Inter-cellulär kommunikation är avgörande för att styra olika fysiologiska aktiviteter inom och utanför cellen. Detta dokument beskriver ett protokoll för att mäta spatiotemporala karaktär encelliga sekret. För att uppnå detta är ett tvärvetenskapligt angreppssätt som används som integrerar etikett fria nanoplasmonic avkänning med levande cell imaging.
Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.
Inter-cellulär kommunikation är avgörande för regleringen av många fysiologiska aktiviteter både inom och utanför cellen. En mängd olika proteiner och vesiklar kan utsöndras som därefter utlösa komplexa cellulära processer såsom differentiering, sårläkning, immunsvar, migration och proliferation. 1-5 Störningar på inter cellulära signaleringsvägar har varit inblandade i många störningar, inklusive cancer, ateroskleros och diabetes, för att nämna några.
Den optimala cellsekre analys bör kunna rumsligt och tidsmässigt kartlägga utsöndrade proteinet av intresse utan att störa de relevanta signalvägar. På detta sätt kan man sluta sig orsakssamband mellan de koncentrationsprofiler och responsen hos de mottagande cellerna. Tyvärr har många av de vanligaste fluorescerande baserade tekniker inte uppfyller dessa kriterier. Fluorescerande fusionsproteiner kan användas för att märka analyten wnom cellen men kan störa den sekretoriska vägen, eller om utsöndras, resulterar i en diffus glöd utanför cellen som är svår att kvantifiera. Fluorescerande immunosandwich baserade analyser är de mest vanligen använda tekniker för att detektera cellulära sekret men vanligtvis kräver isolering av enskilda celler. 6-11 Dessutom stoppar eller avslutar experimentet och storleken av etiketterna antikropps införandet av den avkännande-antikropp typiskt, 150 kDa för IgG, är ett hinder för nedströms signalering.
På grund av dessa hinder är det föredraget att en etikett-fri teknik utnyttjas för att bildprotein sekret och bland befintliga etikettfria tekniker, ytplasmonresonans (SPR) och lokaliserade ytplasmonresonans (LSPR) sensorer är utmärkta kandidater. 12-17 Dessa sensorer har använts i stor utsträckning för analytbindningsstudier av proteiner, exosomes och andra biomarkörer. 18-24 I fallet LSPR, den plasmoniska nanostructures kan mönstras litografiskt på glastäck och glada med hjälp av synligt ljus via standard brett fält mikroskopi konfigurationer. På grund av deras nanoskala fotavtryck, är tillgänglig för vanliga avbildningstekniker såsom ljusfält och fluorescensmikroskopi gör dessa sönder väl lämpad för integration med live-cell mikroskopi majoriteten av glassubstratet. 25-28 Vi har visat realtidsmätning av sekret antikropps från hybridomceller med användning av funktionaliserade guld plasmoniska nanostrukturer med rumsliga och tids resolutioner av 225 ms och 10 pm, respektive. Grundchipskonfiguration som är avbildad i Figur 1. 28 Utsignalen Ijusväg av mikroskopet är uppdelad mellan en CCD-kamera som används för bildspråk och ett fiber optiskt kopplad spektrometer för kvantitativ bestämning av fraktionerad beläggning av en given uppsättning av nanostrukturer (figur 2 ).
Den protocol som presenteras i detta dokument beskriver den experimentella designen för realtidsmätning av encelliga sekret samtidigt övervaka cellernas respons med hjälp av standard ljusa fält mikroskopi. Den tvärvetenskapliga strategi omfattar tillverkning av nanostrukturer, funktionalisering av de nanostrukturer för högaffinitetsbindning av analyter, yta optimering för både minimera icke-specifik bindning och karakterisera kinetiska konstanter med användning av en kommersiell (Surface Plasmon Resonance, SPR) instrument, integrering av cellinjer på substratet, och en analys av bilder och spektraldata. Vi räknar med denna teknik för att vara en möjliggörande teknik för spatiotemporala kartläggning av cell sekret och deras orsakssamband med mottagande celler.
The LSPR imaging technique described in this work has numerous advantages over more traditional methodologies for detecting cell secretions. First, the time resolution of our technique is on the order of seconds whereas the commercial alternative, an immunosandwhich assay known as EliSpot, has a typical time resolution of 2 to 3 days.7,32 As a result we were able to resolve sudden changes in the rate of protein secretion, such as that shown in Figure 6. Second, having arrays distributed over the chip allows for the secreted signal to be tracked in space and time which enables more rigorous comparisons to diffusion-based models of cell secretion. In addition, arrays like the control array shown in Figure 6 can be used to subtract out global changes in the image that typically arise from instrumental factors such as focus drift. Third, our technique requires no modification of the cells. If desired, the experiment can incorporate commonly used tags such as fluorescent proteins, but if there is concern that such tags may negatively affect cell viability or homeostasis the label-free nature of our approach does not require them. Fourth, using the spectroscopic data we have demonstrated that quantitative information regarding the fractional occupancy of surface bound ligands can be calculated.
There are numerous alternative methods to EBL for fabricating metallic nanoparticles. However, we have found that the EBL provides considerable flexibility for optimizing nanostructure and array dimensions to best suit the optics and the cells under investigation. Also critical is the fact that the chips can be readily regenerated by plasma ashing. In this way, a typical chip can be used dozens of times. Biofunctionalization details must be modified for the specific application. The protocol presented here conjugated the surface with relatively small c-myc peptide ligands. Larger ligands such as whole antibodies typically require more spacing and thus a higher SPO to SPN/SPC ratio. Regardless, a well formed SAM layer is essential for preventing non-specific binding in live-cell experiments. In general, larger molecular weight analytes are more readily detected by LSPR. Thus, in its single-cell manifestation, this technique may not be appropriate for detecting the secretion of small proteins, such as cytokines.
The current setup has been used for studying individual non-adherent cells. There are significant number of secreted signaling proteins and vesicles to which the results reported in this work are directly applicable. For example carcinoembryonic antigen (CEA) which for decades now has been a diagnostic marker for cancer. Colon cancer cells are known to secrete CEA at the rates of thousands of molecules/cell/hr and the molecular weight is 180 kDa which exceeds that of IgG antibodies. CEA is believed to be involved in autocrine and paracrine signaling pathways but the spatio-temporal nature of these secretions have never been measured. Our technique can directly address these signaling questions. An extension of this work will be to measure the spatio-temporal nature of CEA secretion from single cells.33 Future work will also focus on integrating LSPRi with two and three dimensional cell cultures of adherent cells. By incorporating multiplexed arrays capable of detecting a number of secreted proteins in parallel, this technique has the potential to open a new window into cell secretions and how they influence neighboring cells.
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
25mm diameter glass coverslips | Bioscience Tools | CSHP-No1.5-25 | 170±5 µm is optimal |
Poly-methyl methacrylate | Microchem | PMMA 950 A4 | |
Ethyl lactate methyl metacrylate | Microchem | MMA EL6 | |
Electron beam evaporator | Temescal | FC-2000 | |
Electron beam lithography | Raith | Series 150 | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459836 | |
Acetone | Sigma-Aldrich | 320110 | |
CR-7 chromium etchant | Cyantek | CR-7 | |
Scanning electron microscope | Zeiss | Ultra 55 | |
Atomic force microscope | Veeco | Nanoscope III | |
Plasma ashing system | Technics | Series 85 RIE | |
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) | Prochimia | TH 001-m8.n3-0.2 | |
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) | Prochimia | TH 003m11n3-0.1 | |
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) | Prochimia | TH 002-m11.n3-0.2 | |
Surface plasmon resonance system | Biorad | XPR36 | |
Bare gold chip | Biorad | GLC chip | Plasma ashed to remove the monolayer |
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide | Thermo | 22980 | |
N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo | 24510 | |
Pentylamine-Biotin | Thermo | 21345 | |
Ethanolamine | Sigma-Aldrich | E9508 | |
Neutraavidin | Thermo | 31000 | |
Phosphate buffered saline | Thermo | 28374 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
Inverted microscope | Zeiss | Axio Observer | Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH |
CCD camera | Hamamatsu | Orca R2 | Thermoelectrically cooled (16 bit) |
Spectrometer | Ocean Optics | QE65Pro | |
Spectrasuite | Ocean Optics | version1.4 | |
c-myc peptide HyNic Tag | Solulink | SP-E003 | |
monoclonal anti-c-myc antibody | Sigma-Aldrich | M4439 | |
Hybridoma cell line | ATCC | CRL-1729 | |
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) | Sigma-Aldrich | A5955 | |
Serum free media RPMI 1640 | Invitrogen | 11835-030 | |
Fetal bovine serum | ATCC | 30-2020 | |
Rhodamine DHPE | Life Technologies | L-1392 |