Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

En etikett-fri teknik för spatiotemporala avbildning av en enda cell Secretions

doi: 10.3791/53120 Published: November 23, 2015

Summary

Inter-cellulär kommunikation är avgörande för att styra olika fysiologiska aktiviteter inom och utanför cellen. Detta dokument beskriver ett protokoll för att mäta spatiotemporala karaktär encelliga sekret. För att uppnå detta är ett tvärvetenskapligt angreppssätt som används som integrerar etikett fria nanoplasmonic avkänning med levande cell imaging.

Introduction

Inter-cellulär kommunikation är avgörande för regleringen av många fysiologiska aktiviteter både inom och utanför cellen. En mängd olika proteiner och vesiklar kan utsöndras som därefter utlösa komplexa cellulära processer såsom differentiering, sårläkning, immunsvar, migration och proliferation. 1-5 Störningar på inter cellulära signaleringsvägar har varit inblandade i många störningar, inklusive cancer, ateroskleros och diabetes, för att nämna några.

Den optimala cellsekre analys bör kunna rumsligt och tidsmässigt kartlägga utsöndrade proteinet av intresse utan att störa de relevanta signalvägar. På detta sätt kan man sluta sig orsakssamband mellan de koncentrationsprofiler och responsen hos de mottagande cellerna. Tyvärr har många av de vanligaste fluorescerande baserade tekniker inte uppfyller dessa kriterier. Fluorescerande fusionsproteiner kan användas för att märka analyten wnom cellen men kan störa den sekretoriska vägen, eller om utsöndras, resulterar i en diffus glöd utanför cellen som är svår att kvantifiera. Fluorescerande immunosandwich baserade analyser är de mest vanligen använda tekniker för att detektera cellulära sekret men vanligtvis kräver isolering av enskilda celler. 6-11 Dessutom stoppar eller avslutar experimentet och storleken av etiketterna antikropps införandet av den avkännande-antikropp typiskt, 150 kDa för IgG, är ett hinder för nedströms signalering.

På grund av dessa hinder är det föredraget att en etikett-fri teknik utnyttjas för att bildprotein sekret och bland befintliga etikettfria tekniker, ytplasmonresonans (SPR) och lokaliserade ytplasmonresonans (LSPR) sensorer är utmärkta kandidater. 12-17 Dessa sensorer har använts i stor utsträckning för analytbindningsstudier av proteiner, exosomes och andra biomarkörer. 18-24 I fallet LSPR, den plasmoniska nanostructures kan mönstras litografiskt på glastäck och glada med hjälp av synligt ljus via standard brett fält mikroskopi konfigurationer. På grund av deras nanoskala fotavtryck, är tillgänglig för vanliga avbildningstekniker såsom ljusfält och fluorescensmikroskopi gör dessa sönder väl lämpad för integration med live-cell mikroskopi majoriteten av glassubstratet. 25-28 Vi har visat realtidsmätning av sekret antikropps från hybridomceller med användning av funktionaliserade guld plasmoniska nanostrukturer med rumsliga och tids resolutioner av 225 ms och 10 pm, respektive. Grundchipskonfiguration som är avbildad i Figur 1. 28 Utsignalen Ijusväg av mikroskopet är uppdelad mellan en CCD-kamera som används för bildspråk och ett fiber optiskt kopplad spektrometer för kvantitativ bestämning av fraktionerad beläggning av en given uppsättning av nanostrukturer (figur 2 ).

Den protocol som presenteras i detta dokument beskriver den experimentella designen för realtidsmätning av encelliga sekret samtidigt övervaka cellernas respons med hjälp av standard ljusa fält mikroskopi. Den tvärvetenskapliga strategi omfattar tillverkning av nanostrukturer, funktionalisering av de nanostrukturer för högaffinitetsbindning av analyter, yta optimering för både minimera icke-specifik bindning och karakterisera kinetiska konstanter med användning av en kommersiell (Surface Plasmon Resonance, SPR) instrument, integrering av cellinjer på substratet, och en analys av bilder och spektraldata. Vi räknar med denna teknik för att vara en möjliggörande teknik för spatiotemporala kartläggning av cell sekret och deras orsakssamband med mottagande celler.

Protocol

1. nanostruktur Fabrication

  1. Välj 25 mm diameter glastäck med en ungefärlig tjocklek på 170 fim (1,5 No.) som substrat för nanofabrikation.
  2. Doppa täckglas i Piranha-lösning (3: 1 förhållande av svavelsyra och väteperoxid) i minst 6 timmar. Tvätta piraya indränkt täck med rikligt med ultrarent 18,2 Mohm avjoniserat destillerat vatten (DDW).
    VARNING: Piranha syra reagerar häftigt med organiska material och måste hanteras med stor försiktighet.
  3. Deposition 10 nm krom tunn film på täck via e-stråleförångning att undvika laddningseffekter under mönstringen och avbildning av nanostrukturer.
  4. Snurra det första lagret av dubbelskikt resist bestående av etyllaktat metylmetakrylat (MMA_EL6) sampolymer vid 2000 rpm under 45 sekunder och sedan baka vid 150 ° C. Snurra andra skikt av poly-metylmetakrylat (950PMMA_A2) vid 3000 rpm under 45 sek sedan baka vid 180 ° C.
  5. Smattran dubbelskiktet motstå använda elektronstrålelitografi (EBL) vid 25 kV med en dos av 300 iC / cm2 område. Utvecklas i isopropylalkohol (IPA) / metylisobutylketon (MIBK): 2/1 och skölj i IPA.
  6. Värde Ti (5 nm) / Au (80 nm) film på substratet med hjälp av en e-balk förångare.
  7. Efter guldavsättning, lyft av sampolymeren dubbelskiktet motstå genom blötläggning av substratet i aceton under 4 h.
  8. Kontrollera underlaget med hjälp av svepelektronmikroskop (SEM) för att bekräfta nanostrukturer form och storlek, ta bort kvarvarande krom från substratet via våtetsning med hjälp av CR-7 etsmedel under 60 sekunder vid RT och skölj sedan i DDW.
  9. Designa ett centrum till centrum array avstånd av 33 pm att lämna utrymme för cell imaging mellan matriser. Mönster de nanostrukturer i 20 x 20 mönster för varje grupp med en stigning på 300 nm med hjälp av en e-balk författare. Varje chip innehåller 300 celler med en typisk nanostrukturer dimension av 80 ± 2,5 nm höjd och 70 ± 2,5 nm DiameTer.
  10. Inspektera en delmängd av matriser med hjälp av atomkraftsmikroskop (AFM) för verifiering av storlek och enhetlighet.
  11. Fäst en stödring, typiskt kisel, till baksidan av täckglas med användning av en UV-härdande epoxi.

2. Chip Rengöring och tillämpning av självmonterade monolager

  1. För rengöring och regenerering av flis, plasma aska vid en effekt av 40 W i en 300 mTorr blandning av 5% väte, 95% argon under 45 sekunder efter rengöring kammaren under 5 minuter under samma förhållanden.
  2. Funktionalisera guldnanostrukturer omedelbart efter plasmaföraskning genom nedsänkning av chipset i en två-komponent etanolisk tiol lösning bestående av en 3: 1 förhållande av SH- (CH2) 8 -EG 3 -OH (SPO) och en komponent med antingen en amin eller karboxylfunktionell grupp, nämligen SH (CH 2) 11 -EG 3 NH2 (SPN) eller SH (CH 2) 11 -EG 3 -COOH (SPC).
  3. Låt chip-In tiol lösningen O / N för att bilda en själv monterade monolager (SAM).
  4. Skölj chip med etanol och torr med kvävgas.
  5. Om det behövs, lagrar den funktion chip för upp till 2 veckor vid 4 ° C.
  6. När du är redo för användning reagerar SPN eller SPC komponent med liganden med hjälp av en kemi beroende på liganden val (se nedan).
    Obs: Flisen kan regenereras och återfunktiondussintals gånger. En given chip kan användas för perioder som sträcker sig från 6 månader till över ett år. Spektra mätt på en given uppsättning tillförlitligt reproduceras efter upprepade regenere efter plasmaföraskning, följt av biofunctionalization. 29

3. ytfunktionalisering och Kinetic Characterization

Notera: Använd den funktionaliserade chip i den kommersiella SPR instrumentet för att karaktärisera de kinetiska hastighetskonstanter mellan liganden och analyten, liksom för att studera motståndet hos SAM till ospecifik binding. Det finns ett brett område av flödeshastigheter och mikrofluid mönster som möjliggör effektiv ytfunktionalisering. Eftersom vi har en kommersiellt tillgänglig SPR vi standardiserade runt sin rekommenderade flödeshastigheter. Vi noterar att dessa flöden är typiska för alla SPR instrument och så är inte begränsande. SPR instrumentet är inte en nödvändighet eftersom alla funktionalisering kan göras direkt på LSPR chip, men det gjorde minska vår arbetsbelastning, eftersom det är en multiplex instrument medan vår LSPR mikroflödes installationen inte.

  1. Funktionalisera en kommersiell nakna guld chip med SAM som beskrivs i avsnitt 2.
  2. Om användning av en SPC baserad SAM, aktivera karboxylgruppen med en 1: 1 blandning av 133 mM 1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) och 33 mM av N-hydroxisuccinimid (NHS) i DDW för 10 min.
  3. Konjugera den aktiverade karboxylgruppen med antikropp / ligand av intresse för 300 s med användning av en flödeshastighet av 30 ul / min. Förbered liganderna ipH 6-fosfatbuffert, typiskt, men detta kan variera beroende på molekylen.
  4. Efter liganden konjugering, flöde 0,1 M etanolamin i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som en deaktivator steg för 300 s vid en hastighet av 30 ul / min. Etanolamin hjälper till att minimera den icke-specifika bindningen.
  5. Introducera analyten av intresse vid en flödeshastighet av 100 | j, l / min med användning av ett intervall av koncentrationer och beräkna de kinetiska hastighetskonstanter med användning av en kinetisk analysmjukvara.
  6. Om icke-specifik bindning är problematiskt, öka förhållandet av SPO till SPC eller SPN.

4. LSPR Allmänna inställningar

  1. Mikroskop inställningar:
    1. Använd en 100 W halogenlampa Koehler belysa provet. Använd en långpassfilter (typiskt 593 nm cutoff) i ljusbanan för att eliminera våglängder som inte bidrar till resonans shift (Figur 2).
    2. För insamlingen av LSPRi uppgifter, använda ett inverterat mikroskop med en 40x olja immersion mål (1,4 NA) och en termoelektriskt kyld 16 bit CCD-kamera.
    3. Placera en stråldelare vid utgångsporten hos mikroskopet för att erhålla bildspråk och spektra samtidigt.
    4. Ställ in temperaturstyrd mikroskop scenen till 37 ° C och jämvikt under 4 timmar.
    5. Införliva en ytterligare inkubation enheten på mikroskop för att reglera CO 2 koncentration och luftfuktighet på 5% och 95%, respektive.
  2. Chip förberedelse och montering:
    1. Funktionalisera LSPR chip som beskrivs i avsnitt 2 med de optimala två-komponent SAM förhållanden bestäms från SPR experiment.
    2. Ladda chipet inom en skräddarsydd mikroflödes hållare på följande sätt. Placera marker på en aluminiumbottenstycket. Sandwich chip mellan denna bottenstycket och en silikonpackning och en klar plast toppstycke. Använd 4 skruvar för att spänna fast montering.
    3. För en typisk SPC-baserad tiol applikation, släpp kappa 300 | il en 1: 1 blandningning av 133 mM EDC och 33 mM NHS i DDW att aktivera karboxylgrupperna av produktresumén tiol komponenten.
    4. Vänta 10 minuter och skölj ytan manuellt med 10 mM PBS.
    5. Konjugera den aktiverade karboxylgruppen med liganden (typiskt en antikropp eller antikroppsfragment) av intresse för droppe beläggning 300 pl ligandlösning.
    6. Vänta 30 minuter och skölj manuellt med 10 mM PBS.
    7. Drop coat 300 il 0,1 M etanolamin i PBS på chip för att minimera ospecifik bindning. Vänta 10 min.
    8. Tvätta etanolamin med PBS innehållande 0,005% Tween 20 (PBS-T20).
    9. Placera en kvarts bit ovanför chip för att minska svängningarna i de uppgifter som rör en föränderlig menisk.
    10. Håll chip våt med PBS-T20 buffert medan montering på mikroskop.
    11. Placera LSPR chip enheten ordentligt i den uppvärmda scenen provhållaren och fäst mikroflödes slang.
    12. Fäst mikrofluidik slangen till samlings- och flödes buffer (eller serum fria medier för cellstudier) tills ett stabilt tillstånd uppnås.
    13. Låt montering och mikroskop för att stabilisera sig i minst 2 timmar.
    14. Rikta chipet med användning av joysticken så att den centrala uppsättningen är i linje med den fiberoptiska för spektroskopi. Spektroskopiska data är tagen med en spektrometer och spektralanalys programvara.
    15. Håll arrayer i fokus under hela försöket med hjälp av programvara autofokus, Zeiss Definite Focus eller motsvarande autofokus enhet.

5. LSPR Imaging av anti-c-myc Sekret från 9E10 hybridomceller

Obs: Den hybridomcellinje användes för denna studie uttrycker anti c-myc-antikropp konstitutivt och därför inte kräver en kemisk utlösare

  1. Funktionalisera de nanostrukturer med c-myc-peptid. Detta har ett K D-värde av 1,77 nM för de anti c-myc-antikroppar som utsöndras av klon 9E10 hybridomceller.
  2. Kultur hybridomcellerna i complete odlingsmedium med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% antibiotika i en T75 kolv vid 37 ° C under 5% CO2. Upprätthålla en celltäthet på 4 x 10 5 celler / ml.
  3. För cellutsöndringsstudier, pellets celler från T75-flaska genom centrifugering, tvättas två gånger med RPMI-1640 serumfritt medium (SFM) för att avlägsna de utsöndrade antikropparna och justera celldensiteten till 4 x 10 6 celler / ml.
  4. Skörda cellerna och testa för lönsamhet innan de förs vidare till LSPR chips.
  5. Tillsätt 50 pl av cellösningen manuellt på de LSPR chips med en mikropipett. Efter några minuter 25 till 50 celler vidhäfta till ytan av de LSPR marker.
  6. Tvätta bort de återstående cellerna i lösning med färskt SFM med hjälp av mikroflödes perfusionssystemet.
  7. Välj LSPR matriser för avbildning som är nära, inom 10 pm, men inte överlappar med cellerna.
  8. För att säkerställa att signalen är specifik för den utsöndrade anti c-myc AntibOdies införa cellodlingsmediet med och utan antikroppar närvarande samt med antikropparna, men med deras bindningsställen blockeras genom närvaron av en mättande koncentration av c-myc-peptid i lösning.
  9. Kalibrera sensorerna vid slutet av varje körning med en mättande lösning av anti-c-myc-antikroppar (250 nM). Detta hjälper till att normalisera gensvaret hos sensorerna och bestämma fraktionerad beläggning baserad på biofunctionalization profilen för varje körning.
  10. Korrigera drift i X- och Y-riktningen med hjälp av bildjustering programvara.

Representative Results

I en typisk levande cell sekre studie finns flera lägen för datainsamling sker. Figur 3 visar en överlagring av en LSPRi bild, som belyser de fyrkantiga arrayer och en överförd belysta bild som belyser cellen vid nedre vänstra. Data typiskt in under en 3-timmarsperiod följt av införandet av en mättande lösning av analyten för normalisering beräkning som beskrivs nedan. Fluorescens bilder kan också integreras i datainsamlings rutin genom den automatiska omkopplingen av en filter kub. I figur 4 en cell färgas med fluorescerande membran färgämnet rodamin DHPE uppvisar lamellipodia liknande förlängningar (pilar). Om sådana förlängningar skulle överlappa med uppsättningarna de skulle ge ett falskt-positivt för proteinutsöndring. Att ha flera typer av bilder kan hjälpa till att identifiera sådana händelser.

Figur 5 visar spektrometridata före och akterER de införandet av en mättlösning (400 nM) av kommersiellt köpt anti-c-myc-antikroppar till C-myc-funktionaliserade matriser. Inga celler var närvarande i detta experiment. Spektrat visar både en rödförskjutning och en ökning i intensitet. Skillnaden mellan areorna under de två kurvorna resulterar i en ökning i arrayen bildintensiteten i LSPRi läge på CCD-kameran. En icke-linjär minsta kvadratdataanalys tillvägagångssätt har utvecklats för att sluta fraktionerad beläggning av ytbundna ligander från spektra. 30,31

Vid slutet av experimentet, de mättade intensitetsvärdena (dvs fraktionerad beläggning ≈ 1) används för att beräkna en normaliserad respons för varje grupp enligt följande formel:

Var är den normaliserade intensiteten vid tidpunkt t, initial intensitet vid början av experimentet, slutliga mättad intensitet, och uppmätt intensitet av arrayen vid tidpunkt t

Normaliserade värden från två matriser visas i figur 6. En matris var inom 10 ^ m för cellen under undersökning, medan den andra, som användes som kontroll, var ett avstånd av 130 um från cellen. Den plötsliga ökningen av det normaliserade svaret hos matrisen närmast cell förhållande till den jämna svaret hos styr array är indikativ för en lokaliserad skur av utsöndrade antikroppar.

Figur 1
Figur 1. Sensor design. En ritning som avbildar geometrin hos en typisk levande cell sekre experimentet. Cellen (blå sfäroid) är avsatt på den LSPR chip som innehåller matriser av biofunctionalized guldnanostrukturer. I zoomat in vy, cell utsöndring av intresse, i detta fall antikroppar visas som Y-formade molekyler, mäts som de binder till ytanav de funktionaliserade nanostrukturer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Optisk Setup. Den upplysta ljuset från en halogenlampa först filtreras genom en lång passfilter (LP). Ljuset är linjärt polariserat (P1) och belyser provet via en 40X / 1.4 NA mål. Det spridda ljuset samlas av målet och får passera genom en korsade polarisationsfilter (P2). En 50/50 stråldelare (BS) sätts in i samlas ljusstrålen för samtidig spektroskopiska och bildanalyser. Överst till höger:. En atomkraftsmikroskopi bild av 9 enskilda nanostrukturer åtskilda av en delning av 300 nm Klicka häratt se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Levande cell LSPRi Study. En sammanfogad transmitterat ljus och LSPRi bild som visar en enda hybridomcellinje (nere till vänster) som omges av 12 matriser. Detta är en kontrastförstärkt bild. Skala bar är 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4
Figur 4. Levande cell Fluorescens Study. En fluorescerande falsk färgbild av en enda hybridomcell färgas med rodamin DHPE, vilket är en membran färgämne. I fluorescerande bildläget uppsättningarna är i allmänhet inte syns, men kan observeras en närliggande array här som absaknar torget i det nedre högra hörnet. Cellen kan ses skiljas från gruppen även tentakel-liknande tillägg (möjligen filopodia eller lamellipodia) sträcker sig utåt från cellerna (pilar). Skala bar är 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5
Figur 5. Spectral Modalitet. Spektra erhålles från en c-myc-funktionaliserad matris före och efter införandet av 400 nM lösning av anti-c-myc-antikroppar. Inga celler var närvarande i denna studie. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 6 Figur 6. Single Cell Sekre. Svaret från en grupp som ligger inom 15 pm av en enda cell och en ligger 130 um bort (Control). Skala bar är 10 mikrometer. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm diameter glass coverslips Bioscience Tools  CSHP-No1.5-25   170±5 µm is optimal
Poly-methyl methacrylate Microchem PMMA 950 A4
Ethyl lactate methyl metacrylate Microchem MMA EL6
Electron beam evaporator Temescal FC-2000
Electron beam lithography Raith Series 150
Ethanol Sigma-Aldrich 459836
Acetone Sigma-Aldrich 320110
CR-7 chromium etchant Cyantek CR-7
Scanning electron microscope Zeiss Ultra 55
Atomic force microscope Veeco Nanoscope III
Plasma ashing system Technics Series 85 RIE
SH-(CH2)8-EG3-OH (SPO) Prochimia TH 001-m8.n3-0.2
SH-(CH2)11-EG3-COOH (SPC) Prochimia TH 003m11n3-0.1
SH-(CH2)11-EG3-NH2 (SPN) Prochimia TH 002-m11.n3-0.2
Surface plasmon resonance system Biorad XPR36
Bare gold chip Biorad GLC chip Plasma ashed to remove the monolayer
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide Thermo 22980
N-hydroxysuccinimide (NHS) Thermo 24510
Pentylamine-Biotin      Thermo 21345
Ethanolamine Sigma-Aldrich E9508
Neutraavidin Thermo 31000
Phosphate buffered saline Thermo 28374
Tween 20 Sigma-Aldrich P2287
Inverted microscope Zeiss Axio Observer Microscope is equipped with 40X oil immersion objective; CO2 and humidity incubation from Pecon GmbH
CCD camera Hamamatsu Orca R2 Thermoelectrically cooled (16 bit)
Spectrometer Ocean Optics QE65Pro
Spectrasuite Ocean Optics version1.4
c-myc peptide HyNic Tag Solulink SP-E003
monoclonal anti-c-myc antibody Sigma-Aldrich M4439
Hybridoma cell line ATCC CRL-1729
Antibiotic Antimycotic Solution (100×) Sigma-Aldrich A5955
Serum free media RPMI 1640  Invitrogen  11835-030 
Fetal bovine serum ATCC 30-2020
Rhodamine DHPE Life Technologies L-1392

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ludwig, A. -K., Giebel, B. Exosomes: Small vesicles participating in intercellular communication. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 44, 11-15 (2012).
  2. Friedl, P., Gilmour, D. Collective cell migration in morphogenesis, regeneration and cancer. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 10, 445-457 (2009).
  3. Letterio, J. J., Roberts, A. B. Regulation of immune responses by TGF-beta. Annual Review of Immunology. 16, 137-161 (1998).
  4. Werner, S., Grose, R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiological Reviews. 83, 835-870 (2003).
  5. Werner, S., Krieg, T., Smola, H. Keratinocyte-fibroblast interactions in wound healing. Journal of Investigative Dermatology. 127, 998-1008 (2007).
  6. Bailey, R. C., Kwong, G. A., Radu, C. G., Witte, O. N., Heath, J. R. DNA-encoded antibody libraries: A unified platform for multiplexed cell sorting and detection of genes and proteins. Journal of the American Chemical Society. 129, 1959-1967 (2007).
  7. Gazagne, A., et al. A Fluorospot assay to detect single T lymphocytes simultaneously producing multiple cytokines. Journal of Immunological Methods. 283, 91-98 (2003).
  8. Han, Q., et al. Polyfunctional responses by human T cells result from sequential release of cytokines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1607-1612 (2012).
  9. Han, Q., Bradshaw, E. M., Nilsson, B., Hafler, D. A., Love, J. C. Multidimensional analysis of the frequencies and rates of cytokine secretion from single cells by quantitative microengraving. Lab on a Chip. 10, 1391-1400 (2010).
  10. Ma, C., et al. A clinical microchip for evaluation of single immune cells reveals high functional heterogeneity in phenotypically similar T cells. Nature Medicine. 17, 738-743 (2011).
  11. Shirasaki, Y., et al. Real-time single-cell imaging of protein secretion. Scientific Reports. 4, (2014).
  12. Milgram, S., et al. On chip real time monitoring of B-cells hybridoma secretion of immunoglobulin. Biosensors and Bioelectronics. 26, 2728-2732 (2011).
  13. Abbas, A., Linman, M. J., Cheng, Q. A. New trends in instrumental design for surface plasmon resonance-based biosensors. Biosensors & Bioelectronics. 26, 1815-1824 (2011).
  14. Ermakova, A., et al. Detection of a Few Metallo-Protein Molecules Using Color Centers in Nanodiamonds. Nano Letters. 13, 3305-3309 (2013).
  15. Haes, A. J., Van Duyne, R. P. A nanoscale optical blosensor: Sensitivity and selectivity of an approach based on the localized surface plasmon resonance spectroscopy of triangular silver nanoparticles. Journal of the American Chemical Society. 124, 10596-10604 (2002).
  16. Horowitz, V. R., Aleman, B. J., Christle, D. J., Cleland, A. N., Awschalom, D. D. Electron spin resonance of nitrogen-vacancy centers in optically trapped nanodiamonds. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 13493-13497 (2012).
  17. Sepulveda, B., Angelome, P. C., Lechuga, L. M., Liz-Marzan, L. M. LSPR-based nanobiosensors. Nano Today. 4, 244-251 (2009).
  18. Barbillon, G., et al. Biological and chemical gold nanosensors based on localized surface plasmon resonance. Gold Bulletin. 40, 240-244 (2007).
  19. Endo, T., et al. Multiple label-free detection of antigen-antibody reaction using localized surface plasmon resonance-based core-shell structured nanoparticle layer nanochip. Analytical Chemistry. 78, 6465-6475 (2006).
  20. Endo, T., Kerman, K., Nagatani, N., Takamura, Y., Tamiya, E. Label-free detection of peptide nucleic acid-DNA hybridization using localized surface plasmon resonance based optical biosensor. Analytical Chemistry. 77, 6976-6984 (2005).
  21. Haes, A. J., Hall, W. P., Chang, L., Klein, W. L., Van Duyne, R. P. A localized surface plasmon resonance biosensor: First steps toward an assay for Alzheimer's disease. Nano Letters. 4, 1029-1034 (2004).
  22. Jonsson, M. P., Jonsson, P., Dahlin, A. B., Hook, F. Supported lipid bilayer formation and lipid-membrane-mediated biorecognition reactions studied with a new nanoplasmonic sensor template. Nano Letters. 7, 3462-3468 (2007).
  23. Park, J. H., et al. A regeneratable, label-free, localized surface plasmon resonance (LSPR) aptasensor for the detection of ochratoxin A. Biosensors & Bioelectronics. 59, 321-327 (2014).
  24. Mayer, K. M., Hao, F., Lee, S., Nordlander, P., Hafner, J. H. A single molecule immunoassay by localized surface plasmon resonance. Nanotechnology. 21, (2010).
  25. Endo, T., Yamamura, S., Kerman, K., Tamiya, E. Label-free cell-based assay using localized surface plasmon resonance biosensor. Analytica Chimica Acta. 614, 182-189 (2008).
  26. Huang, Y. X., Cai, D., Chen, P. Micro- and Nanotechnologies for Study of Cell Secretion. Analytical Chemistry. 83, 4393-4406 (2011).
  27. Oh, B. R., et al. Integrated Nanoplasmonic Sensing for Cellular Functional Immunoanalysis Using Human Blood. ACS Nano. 8, 2667-2676 (2014).
  28. Raphael, M. P., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Long, J. P., Byers, J. M. Quantitative Imaging of Protein Secretions from Single Cells in Real Time. Biophysical Journal. 105, 602-608 (2013).
  29. Raphael, M. P., et al. A New Methodology for Quantitative LSPR Biosensing and Imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2011).
  30. Raphael, M. P., et al. Quantitative LSPR imaging for biosensing with single nanostructure resolution. Biophysical Journal. 104, 30-36 (2013).
  31. Raphael, M. P., et al. A new methodology for quantitative LSPR biosensing and imaging. Analytical Chemistry. 84, 1367-1373 (2012).
  32. Henn, A. D., et al. Modulation of single-cell IgG secretion frequency and rates in human memory B cells by CpG DNA, CD40L, IL-21, and cell division. Journal of Immunology. 183, 3177-3187 (2009).
  33. Bramswig, K. H., et al. Soluble Carcinoembryonic Antigen Activates Endothelial Cells and Tumor Angiogenesis. Cancer Research. 73, 6584-6596 (2013).
En etikett-fri teknik för spatiotemporala avbildning av en enda cell Secretions
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raghu, D., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Byers, J. M., Raphael, M. P. A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions. J. Vis. Exp. (105), e53120, doi:10.3791/53120 (2015).More

Raghu, D., Christodoulides, J. A., Delehanty, J. B., Byers, J. M., Raphael, M. P. A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions. J. Vis. Exp. (105), e53120, doi:10.3791/53120 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter