее пригоден.
- Подготовка эпидермиса от взрослой кожи хвоста для инфекции исследований
- Усыпить мышей в возрасте от 1 до 3 месяцев по цервикальной дислокации. Возьмите хвост вместо кожу спины, так как давно встроенные волосяные фолликулы на задней затруднить разделение нетронутыми эпидермиса листов. Отрежьте хвост из жертвенных мышей и перерезал ее вдоль скальпелем.
- Слезьте кожу от костей и нарезать его скальпелем на кусочки примерно 5 х 5 мм. Положите до 4 штук в одной скважине и приступить к инкубации в диспазу II, как описано в 2.1.5
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте взрослых тайл кожа подготовить криосрезы или тотальных. В качестве альтернативы к немедленному использованию, хвосты можно хранить или транспортировать в течение примерно 24 ч при температуре 4 ° С без потери значительного эффективность инфекции. Если хвосты хранятся до 48 часов, эпидермальные листы могут быть едва инфицированных ВПГ-1.
- Диссоциация эпидермиса для анализа FACS
ПРИМЕЧАНИЕ: Обнаружение поверхностного экспрессии белка путем анализа FACS требует соответствующих методов клеточной диссоциации, что не вредят поверхности клеток и белка.- Инкубируйте новорожденных эпидермальные листов в 6-луночный планшет с базальной стороне от 1,5 мл / лунку рекомбинантного трипсина на основе диссоциации клеток раствор в течение 15 мин при комнатной температуре и в течение 15 мин при 37 ° С.
- Остановка инкубации добавлением 3 мл DMEM. Разбить кератиноцитов с помощью изогнутой тонких щипцов, чтобы аккуратно двигаться эпидермис в пластине 6-а, так что кератиноциты раствориться. Сбор суспензии клеток и повторите этот шаг 3 разавсегда свежих DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура диссоциации уместно определить nectin-1 на поверхности кератиноцитов. - В качестве альтернативы, инкубировать эпидермальные листов на фермента раствора без диссоциации клеток (CDS) в течение 15 мин при комнатной температуре и 15 мин при 37 ° С. Выдержите еще 15 мин при комнатной температуре, чтобы мягко избавиться кератиноцитов с помощью пипетки CDS вверх и вниз.
- Сбор суспензии клеток и повторите шаг Промывка 3 раза с использованием свежей DMEM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот диссоциации подходит для обнаружения поверхностную экспрессию HVEM. Недостатком раствора CDS, что меньше клетки диссоциируют, чем рекомбинантным трипсина на основе раствора для диссоциации клеток. В дополнение к поверхностной экспрессии, ядерная или цитоплазматической экспрессии, такие как выражение ICP0 могут быть проанализированы FACS после диссоциации инфицированных эпидермиса листов с рекомбинантным трипсина на основе раствора для диссоциации клеток.
- Диссоциация эпидермиса, чтобы изолировать кератиноциты или эксРНК-кишечного тракта
- Поместите новорожденных эпидермальные листов в 6-луночный планшет с базальной стороне в направлении нижней части блюда, содержащего 1,5 мл / лунку рекомбинантного трипсина на основе решения для диссоциации клеток. Инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Добавить 3 мл DMEM и отделить кератиноцитов с помощью изогнутой тонких щипцов, чтобы аккуратно двигаться эпидермис в блюдо.
- Сбор суспензии клеток и повторите этот шаг 3 раза с использованием свежей DMEM. Используйте этот суспензии клеток, чтобы извлечь РНК или первичной культуры мышиных кератиноцитов.
3. Заражение Эпидермальные листов с ВПГ-1
- Приготовьте раствор ВПГ-1 мас штамма 17 11 в не менее 500 мкл DMEM и заменить среду вирусом решения, на которых эпидермиса листы с плавающей запятой. Этот момент времени определяется как момент времени 0 12. Выполнение инфекции эпидермального листа в одну лунку 24-луночного планшета при 37 ° С. Расчет титра вируса на основе расчетного числаклеток в базальный слой эпидермиса листа на (примерно 2 × 10 5 клеток на 5 х 5 мм листа).
- Инфекция ВПГ-1 приблизительно в 100 бляшкообразующих единиц (БОЕ) / клетки и замените вирусов, содержащих среду DMEM по состоянию на 1 ч пи
ПРИМЕЧАНИЕ: В случае эпидермиса листа из новорожденного кожи, имейте в виду, что листы начинают диссоциировать во время инкубации.
4. Визуализация инфицированных клеток
- Эпидермального тотальных 13
- Исправление эпидермальные листы с 3,4% формальдегида либо в течение 2 ч при комнатной температуре или O / N при 4 ° С. Промыть два раза с PBS и блокируют 0,5% -ным сухим молоком, 0,25% желатина от холодной воды рыбьей кожи и 0,5% Triton X-100 в TBS в течение 1 ч при комнатной температуре 14.
- Выдержите листы О / N с мыши анти-ICP0 (моноклональное антитело 11060) 15, разбавленного 1:60 в блокирующем буфере при комнатной температуре. Для визуализации промежуточную сеть, нити инкубировать одновременно с кроликом поликлональных антимыши кератина 14 (100 нг / мл).
- Промыть 4 до 5 раз с PBS-0,2% Твин 20 в течение 4 ч при комнатной температуре. Инкубируйте O / N с AF488-конъюгированного антитела против мышиного IgG (1 мкг / мл), AF555, конъюгированных анти-кроличий IgG (1 мкг / мл), и DAPI (4 ', 6-диамидино-2-фенилиндол) (100 нг / мл) в блокирующем буфере при комнатной температуре.
- Промыть PBS-0,2% Tween 20 в течение 4 ч при комнатной температуре. Mount эпидермиса листа с их базальной стороне на вершине образца слайда, вставлять в люминесцентной монтажа среды и накрыть покровные.
- Эпидермального криосрезы
- Взрослые эпидермальные листы фиксировали в 4% формальдегиде в PBS в течение 20 мин при комнатной температуре и промывают 2 раза PBS. Код для вставки листов в фиксированных тканей замораживания среды и замораживание в жидком азоте. Вырезать 8-10 мкм разделы с cryomicrotome.
- Закрепить снова секции с 0,5% формальдегида в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре, мыть 2 раза PBS, блок с 5% нормальной козьей сывороткой и 0,2% Tween 20 в PBS в течение 30 мин при комнатной температуре, а затем окрашивают в течение 60 минут с мУз анти-ICP0 (моноклональное антитело 11060) 15 разбавляют 1:60 в блокирующем буфере, а затем 3 раза, омывающих с блокирующим буфером.
- Затем инкубируют с конъюгированным AF488 против мышиного IgG (1 мкг / мл) и DAPI (100 нг / мл) в блокирующем буфере в течение 45 мин при комнатной температуре и промыть 3 раза. Вставить разделы в люминесцентной монтажа среды и накрыть покровные.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Задача метода состоит в подготовке эпидермиса листа, в который ВПГ-1 может проникать из базального слоя. Критической стадией является отделение эпидермиса от дермы путем диспаза II лечения, который, в зависимости от штамма мыши, должна быть адаптирована. Концентрация диспаза II может быть в диапазоне от 2,5 до 5 мг / мл, и времени инкубации от 20 до 45 мин. Окрашивание промежуточной нити белка кератина 14 легко позволяет прогнозировать ли базальная слой эпидермиса могут быть заражены, или он будет показывать только очень ограниченное число инфицированных клеток (рисунок 2). В идеале, кератин 14 окрашивание эпидермиса тотальных следует указать нетронутыми слой базальных клеток (рис 2А). В худшем случае, диспаза лечение II нарушается базальный слой и нет клеток, окрашенных в межфолликулярного эпидермиса, указывающие, что кератин 14-выражения базальных кератиноцитов диссоциируют (2В 16 (фиг.2В) , Только после снижения диспаза II до 2,5 мг / мл в течение 30 мин, интактный базальный слой получают в виде визуализировали окрашиванием кератина 14 (фиг.2с).
Из плотных волосяных фолликулов, как придатков эпидермиса, разделение эпидермиса от дермы наиболее удобно, когда кожа берется из хвостов взрослых мышей. Кроме того, еще кожа новорожденных мышей с разработкой волосяные фолликулы могут быть использованы, хотя хрупкость листов после инкубации ограничивает размер анализируемых областей. Пока нет разницы в эффективности ВПГ-1 инфекции не заметил в зависимости от ли эпидермис от новорожденных приняты или взрослых мышей (рисунок 3). Целые крепления новорожденнр-н эпидермис себе эффективную инфекцию межфолликулярного эпидермиса, а также из плотно упакованных клеток, выстилающих развивающимся волосяные фолликулы (рисунок 3). В то время как интерфолликулярной эпидермис взрослых эпидермиса, эффективно инфицированных, волосы микробы и только части внешних оболочек корневых волосяных фолликулов инфицированы (рисунок 3). Сальные железы В нижней волоса всегда окрашивали, который, однако, из-за неспецифической окрашивания вторичного антитела, как показано в неинфицированных управления (рисунок 3).
Использование ингибитора исследования мы исследовали, играет ли роль холестерина в ВПГ-1 вступления в эпидермисе. Эпидермиса листа взрослых мышей предварительно обрабатывали метил-бета-циклодекстрина (MβCD), который истощает холестерина из плазматической мембраны 17-19. Перед инфекции, MβCD удаляли несколько стадий промывки, чтобы избежать каких-либо разрушающих эффект на уровень холестерина в вирусной envelОПЕ. После предварительной обработки 20 мМ MβCD почти не инфицированные клетки были замечены либо в межфолликулярного эпидермис или волос микробов, но только неспецифическое окрашивание сальных желез была видна (4А). В качестве контроля, что ткань не была повреждена в результате обработки ингибитора, мы добавили 500 холестерина мкг / мл для пополнения MβCD обработанных листов эпидермальных (фиг.4А). Это лечение полностью восстановлен инфекционность демонстрируя, что предварительная обработка ингибитором не мешает жизнеспособности ткани.
Использование модели мыши мы касались участия nectin-1 и входа герпеса посредника (HVEM) в качестве клеточных рецепторов для ВПГ-1 в эпидермисе 10. Оба белка, как известно, выступают в качестве эффективных рецепторы HSV в различных клеточных линий 20,21, и они являются достаточными для развития болезни у мышей 22. Мы определили конкретные эпидермиса роли nectin-1 и HVEM в HSV-1 рецепторы 10. После плавающей эпидермиса листы из дикого типа, nectin-1- или HVEM-дефицитных мышей на вирус среде, содержащей целые крепления были подготовлены на 3 ч пи визуализировать количество зараженных клеток. Сравнение межфолликулярного epidermises показывает, что только nectin-1 дефицит резко сократили количество ICP0-экспрессирующих клеток (рис 4В). Кроме того, распространение вируса в довольно ограниченном в отсутствие nectin-1, как показано на криосрезах в 18 ч пи (Фиг.4С). Для количественного определения инфицированных клеток, важно контролировать ли число инфицированных клеток равномерно распределяется через эпидермис или межфолликулярного наблюдаются кластеры инфицированных клеток ли. В nectin-1-дефицитных эпидермиса например, эффективность инфекции изменяться с приблизительно 10% инфекции в некоторых районах и около 30% в других областях межфолликулярного эпидермиса 10. Таким образом, мы решили тО не дают число инфицированных клеток, чтобы продемонстрировать снижение инфекции, но нынешние тотальных как качественных данных.
Рисунок 1:. Визуализация инфицированных клеток эпидермиса в разделах или тотальных Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
В верхней части схемы, иллюстрирующей полных выборок взрослого кожи, эпидермальные участки после отделения от дермы, и эпидермальных тотальных с видимой поверхности базальной кератиноцитов слоя. Стрелка указывает на волосяной фолликул и звезды указывает интерфолликулярной эпидермис. Образцы кожи и эпидермиса листов, полученных из 3-недельных мышей инфицировали HSV-1 на уровне приблизительно 100 КОЕ / клетку и фиксируют в 1,5 или 3 ч пи образцы были stained анти-ICP0 (зеленый) после макет инфекции или в 1,5 или 3 ч пи визуализировать инфицированные клетки, и counterstaining ядер с DAPI (синий) демонстрирует все клетки в различных слоях. В качестве контроля, полные образцы кожи макет-инфицированных приведены в сравнении с образцами, инфицированных через 3 ч пи не демонстрирует не ICP0 окрашивание (левая часть). Мок-инфицированных или зараженных эпидермиса листа, приготовленные, как криосрезов показаны в средней части. Эпидермальные тотальных инфицированных в течение 1,5 ч или 3 показаны в правой части. Бар, 25 мкм (криосрезы), и 40 мкм (целые крепления).
Рисунок 2:. Кератин 14 окрашивание эпидермальных тотальных после инкубации с различными концентрациями диспаза II эпидермис от C57BL / 6 или B6.A2G-MX1 мышей был отделен от дермы с диспаза II. Эпидермальные тотальных окрашивали анти-keratiп 14 (красный) и DAPI с (синий). Эпидермиса листов инкубировали с 5 мг / мл (А, В) или 2,5 мг / мл (С) диспаза II в течение 30 мин при 37 ° С. Бар, 25 мкм. Сокращения:. Волосяной фолликул (ВЧ), интерфолликулярной эпидермис (IFE), сальной железы (SG) Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3:. Визуализация ICP0 выражения в тотальных новорожденных и взрослых эпидермиса Схемы, иллюстрирующие эпидермиса тотальных с волосяных фолликулов или развивающиеся волосяные фолликулы, показывая видимую поверхность базального слоя от взрослых и новорожденных epidermises, соответственно. Эпидермиса листов были инфицированы ВПГ-1 при температуре приблизительно 100 КОЕ / клетку, и тотальных окрашивалианти-ICP0 (зеленый) и DAPI с (синий) через 3 ч пи качестве контроля неинфицированных эпидермальные тотальных от взрослых хвостовой кожи были окрашены только с вторичным антителом демонстрируя неспецифическую окрашивание сальных желез. Бар, 25 мкм. Сокращения: разработка волосяной фолликул (DHF), волосяной фолликул (HF), интерфолликулярной эпидермис (IFE), сальных желез (SG). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4:. Оценка влияния клеточных факторов с использованием либо ингибитор MβCD или nectin-1- или HVEM-дефицитных epidermises (А) Эпидермальные листы из взрослых хвост кожи 3-недельных мышей WT (C57BL / 6), предварительно обрабатывали MβCD (20 мм) и инфицированных ВПГ-1 в прибли-счете 100 БОЕ / клетка. В качестве контроля, необработанные эпидермальные листов были инфицированы, и эпидермальные листов, предварительно обработанных 35 мМ MβCD обрабатывали 500 мкг / мл холестерина до заражения. Эпидермиса тотальных окрашивали анти-ICP0 (зеленый) и DAPI с (синий) через 3 ч пи, чтобы продемонстрировать число инфицированных клеток после истощения холестерина путем обработки MβCD. Как показано на рисунке 3, окрашивание сальных желез (SG) является неспецифическим. Сокращения: HF (волосяной фолликул), ИТС (интерфолликулярной эпидермис), SG (сальные железы). Бар, 150 мкм. (B) Взрослый хвост epidermises БТ (C57BL / 6), nectin-1- 23, или HVEM-дефицитных мышей 24 (1 месячного) были инфицированы приблизительно 100 КОЕ / клетку. Эпидермиса тотальных окрашивали анти-ICP0 (зеленый) и DAPI (синий) через 3 ч PI (C) криосрезах эпидермальных листов из мас (C57BL / 6) или nectin-1-дефицитных мышей 23 окрашивали в 18 ч пи ResULTS, показанные на (В) и (С) изменяются от ссылкой 10. В А, В и С конфокальных проекций и объединены изображения отображаются. Бар, 150 мкм (А) и 25 мкм (B, C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
При эпидермальные листы взрослого кожи от мышей C57BL / 6, инфицированных ВПГ-1 при температуре приблизительно 100 КОЕ / клетку, мы наблюдаем инфекции почти во всех клеток базального слоя в межфолликулярного эпидермиса, а более низкие доз вируса коррелируют с менее инфицированных клеток и медленнее Ход инфекции. В общем, волосяные фолликулы показывают переменное число инфицированных клеток; в то время как большинство относительно небольших кератиноцитов, выстилающих развивающимся волосяные фолликулы инфицированы, только зародыш волосы взрослого волосяного фолликула полностью заражен. В зависимости от того, как нежный разделение эпидермиса лечения диспаза II доходов, части волосяных фолликулов заблудиться. В большинстве случаев, слои кератиноцитов между сальных желез и эпидермиса межфолликулярного не хватает, и слой облицовки наружных коренных оболочки может быть нарушена. В любом случае, процедура разделения эпидермис от дермы и эффективности инфекции может варьироваться от одного штамма мыши к другому ( Взятые вместе, задача экс естественных инфекции анализе является подготовка и поддержание эпидермиса листов. Хрупкость ткани требует очень бережного обращения и контролирует, насколько хорошо ткань сохраняется после отделения от дермы. Еще одна проблема заключается в ограниченном жизнеспособность листов в культуре. Так жизнеспособность клеток уменьшается с течением времени, инфекции эксперименты должны быть выполнены немедленно или по крайней мере 3 ч после приготовления листов. В дополнение к мышиным кожи, эпидермальные листы могут быть также получены из коже или слизистой оболочке образцов человека. В зависимости от природы и толщины эпидермиса, то диспаза лечение должно быть приспособлено. Чтобы следовать курс инфекции, является наиболее подходящим для визуализации инфицированные клетки в криосрезов. Следует иметь в виду, что с высокой PFU / клетка и более длительное время инфекции, эпидермальные листов начать какой-то disintegraния. На основании цитопатического эффекта, клетки облавы и межклеточных контактов получить нарушается. К 24 ч пи с 100 КОЕ / клетку, некоторые инфицированные клетки могут базальные теряются, которые могут также зависеть от лечения диспаза II. С нижней КОЕ / клетку, раз инфекция может быть продлен, не приводя к серьезному повреждению тканей. Кроме того, степень повреждения может быть использован в качестве маркера, как патогенные различные штаммы вируса являются. Мы предпочитаем, чтобы визуализировать инфицированные клетки путем окрашивания выражение ICP0. Преимуществом является то, достаточно раннее обнаружение инфицированных клеток, и, на основе структуры окрашивающего ICP0, клетки на ранней стадии во время инфекции можно отличить от тех, на продвинутой стадии. Кроме того, инфицированные клетки могут быть визуализированы путем окрашивания экспрессию генов других ранних таких как вирусный капсид VP5 белка и вирусной GD оболочечного белка. Мы также попытались визуализировать входящие вирусные частицы до выражения вирусных генов либо от инфАЗДЕЛ с GFP-тегами ВПГ-1 или окрашиванием капсиды в основной образцов. По нашему опыту, картина GFP-флуоресценции или окрашивание картина в срезах тканей слишком сложны, чтобы четко продемонстрировать наличие интернализованных вирусных частиц. Кроме того, вирусные частицы могут быть визуализированы с помощью электронного микроскопа, когда высокие титры вируса в ~ 1,000 - 1,500 КОЕ / клетку используют. В случае более низкой дозе вируса, вирусные частицы могут быть практически не обнаружено. Вместо того, чтобы визуализировать инфицированные клетки у интактных эпидермальных листов, эпидермис может быть отделена, чтобы проанализировать уровни РНК или определить число клеток с поверхности, цитоплазматического или ядерного экспрессии интересующих генов путем анализа FACS. Мы предполагаем, что это исключая виво протокола инфекции могут быть адаптированы по крайней мере, в те вирусы, которые инфицируют базальных кератиноцитов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим Питера Staeheli для обеспечения мышей B6.A2G-MX1 и Semra Ozcelik за технической консультацией.
Эта работа была поддержана Немецкого исследовательского фонда через SFB829 и KN536 / 16, и Köln Фортуна Program / факультета медицины Университета Кельна.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/high glucose/GlutaMAX | Life Technologies | 31966047 | needed for cultivation of epidermal sheets |
| dispase II powder | Roche | 4942078001 | has to be solved in heated PBS |
| enzyme-free cell dissociation solution | Sigma | C5914 | needed for very gentle dissociation of epidermal sheets |
| TrypLE select cell dissociation solution | Life Technologies | 12563-029 | needed for dissociation of epidermal sheets |
| chelex 100 resin | Bio-Rad | 142-2832 | needed for chelation of polyvalent metal ions from the fetal calf serum |
| gelatin from cold water fish skin | Sigma | G7765 | needed for minimization of non-specific antibody binding |
| Keratin 14 Polyclonal Antibody (AF64) (conc.: 1 mg/ml) | Covance | PRB-155P | used to visualize the intermediate filament keratin 14 which is a marker of the basal layer of the epidermis |
| Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-11029 | used as secondary antibodies |
| Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate (conc.: 2 mg/ml) | Life Technologies | A-21429 | used as secondary antibodies |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI dihydrochloride) (conc.: 0.1 mg/ml) | Sigma | 36670 | used to counterstain the nucleus |
References
- Koelle, D. M., Corey, L. Herpes simplex: insights on pathogenesis and possible vaccines. Annu. Rev. Med. 59, 381-395 (2013).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J.
- Syrjänen, S., Mikola, H., Nykänen, M., Hukkanen, V. In vitro establishment of lytic and nonproductive infection by herpes simplex virus type 1 in three-dimensional keratinocyte culture. J. Virol. 70, 6524-6528 (1996).
- Visalli, R. J., Courtney, R. J., Meyers, C. Infection and replication of herpes simplex virus type 1 in an organotypic epithelial culture system. Virology. 230, 236-243 (1997).
- Hukkanen, V., Mikola, H., Nykänen, M., Syrjänen, S. Herpes simplex virus type 1 infection has two separate modes of spread in three-dimensional keratinocyte culture. J. Gen. Virol. 80, 2149-2155 (1999).
- Gescher, K., et al. Inhibition of viral adsorption and penetration by an aqueous extract from Rhododendron ferrugineum L. as antiviral principle against herpes simplex virus type-1. Antiviral Res. 82, 408-413 (2010).
- Petermann, P., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Impact of Rac1 and Cdc42 signaling during early herpes simplex virus type 1 infection of keratinocytes. J. Virol. 83, 9759-9772 (2009).
- Everett, R. D., Maul, G. G. HSV-1 IE protein Vmw110 causes redistribution of PML. EMBO J. 13, 5062-5069 (1994).
- Chrostek, A., et al. Rac1 is crucial for hair follicle integrity but is not essential for maintenance of the epidermis. Mol. Cell. Biol. 26, 6957-6970 (2006).
- Petermann, P., et al. Entry mechanisms of Herpes Simplex Virus Type 1 into murine epidermis: Involvement of nectin-1 and HVEM as cellular receptors. J. Virol. 89, 262-274 (2015).
- McGeoch, D. J., et al. The complete DNA sequence of the long unique region in the genome of herpes simplex virus type 1. J. Gen. Virol. 69, 1531-1574 (1988).
- Schelhaas, M., Jansen, M., Haase, I., Knebel-Mörsdorf, D. Herpes simplex virus type 1 exhibits a tropism for basal entry in polarized epithelial cells. J. Gen. Virol. 84, 2473-2484 (2003).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130, 5241-5255 (2003).
- Rahn, E., Petermann, P., Hsu, M. J., Rixon, F. J., Knebel-Mörsdorf, D. Entry pathways of herpes simplex virus type 1 into human keratinocytes are dynamin- and cholesterol-dependent. PLoS One. 6, e25464 (2011).
- Everett, R. D., Cross, A., Orr, A. A truncated form of herpes simplex virus type 1 immediate-early protein Vmw110 is expressed in a cell type dependent manner. Virology. 197, 751-756 (1993).
- Horisberger, M. A., Staeheli, P., Haller, O. Interferon induces a unique protein in mouse cells bearing a gene for resistance to influenza virus. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 80, 1910-1914 (1983).
- Christian, A. E., Haynes, M. P., Phillips, M. C. Use of cyclodextrins for manipulating cellular cholesterol content. J. Lipid Res. 38, 2264-2272 (1997).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects of cholesterol depletion by cyclodextrin on the sphingolipid microdomains of the plasma membrane. Biochem. J. 335, 433-440 (1998).
- Yancey, P. G., et al. Cellular cholesterol efflux mediated by cyclodextrins: Demonstration of kinetic pools and mechanism of efflux. J. Biol. Chem. 271, 16026-16034 (1996).
- Montgomery, R. I., Warner, M. S., Lum, B. J., Spear, P. G. Herpes simplex virus-1 entry into cells mediated by a novel member of the TNF/NGF receptor family. Cell. 87, 427-436 (1996).
- Geraghty, R. J., Krummenacher, C., Cohen, G. H., Eisenberg, R. J., Spear, P. G. Entry of alphaherpesviruses mediated by poliovirus receptor-related protein 1 and poliovirus receptor. Science. 280, 1618-1620 (1998).
- Taylor, J. M., Lin, E., Susmarski, N., Yoon, M., Zago, A., Ware, C. F., Pfeffer, K., Miyoshi, J., Takai, Y., Spear, P. G. Alternative entry receptors for herpes simplex virus and their roles in disease. Cell Host Microbe. 2, 19-28 (2007).
- Barron, M. J., Brookes, S. J., Draper, C. E., Garrod, D., Kirkham, J., Shore, R. C. The cell adhesion molecule nectin-1 is critical for normal enamel formation in mice. Hum. Mol. Genet. 17, 3509-3520 (2008).
- Wang, Y., Subudhi, S. K., Anders, R. A., Lo, J., Sun, Y., Blink, S., Wang, Y., Liu, X., Mink, K., Degrandi, D., Pfeffer, K., Fu, Y. X. The role of herpesvirus entry mediator as a negative regulator of T cell-mediated responses. J. Clin. Invest. 115, 711-717 (2005).
