우리는 균류 아스 퍼질러 flavus를 아플라톡신에 합성 유전자 사일런 위해 RNA 간섭 신호를 포함하는 땅콩 종자 아플라톡신 및 유전자 발현 분석을위한 방법을 보여준다. 식물에서 곰팡이 독소의 RNAi를 매개 제어는 이전에보고되지 않았습니다.
국제 연합 식량 농업기구는 세계에서 식량 작물의 25 %는 아플라톡신에 오염되는 것으로 추정하고있다. 즉 음식의 100,000,000톤 파괴 또는 매년 인간이 아닌 소비로 전환되는 것을 나타냅니다. 아플라톡신은 일반적으로 곡물, 견과류, 뿌리 작물과 다른 농산물의 곰팡이 아스 페르 길 루스 flavus를하고 A를 parasiticus에 의해 축적 된 강력한 발암 물질이다. 땅콩 식물에서 RNA 간섭 (RNAi에)에 의해 다섯 아플라톡신 합성 유전자의 침묵은 A. 접종 다음 아플라톡신 축적을 제어하는 데 사용 된 flavus를. 이들은 보통 아플라톡신-공헌하는 조건 하에서 몇 종자 및 큰 필드 실험의 전통적인 제조 방법을 앞서, 어떠한 방법은, 개별 땅콩에서의 RNAi 형질 전환 이벤트의 효과를 분석하는 옵션이 존재하지 아니 하였다. 필드에서 자연적으로 오염 된 종자를 발견 할 확률은 1/1로 종종 1/100또한 000은, 아플라톡신의 오염이 균일하게 분포되지 않습니다. 우리의 방법은 실시간 PCR (RT-PCR)에 대한 처리 된 작은 조각 또는 작은 RNA 서열로, 형질 전환 이벤트 당 몇 종자를 사용하고, 초 고성능 액체 크로마토 그래피 (UPLC)에 의해 아플라톡신 축적 분석. RNAi의 발현 땅콩 라인 288-72와 288-74은 14,000 NG까지 축적 된 제어에 비해 아플라톡신 B 1의 100 % 감소 (p≤0.01)와 B 2로 나타났다. G -1 아플라톡신 B 1 aflatoxigenic A. 접종 flavus를. 참고로, 미국에서 인간의 소비에 대한 허용 아플라톡신의 최대 총 20 NG입니다. G -1. 이 프로토콜은 유전자 변형 땅콩 씨앗과 그 평가 방법에 아플라톡신의 RNAi를 매개 제어의 응용 프로그램을 설명합니다. 우리는 땅콩 및 기타 작물의 육종에의 응용 과학의 중요한 분야에서 급속한 발전을 가져올 것이라고 믿는다의학 및 인간의 영양은 상당히 중요한 농작물 아플라톡신 및 잠재적으로 다른 곰팡이 독소를 제어하는 국제적인 노력에 기여할 것이다.
약 45억명은 만성적으로 아플라톡신 1, 자연 2에 알려진 가장 강력한 발암 물질에 노출되어있다. 이 곰팡이 독소는 옥수수, 카사바, 쌀, 견과류, 곡물, 향신료 등 세계 3에 식량 작물의 25 %를 오염. 4. 어린이 5 성장을 방해 원인 아플라톡신은 면역 체계 (6)을 손상 인간의 생체 검사 7, 8에서 간세포 – 암의 58 %에서 존재하고, aflatoxicosis 9,10 주기적으로 발생하는 동안 수백 명의 사람들을 죽인다. 아플라톡신은 일반적으로 아스 페르 길 루스 flavus를하고 A로 생산 된 폴리 케 타이드 파생 곰팡이 독소이다 parasiticus; 아플라톡신의 B 1, B 2는 A. 의해 일어난다 flavus를, A. 반면, parasiticus 또한 G 1 및 G 2 생산하고 있습니다. 이들 화합물 및 UPLC 의해 그들의 분리를 보여주는 크로마토 그램의 화학 구조는도 1에 도시된다. </str사연>
그림 1. 아플라톡신 및 RNAi에 삽입 맨 :. 4 개의 가장 일반적인 폴리 케 타이드 파생 된 아플라톡신의 화학 구조 (왼쪽)와 (오른쪽) 크로마토 그램의 예 : B 1, B 2, G 1, G 2, 아스 페르 길 루스 parasiticus, 생산 .. flavus를은 B 1, B 2 바닥을 생산 : RNAi의 유전자 단편의 도식은 화살표 아래 번호는 아스 페르 길 루스 flavus를 게놈의 유전자 단편 가입 번호는, p5XCAPD 땅콩 변환에 사용되는 구성; PIV2 : 감자 인트론; BP : 염기쌍; RT_5X_1 및 RT_5X_2 :. 실시간 PCR 프라이머 사이트는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
계산 4를 기반으로하는 경우로 인해 땅콩에서 아플라톡신 수출에 경제 손실이 단독으로 $ 450 만 달러를 초과 NG. G -1 유럽 연합 (EU) (11) 인간의 소비를 위해 허용 된 아플라톡신의 한계. 아플라톡신은 60년 12 알려져있다; 많은 농업 관행이 다른 곰팡이 균주 (13, 14)의 응용 프로그램을 포함하여 그 효과를 완화하기 위해 개발되었습니다 불구하고 그러나, 제어의 일관된 방법은 존재하지 않고, 저항하는 식물 품종을 사용할 수 없습니다. 심지어 병원균 침입에 대한 도움이되는 조건에서, 곰팡이 독소 축적이 예측할 수와 정규 분포를 따르지 않기 때문에 아플라톡신에 저항 테스트 식물 생식 질은 특히 어렵다. 따라서 실험은 보통 종자 및 100-1,700 g의 여러 샘플 수백 데이터 15,16의 변동성을 감소시키는 큰 재배 지역을 필요로한다.
RNA 간섭이었다1998 (17)에서 발견; 과 "침묵"의 장점은 현재 새로운 애플리케이션의 숫자, 예를 들어, 탐구되고있다. 전이성 유방암 (18), 간암 (19), 골수성 백혈병 (20), 곤충 (21)와 선충 (22)에 대한 식물 보호에 대 한 인간의 치료에. 식물에서 RNA 간섭 신호도 공장 호스트 (25)에 밀착되어 곰팡이 병원균 내부 23,24 입을 전신 전사 후 유전자에 대한 책임되는 작은 간섭 RNA (siRNA와)과 고 분자량 RNA와, 셀 사이를 이동할 수있다. 곰팡이 병원체 유전자의 식물 매개 침묵에의 RNAi의 효과가 이들에 대한 몇 가지 식물 pathosystems에 설명 된, 식물 (잎)의 공중 부분에서 증상의 육안 검사 양상추 (26)에 질병 정량화, 즉, 난균 강 Bremia 허용 밀에서 푸치니 <su바나나 (28)에 P> 27 푸사. 훨씬 더 어려운 잎, 씨앗 침략 장기 토양의 여러 인치 미만 감염의 증상을 보여주지로 땅콩 식물의 곰팡이 독소, 특히 아플라톡신을 제어하는 RNAi의 효과를 평가하는 것입니다, 감염의 발생은 예측할 수없는, 오직 화학 물질 분석은 아플라톡신의 존재를 확인할 수 있습니다. 또한, 땅콩의 각 형질 전환 이벤트는 일반적으로 몇 가지 씨앗 (공장 당 4-6)를 생산; 따라서, 큰 필드 플롯에 노 아플라톡신 축적 특성, 전체 자르기 시즌을 지속하고, 씨앗의 수백을 사용하는 기존의 테스트는 가능하지 않습니다. 방법 미만 1 주일 분석 여기에 설명되어 있습니다 만 몇 가지 씨앗을 사용하여 형질 전환 유전자의 존재와 무 아플라톡신 축적 특성에 대한 RNAi의 땅콩 씨앗.
식물 숙주 식물에서 곰팡이 독소 축적의 RNAi를 매개 제어의 가능성을 보여주는 더 출판물이없는, 곰팡이 병원균의 유전자의 침묵하지만, 27,43를 입증되었다의 RNAi는 매개. 잎은 지하 포드의 곰팡이 감염시 증상을 보여주지로 땅콩 이러한 연구에 대한 하나의 제한 요소는 개별 공장의 노 아플라톡신 축적 표현형을 평가하는 방법의 부족이었다. 또한, 아플라톡신의하지-정규 분포를 축적하고, 화학 분석 (15, 16)에 대한 큰 시료에 대한 필요성은 단일 공장에 잠재적 인 RNAi의 효과의 정량화를 방해했다. 여기에 제시된 방법은 세중 세 24 시간 간격 샘플링 (표 1, 그림 7)를 수행하기 위해 다섯 가지 씨앗을 사용하여 72 시간 실험으로 구성되어 있습니다. 종자 (100)보다 작지 G를 필요 전형적인 아플라톡신 분석에 비해, 우리의 방법은 individua 특히 적합처음 두 개 또는 세 개 이하 포드를 생산하지 땅콩 식물 L 트랜스 제닉 이벤트.
아플라톡신 합성 RNA를 매개 침묵은 유 전적으로 아스 페르 길 루스 flavus를하고 A를 변환하여 증명되었다 parasiticus. aflR는 A.에서 아플라톡신 생산 주 레귤레이터이므로 flavus를하고 A. parasiticus 44, 45, 그것은 식물에서 RNA를 매개 침묵에 대한 흥미로운 대상이됩니다. 그러나 aflR 유전 변이는 아스 페르 길 루스 종 (46) 사이에 도시되어 있고, 공장에서 생산 숙주 RNAi의 신호와 일치하는 완전한 서열이 존재하지 않는 경우 그 유전자 변이체 사일런 벗어날 수있다. 따라서, aflR 벡터 p5XCAPD에 침묵의 목표 중 하나였다,하지만 하나가 아니었다. A. 도입 aflR 유전자 역전 반복 flavus를하고 A. 변환에 의해 parasiticus는없이 또는 최소한의 제품을 침묵 결과아플라톡신 (47)의 이온 (맥도날드 등., 2005b). 또한, 침묵 aflD 유전자는 A에서 최대 98 %로 아플라톡신 생산을 방지 flavus를하고 A. 직접 변환 48 parasiticus. 우리의 시스템의 성공 확률을 높이기 위해, 땅콩은 A에서 아플라톡신 생산에 관여 다섯 유전자의 반전 반복 조각으로 변형되었다 flavus를. 여기가 아플라톡신 합성 경로에 여러 유전자를 침묵의 대상 p5XCAPD, 90 % 아플라톡신 B 1, B 2 -100 % 낮은 수준을 사용하는 것은 라인 288-72 달성 한 것으로 나타났다 및 60-100% 낮은 수준에 축적된다 반 자엽은 A. 접종 하였다 제어에 비해 라인 2백88에서 74 사이 flavus를, (7)은 4도. 가장 중요한 것은,이 방법은 파라 메트릭 statis을 적용하여 288-74 제어 대 실험을하는 동안 라인 288-72에 의해 아플라톡신 축적에 통계적으로 유의 한 차이를 발견틱,도 7. 작은 샘플 크기를 고려할 때, 이러한 실험은 높은 해상도, 높은 성능과보다 3 배 높은 민감도를 5 배를 갖는다 UPLC 분석 하였다 아플라톡신을 검출하는 강력한 방법을 사용하기위한 필요성을 강조하는 것이 중요 HPLC 49.
RNAi의의 발현 삽입 288-74 만 24 시간 배양에 미숙 한 자엽 (노란색)에서 검출되었다. RNAi의 삽입이 24 시간에서 288-74의 성숙 자엽에 RT-PCR에 의해 감지되지 않았거나 48 시간, 그림 6에 어떤 성숙 그룹에.이 같은 현상은 다른 RNAi의 유전자 변형 땅콩 라인에서 관찰되었다 (아리아, RS 2015 미 출판), 보통 RNAi의 성적 증명서 만 24 시간에서 미성숙 자엽에서 검출되었다한다. RNA 시료 cDNA 합성 전에 DNase를 처리하여, 데이터는 액틴 발현 수준과 관찰 DNA 오염의 증거로 표준화했다. DNA가 샘플에 출석해야한다, 그것은해야뿐만 아니라 48 시간 샘플에서 검출되지만 일관 즉 그렇지 않았다되었다. 35S 프로모터의 제어하에 발현이 항상 일정하지 않다; 그것은 환경 조건 (50), 조직 및 발달 단계 (51, 52)의 유형에 의해 영향을받을 수있다. 동시에, RNA 간섭의 통로에, mRNA의 감쇠율과의 siRNA 감쇠율이 크게 변할 수있다 (53). 이는 RNA 간섭 메카니즘에 의해 mRNA를 분해성 48 시간 배양에서 mRNA의 검출을 방지 할 수도 있다는 것이 가능하다. 48 시간에서 표현의 부재가 낮은 35S 발기인 중심의 전사 때문이든, 또는 다이 서 (Dicer)에 의해 dsRNA를 빠르게 분해에 대답 일이다. 따라서, 높은 처리량 시퀀싱에 의해 작은 RNA를 검출은 RNAi의 54를 통해 발생하는 프로세스에 대한 더 나은 통찰력을 줄 것이다 이 실험에서. 그러나, RNA 침묵은 주로 photosynt에서 체관부를 통해 체계적으로 확산 이후55 (이 경우 땅콩 씨앗) 싱크를 자당에, 아플라톡신 합성의 침묵이 삽입 RNAi의 로컬 표현하지 않고 씨앗에서 발생할 수있는 소스를 싫어. 많은 연구는 씨앗 아플라톡신 축적을 방지 할 필요가 작은 간섭 RNA는 (siRNA의)의 임계 레벨을 결정하기 위해 수행 될 남아있다. 이 RNAi의 양, mRNA 발현이 (도 6)를 구성한다는 사실을 강조하는 것이 중요하고, 아플라톡신의 B 1, B 2 (도 7)의 축적은 VS 미성숙 (황색)에 대한 다른 결과를 나타내었다. 성숙 (갈색) 자엽. 땅콩 식물 즉, 그들은 수확 성숙 포드의 범위, 그림 2에 제시, 불확실한 성장이있다. 또한, 다른 성숙 그룹의 씨앗, 그들의 화학 성분에 차이가 예., 2.4 %의 미성숙 종자에서 자당, 1.9 %에 같은 현장 조건 56,57에서 성숙한 종자. 따라서, 실제 efficienc을 이해아플라톡신 RNA 축적의 중재 제어 Y, 별도로 성숙 그룹을 분석하는 것이 중요하다.
땅콩 종자의 자연 방어 제조 화합물 및 종자 및 환경 조건 58-61의 만기에 따라 상대적인 양의 다양성으로 변화 phytoalexins의 제조이며, 자엽 (62)에 비해 배아에서 특히 높다. 배아는 (게시되지 않은 아리아스의 RS) 핵산, 자엽보다 모두 DNA와 RNA의 상당히 높은 농도를 가지고있다. 땅콩 씨앗이 성숙, 자신의 생리 및 화학 성분의 변화 (63)를 발생한다. 진균의 미생물 발육 저지 활동 (64)와 땅콩 종피의 형태로 응축 된 탄닌의 페놀 항산화 제; 타닌과 페놀 성 화합물의 함량은 성숙 (65)와 함께 증가로이 또한 35 검정색에 노란색 성숙 단계를 반영 mesocarp 색상에 분명하다. T의 따라서, 존재이들 항균성 부여 ESTA 또는 배아 실험은 진균 성장을 제한하기 때문에, 따라서, 그들은 제거하고, RNAi의 사일런 싱 효과를 과대 있었다. 또한, 종피 및 배아를 제거하여 배아 phytoalexins 더 많은 RNA 함량을 가질 것이다 운반 절반 떡잎 같이 분석 변동의 소스를 제한하는 데 도움이.
성숙 그룹과이 실험에서 종피와 배아를 제거하여 분석뿐만 아니라, 그것은 몇 가지 더 관찰을 지적하는 것이 중요하다 :) 결과는 최대 96 시간 보육에 대해 표시 되더라도을, 그것은 더 이상 72 이상을 사용하지 않는 것이 좋습니다 씨앗이 96 시간에 의해 분해되는 때 시간은 일관된 결과를 얻기 위해; 및 b) 같은 씨앗에서 반 자엽이 무작위로 샘플링하지만, 완벽하게 독립적 인 샘플을 구성하지 않는 반면, RT-PCR 및 형질 전환 이벤트 내에서 아플라톡신 축적 씨 사이에 최소한의 변화를 보여 주었다. 또한, 정확한 진균 포자는 접종 부피 카운트2 μL의 S 및 측면 상에 떨어지는 회피 자엽의 절단면에 포자 애플리케이션 포자 발아 식물 조직에 노출되어 있는지 확인하는 것이 중요하다. 접시에 물 / 한천은 그림 4 (하단)의 마지막 프레임과 같이 (V / W), 부드러운 한천은 포자의 유출을 야기 1.5 %에 있어야합니다. ; 특정 형질 전환 이벤트에서 제한의 유용성을 시드 경우, 샘플링 대신 세중 획득 유사한 결과 (즉, 그림 7) 중복으로 수행 할 수 있습니다 그러나, 세중의 샘플은 표준 오차를 줄이는 데 도움이됩니다. 이 방법의 유일한 제한은 아플라톡신 검출 / 정량 고감도 시스템 (UPLC)을 필요로하지만, 동시에이 덜 민감한 방법으로 아플라톡신 검출되지 않아야의 RNAi 효과를 과대 평가의 가능성을 감소시킨다.
결론적으로,이 방법은 처음을 연구하는 방법을 제공하는 신뢰할아플라톡신의 제어에서의 RNAi의 효과. 이하 일주에 전체 자르기 시즌에서 실험 시간을 단축,이 방법은 대단히 완화 및 / 또는 아플라톡신의 제거를 향해 RNAi의-땅콩 / 아스 페르 길 루스 pathosystem에 대한 연구를 가속화 할 것이다.
The authors have nothing to disclose.
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
Primers, oligonucleotides | DNA Technologies, Coralville, IA, USA | n/a | |
Dneasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69106 | |
Czapek Dox agar medium | Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | CM0095 | |
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Freezer -80°C | n/a | n/a | |
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SPE Reservoirs 1.5 mL | Grace Davison Discovery Scientific | 210011 | |
Frits for 1.5 mL SPE reservoir | Grace Davison Discovery Scientific | 211401 | |
Autosampler vials | Waters Corporation, Milford, MA | 186005221 | |
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Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A6636; A9887; A0138; A0263 | |
Systat Software 12.2 | SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA | ||
Trizol reagent | Invitrogen, CA | 15596-018 | |
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix | Invitrogen, CA | 11752-050 | |
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Luria Broth-Miller | Fisher Scientific | R453642 | |
pENTR1A | Invitrogen, CA | A10462 | |
LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-020 | |
T4 DNA Ligase | NEB Biolabs | M0202L | |
Gelrite | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1919 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406 | |
QIAcube robot workstation | Qiagen, Valencia, CA | 9001292 | |
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin | Goldbio, St. Louis, MO | cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, CA | 11304-029 |