Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Environment
Click here for the English version

Environment

RNAi-mediert Kontroll av Aflatoksiner i Peanut: Metode for å analysere mykotoksin Produksjon og transgene uttrykk i Peanut / Published: December 21, 2015 doi: 10.3791/53398
Automatic Translation
1, 1, 1
1National Peanut Research Laboratory, United States Department of Agriculture, Agricultural Research Service

Summary

Vi viser en metode for analyse av aflatoksiner og transgene ekspresjon i peanut frø som inneholder RNA-interferenssignaler for lyddemping aflatoksin-syntese-genene i soppen Aspergillus flavus. RNAi-formidlet kontroll av mykotoksiner i planter har ikke tidligere blitt rapportert.

Abstract

Food and Agriculture Organization of the United Nations anslår at 25% av matplanter i verden er forurenset med aflatoksiner. Som representerer 100 millioner tonn mat blir ødelagt eller viderekoblet til ikke-konsum hvert år. Aflatoksiner er kraftige karsinogener normalt akkumulert av sopp Aspergillus flavus og A. parasiticus i korn, nøtter, rot avlinger og andre landbruksprodukter. Stanse av fem aflatoksin-syntese gener ved RNA-interferens (RNAi) i peanut planter ble brukt til å kontrollere aflatoksin akkumulering etter inokulering med A. flavus. Tidligere ingen metode eksisterte for å analysere effekten av RNAi i enkelte peanut transgene hendelser, da disse vanligvis produserer noen frø, og tradisjonelle metoder for store feltforsøk etter aflatoksin-bidrar forholdene var ikke et alternativ. I feltet, er sannsynligheten for å finne naturlig forurensede frø ofte 1/100 til 1/1000. I tillegg er aflatoksin forurensning ikke er jevnt fordelt. Vår metode bruker noen frø per transgen hendelse, med små biter bearbeidet for real-time PCR (RT-PCR) eller små RNA sekvensering, og for analyse av aflatoksin akkumulering av ultra-væskekromatografi (UPLC). RNAi-uttrykke peanut linjer 288-72 og 288-74, møtte opp til 100% reduksjon (p≤0.01) i aflatoksin B 1 og B 2 sammenlignet med kontrollgruppen som akkumulert opp til 14 000 ng. G -1 av aflatoksin B 1 når inokulert med aflatoxigenic A. flavus. Som referanse, er den maksimale totalt aflatoksiner tillatte for konsum i USA 20 ng. G -1. Denne protokollen beskriver anvendelsen av RNAi-mediert kontroll av aflatoksiner i transgene peanut frø og metoder for sin vurdering. Vi tror at dens anvendelse i avl av peanut og andre avlinger vil bringe raske utviklingen innen dette viktige området av vitenskap, Medisin og human ernæring, og vil bidra vesentlig til den internasjonale innsatsen for å kontrollere aflatoksiner, og potensielt andre mykotoksiner i store matplanter.

Introduction

Omtrent 4,5 milliarder mennesker er kronisk utsatt for aflatoksiner 1, de mektigste karsinogener kjent i naturen 2. Disse mykotoksiner forurense 25% av matplanter i verden 3, inkludert mais, kassava, ris, nøtter, korn og krydder. 4. Aflatoksiner årsak stunting hos barn 5, svekke immunforsvaret 6, er til stede i 58% av hepatocellulært-karsinom i menneske biopsier 7,8, og drepe hundrevis av mennesker i løpet av periodiske utbrudd av aflatoxicosis 9,10. Aflatoksiner er polyketide-avledet mykotoksiner som normalt blir produsert av Aspergillus flavus og A. parasiticus; aflatoksiner B 1 og B 2 er produsert av A. flavus, mens A. parasiticus også produserer G 1 og G 2. Den kjemiske struktur av disse forbindelser og et kromatogram som viser deres separasjon ved UPLC er vist i figur 1.

Figur 1
Figur 1. Aflatoksiner og RNAi sett Top:. Kjemiske strukturen (venstre) og eksempel på kromatogram (høyre) av de fire vanligste polyketide-avledet aflatoksiner: B 1, B 2, G 1 og G 2, produsert av Aspergillus parasiticus, A . flavus produserer B 1 og B 2 Bunn: Skjematisk av genfragmenter i RNAi konstruere p5XCAPD brukes for peanut transformasjon, tall i henhold til pilene er gen-fragment deponeringsnummer i Aspergillus flavus genomet;. PIV2: potet intron; bp: basepar; RT_5X_1 og RT_5X_2. Real-Time PCR primer nettsider Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Økonomiske tap i eksporten som følge av aflatoksiner i peanut alene overstige $ 450 millioner amerikanske dollar hvis beregnet basert på 4 ng. G -1 grense på aflatoksin tillatt for konsum i EU 11. Aflatoksiner har vært kjent i 60 år 12; Men selv om mange jordbrukspraksis ble utviklet for å redusere deres effekt, herunder anvendelse av andre soppstammer 13,14 finnes det ingen konsistent metode for kontroll, og resistente plantesorter er ikke tilgjengelige. Testing anlegg genmateriale for resistens mot aflatoksiner er særlig vanskelig, fordi selv under betingelser som bidrar til patogen invasjon, er mykotoksin akkumulering uforutsigbar og ikke følger en normalfordeling. Dermed eksperimenter krever som regel store plante områder, hundrevis av frø og flere prøver av 100-1,700 g å redusere variabiliteten i dataene 15,16.

RNA interferens varoppdaget i 1998 17; og fordelene ved «stanse» blir nå undersøkt i en rekke nye anvendelser, f.eks., i human terapi mot metastatisk brystkreft 18, leverkreft 19, myeloid leukemi 20, og i plante beskyttelse mot insekter og nematoder 22 21. I planter, kan RNA interferens signalene celle til celle, med små RNA forstyrre (siRNA) og høy molekylvekt RNA være ansvarlig for systemisk posttranskripsjonelt genet stanse 23,24, selv inne sopp patogener som er i nær kontakt med plantevert 25. Effektiviteten av RNAi på plante-mediert stanse av sopp-patogen gener har blitt beskrevet i noen plante pathosystems, for disse, visuell undersøkelse av symptomer i luftig deler av planter (blader) lov sykdom kvantifisering, dvs. oomycete Bremia i salat 26 , puccinia i hvete Fusarium i banan 28. Mye mer vanskelig er å evaluere RNAi effektivitet til å kontrollere mykotoksiner i planter, spesielt aflatoksiner i jordnøtter som bladene viser ingen symptomer på infeksjon, organer invaderte (frø) er under flere inches av jord, er uforutsigbar, og bare kjemisk forekomst av infeksjon analyse kan bestemme tilstedeværelsen av aflatoksiner. I tillegg har hver transgen hendelse i peanut normalt produserer noen frø (4-6 per plante); Derfor er tradisjonell testing for en no-aflatoksin akkumulering egenskap i store felt tomter, som varer hele beskjæring sesonger, og ved hjelp av hundrevis av frø ikke gjennomførbart. En metode er beskrevet her for å analysere på mindre enn en uke, RNAi peanut frø for tilstedeværelsen av transgenet og for en no-aflatoksin akkumulering egenskap, ved hjelp av bare noen få frø.

Protocol

1. Molecular Construct og Peanut Transformation

  1. Kombiner DNA-fragmenter av fem A. Flavus gener, AFL2G_07223 (aflS eller aflJ), AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), AFL2G_07731 (pes1) og AFL2G_05027 (aflatoksin efflukspumpe, aflep). For dette, kan du bruke følgende primere og ultramers: DIR-en, Short-dir1-R, DIR-to-invertert, Short-Dir2-R, DirAll-Nco-Rv, og DirAll-BamEco-Fw, tabell 1.
    1. Gjør DIR-en dobbelt tråd av 5 PCR-sykluser (25 ul reaksjons; 95 ° C 2 min, fulgt av 5 sykluser med 94 ° C 45 sek, 55 ° C 30 sek, 68 ° C 15 sek) ved bruk av DNA-polymerase i henhold til produsentens instruksjoner og primer Short-dir1-R for å legge igjen en 3 'overheng CCCGT. Gjenta disse trinnene for å gjøre DIR-to-invertert dobbel tråd bruker primer Short-Dir2-R for å legge igjen en 3 'overheng ACGGG komplementær til DIR-en.
    2. Ligere to 199 bp fragments med T4 DNA Ligase som per produsentens anvisninger. PCR amplifisere det resulterende 393 bp-fragment som angitt i del 1.1.1 ved anvendelse av primere DirAll-CACC-Fw og DirAll-Nco-Rv (tabell 1), og klone produktet ved hjelp av standardteknikker inn i pENTR1A for å lage plasmid p2 + 4ENTR.
    3. Recombine p2 + 4ENTR inn pCAPD 29 (NCBI Tiltredelse: KC176455.1) bruker LR clonase II enzym blanding i henhold til produsentens instruksjoner for å gjøre plasmid p5XCAPD, og forvandle det til Escherichia coli DH5a med standard teknikker etterfulgt av delvis sekvensering. Merk: Den komplette RNAi innsats er vist i tabell 1.
  2. Transform Agrobacterium stamme C58C1 30 med plasmid p5XCAPD som tidligere rapportert 30, og bruke den resulterende bakterien å forvandle peanut planter som følger:
    1. Vokse ved 30 ° C i Agrobacterium husing p5XCAPD, bruke til dette, 50 ml LB-buljong supplert med 500ug ml -1 streptomycin, 25 mikrogram ml -1 gentamicin, 10 mikrogram ml -1 kanamycin og riste kulturen ved 250 rpm inntil nå en OD 260.
    2. Høste Agrobacterium cellene ved sentrifugering (6000 xg) i 10 min, resuspender i 50 ml AB minimal medium 31 med 100 mikrometer acetosyringone for en time, og plasser i bakteriesuspensjonen explants fra 10-14 dager gamle frøplanter Exp27-1516, runner -type peanut avl linje. Blot tørke explants på 3MM trekkpapir etter 30 min, og plassere dem på shoot-induksjon medium (SIM) [MS salt 32, 3% sukrose, 20 mikrometer benzylaminopurine (BAP), 10 mm thidiazuron (TDZ), pH 5,8, 0,3 % gellangummi] uten antibiotika i mørke i tre dager.
    3. Gjør vev utvalg og regenerering som rapportert før 33. Flytt vev til SIM (500 mikrometer cefotaksim og 100 mikrometer kanamycin) for shoot formasjon, med bi-ukentlige overføringer for 2 måneder. Deretter stedvoksende skudd på shoot-forlengelse medium (SEM) [5 mikrometer BAP, 1fiM gibberellinsyre (GA 3)], bi-ukentlig i flere måneder.
    4. Plassere individuelle skudd, 2 cm i størrelse, i rot-induksjonsmedium (RIM) [1/2 MS, 1,5% sukrose, 5 mM α-naftalen-eddiksyre (NAA), 2,5 uM indol-smørsyre (IBA)], deretter akklimatisere spirene og overføre dem til drivhuset.

2. Identifisering av Peanut Planter huse RNAi til Silence Aflatoksin Synthesis Genes

  1. Bruk plant mini kit i en robot arbeidsstasjon med 200 mL eluering i henhold til produsentens instruksjoner for å trekke ut DNA fra unge blader av peanut planter som var gjenstand for prosessen med transformasjon (som beskrevet tidligere) med RNAi konstruere p5XCAPD (figur 1), som har som ryggrad plasmid pCAPD 29 for genet Slå.
  2. Screen DNA-prøvene av single-tube nestet PCR (STN-PCR) som beskrevet Previgere 34 å påvise seleksjonsmarkør NPTII og RNAi sett fra p5XCAPD. Clonally forplante fra kutt (3-4 noder) PCR positive planter til å produsere tilstrekkelige frø for testing i denne første generasjon.
    1. Bruke fire to-gangers fortynninger av DNA (50-100 ng mL -1 før fortynning) i alle STN-PCR-reaksjoner. For NPTII, benytte eksterne primere PCAPD 5714F: 5'-AGGCTATTCGGCTATGACTG-3 'og PCAPD 6446R: 5'-CGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3' og interne primere PCAPD 5730F: 5'-ACTGGGCACAACAGACAATC-3 'og PCAPD 6249R: 5'-ATATTCGGCAAGCAGGCATC- 3 '.
    2. For påvisning av RNAi setter i STN-PCR reaksjoner bruke eksterne primere 35S-PDSFw: 5'-CCTAACAGAACTCGCCGTAA-3 'og DirAll-Nco-Rv: 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3', og interne primere Probe_5027_Fw: 5'-gtatttgtgaccatgtttctg-3 'og Probe_7228_Rv: 5'-GGACGGATAGTAAACTGCGG-3'.
  3. Harvest peanut pods fra STN-PCR positive planter og i con troll planter dyrkes i de samme forholdene. KRITISK STEP: Sørg for at kontroll planter dyrkes i de samme forhold og samme sesong som de RNAi planter. Vann blast pods med en høytrykksvasker ved lav intensitet eller skrape for hånd for å fjerne exocarp, bestemme fargen på mesocarp ved å plassere de pods på en modenhet bord og separate pods i grupper (gul, oransje, brun og svart) 35 (Figur 2).

Figur 2
Figur 2. Utarbeidelse av peanut pods for analyse. Venstre: Ulike peanut størrelser funnet ved høsting som peanut er en ubestemt vekst plante; Center: plassere peanøtter i metall kurv for vanntrykk fjerning av exocarp, Høyre: forfall grupper ved mesocarp farge på en peanut profil brett (gul, oransje, brunt og svart).98fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

3. Forsøksoppsett

  1. Ta av skrog, prosess gule og brune frø seg. Beregne antall frø å bruke i forsøket i henhold til tabell 2. Legg merke til at minst tre frø brikker (en seedet piece = halvparten cotyledon) per peanut linje og prøvetaking dato er nødvendig for å utføre statistisk analyse og redusere standard feil.
Navn Sekvens
DIR-en 5'-
GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTCGTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAATCCCCTGCATCTACGCGCACGCATC
ACTTGGGGTACCCGT-3 '
Short-dir1-R 5'-Phos-TACCCCAAGTGATGCGTGCGCG-3 '
DIR-2-invertert 5'- GGTTATTGGGTGCAGAATGGTAAACCACCCAACAGTACGCGAAATG
TCAATTCCAGAGTCCCAAACCTCCCTACCGTGGCCTGGACGGATAG
TAAACTGCGGAGCTTGGGAACAAAATCCGCTGTCTGATCGCCGAAG
AGAAAGAGTTGCCTTGATTGAGCCGCATCGAGGACAGGTTGTGTTG
CTGTTGATAGACGGG-3 '
Short-Dir2-R 5'-Phos-CTATCAACAGCAACACAACC-3 '
DirAll-CACC-Fw 5'-CACCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 '
DirAll-Nco-Rv 5'-ATGCCATGGGGTTATTGGGTGCAGAATGG-3 '
DirAll-BamEco-Fw 5'-ATGGGATCCGAATTCGCCAGCTCAAAAGTGCGATGC-3 '
Komplett RNAi innsats 5'- GCCAGCTCAAAAGTGCGATGCACCAAGGAGAAACCGGCCTGTGCT
CGGTGTATCGAACGTGGTCTTGCCTGTCAATACATGGTC / GTATTTG
TGACCATGTTTCTGGTGGCATTGGACCGTCTTGTCATCTCTACAGCC
ATTCCCCAGATCACGGACGAAT / CCCCTGCATCTACGCGCACGCAT
CACTTGGGGTACCCGTCTATCAACAGCAACACAACCTGTCCTCGAT
GCG / GCTCAATCAAGGCAACTCTTTCTCTTCGGCGATCAGACAGCG
GATTTTGTTCCCAAGCTCCGCAGTTTACTATCCGTCCA / GGCCACGG
TAGGGAGGTTTGGGACTCTGGAATTGACATTTCGCGTACTGTTGGG
TGGTTTACCATTCTGCACCCAATAACC-3 '

. Tabell 1. Oligonukleotider og ultramers brukes til å bygge RNAi konstruere p5XCAPD Phos: fosforylert 5 'ende; "/" Skiller de fem genfragmentene anvendt; Komplett RNAi Innsats: sekvens brukes som 2 inverterte repetisjoner for å danne p5XCAPD.

  1. Plassere hele peanut frø i et enkelt lag, slik at de dekker bunnen av et sterilt begerglass. Legg 75% etanol / vann (v / v) løsning for å dekke frøene, og deretter legge til et likt volum av samme løsning. Inkuber ved romtemperatur i 30 sekunder, og deretter skylles med sterilt deionisert vann (SDW).
  2. Tilsett 2% hypokloritt til begeret inneholdende etanol behandles frøene som følger: Tilsett nok til 2% hypoklorittoppløsning for å dekke frøene, og deretter legge et likt volum av samme løsning og inkuberes i 5 min. KRITISK STEP: Skyll grundig tre ganger med et volum på SDW tilsvarer 5 ganger volumet av hypokloritt brukes (figur 3).

Figur 3
Figur 3. Eksperimentell oppsett. Top: Overflate sterilisering av peanut frø før og etter hypokloritt, fjerning av frø strøk (Testa); Midten: fjerning av embryo og lukke visningen av embryo, så kutt cotyledon i to; Bunn: halv cotyledons i sterilt destillert vann, blotting på steril absorberende papir, bulker på vann agar, og plassering av halv cotyledons (klipp side oppover) på agar overflaten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

  1. La overflaten sterilisert frø å absorbere nedsenket i SDW for 2 timer. Plasser frøene på et sterilt petriskål, fjern frø strøk med pinsett, skille cotyledons, og med en skalpell fjerne embryoer. notat:Embryoer kan kastes eller brukes til å regenerere nye planter.
  2. Skjær hver cotyledon i to ved hjelp av en skalpell. For å unngå dehydrering, holde kuttet frø brikker i sterilt vann til alle frøene blir behandlet.
  3. Er fremstilt petriskåler inneholdende sterilt vann agar (1,5% agar / vann, vekt / volum), en for hver tre frø stykker. Lag små bulker i agar bruker pinsett, kort blot overflødig vann av frø stykker på sterile tørkepapir, og deretter plassere frøet stykker (cut ansiktet oppover) på vannet / agarplatene.
  4. Fra en fersk kultur av Aspergillus flavus aflatoxigenic NRRL 3357 i sin Czapek-agar-medium dyrket ved 25 ° C i 10 dager, fremstille en suspensjon av 50.000 sporer pr ul SDW, telles med et hemocytometer.
  5. Legg 2 mL av sporesuspensjon på kantene på hver halv cotyledon stykke unngå avrenning på sidene, for å sørge for at sporene blir eksponert for frøet vev som havner RNAi (figur 4).

    Figur 4
    Figur 4. Inoculation og inkubasjon for aflatoksin analyse. Top: Half cotyledon, inokulering med sporesuspensjon, og Aspergillus flavus mycelvekst på halv cotyledon etter 24 timers inkubasjon Bunn: venstre:. Inkubasjon av 48 timer på 1,5% agar; senter: inkubering i 72 timer på 1,5% agar; høyre:. eksempel på feil eksperimentelt oppsett, inkubasjon i 72 timer på 0,5% agar Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    1. Inkuber petriskåler inneholdende inokulerte og ikke-inokulerte halv cotyledons ved 30 ° C i mørke inntil prøvetaking.

    4. Prøvetaking for Aflatoksin Analyse og Gene Expression

    1. Samle inn prøver itriplikat ved 24, 48 og 72 timer (valgfritt 96 timer) for inkubasjon, både for RT-PCR og for aflatoksin analyse, hver blir gjenskape en brikke (halv cotyledon). Pick prøver tilfeldig fra forskjellige plater på hvert prøvetakingstidspunktet. Ved hjelp av en vev, mykt fjerne agar og overflødig soppsporer før du plasserer frø stykker i hetteglass eller reagensglass.
    2. For aflatoksin analyse, plassere hver replikat (ett stykke) i en 4 ml glass med skrulokk og oppbevares ved -80 ° C. Merk: Gitt den kjemiske stabilitet av aflatoksiner, kan prøvene lagres i denne tilstand i flere måneder (i nåværende forsøkene vanligvis 1-2 måneder).
    3. For RT-PCR sted hver replikat (ett stykke) i allerede forberedt 2 ml sliping rør som inneholder to rustfritt stål perler (2,5 mm diam) og tre Zirkonium perler (2 mm diam).
    4. Umiddelbart fryse (fortrinnsvis i flytende nitrogen) alle prøvene og holde dem ved -80 ° C inntil behandling.

    5. Aflatoksin Analyse av Individuell Half Cotyledon Pieces

    1. Bruk A. flavus inokulert prøver for denne analysen. Ta med prøvene til romtemperatur i ca 30 min, legg fire bind (vanligvis 2-3 ml; w / v) metanol (holder rekorden for senere beregninger), lukke caps, og inkuber O / N (~ 16 timer) i mørket uten omrøring.
    2. Plasser en fritte inn en matchende 1,5 ml propylen minikolonne, tilsett 200 mg enkel Al 2 O 3 og lokket den med en annen frit som tidligere beskrevet 36; Deretter plasserer en Ultra-High Performance Liquid Chomatographer (UPLC) autosampler ampulle under kolonnen nær nok til å unngå mulig fordampning av eluatet.
    3. I et engangs prøverør av glass (ikke bruk plast), plassere 0,5 ml av metanolen ekstraktet oppnådd i trinn 4.1, tilsett 0,5 ml acetonitril, blandes ved hjelp av pipette, og anvende 0,5 ml av blandingen inn i kolonnen fremstilt i trinn 4.2. Tillat eluering inn i autosampler hetteglasset ved gravitasjon (gjelder ikke trykk). Eluering tar vanligvis 2-4 min, nær the hette umiddelbart med en UPLC kompatibel cap med skillevegger. Hold ampullene ved omgivelsestemperatur, og analysere dem på samme dag på en UPLC.
    4. For separasjon av aflatoksiner, sted autosampler hetteglass som inneholder eksempel Eluatene og autosampler ampuller med aflatoksin standarder (B 1 og B 2 ved bruk av A. flavus) i en UPLC instrument utstyrt med en matchende UPLC kvartær Solvent Manager UPLC Prøvebehandling, UPLC Fluorescent Detector, og en C-18 2,1 mm x 50 mm, 1,7 um kolonne.
      1. Bruk av en isokratisk mobil fase bestående av vann / MeOH / CH3CN (64:23:13, v / v / v) blanding ved en strømningshastighet på 0,30 ml min-1. Skaff chromatograms som sikrer en stabil baseline separasjon for nøyaktig beregning av aflatoksin konsentrasjon, i henhold til produsentens instruksjoner 37.
      2. Bekrefte identiteten til aflatoksiner etter å skaffe sine masse spektrale data og sammenligne dem med publiserte data 38. Bruk en jegpå felle massespektrometer utstyrt med en ESI grensesnitt og tilsvarende programvare i henhold til produsentens instruksjoner.
    5. Bestemme konsentrasjoner av aflatoksiner ved henvisning til kalibreringskurver erholdt ved å injisere forskjellige mengder av tilsvarende kommersielle standarder av aflatoksiner B 1 B 2 G 1 og G 2 som foreslått av produsenten UPLC og bestemt av programvaren 37.
    6. Place frø stykker allerede ekstrahert med metanol, i enkelte glassflasker for O / N (~ 16 timer) lyofiliseringen å fastslå tørrvekt. Deretter beregne aflatoksin konsentrasjon g -1 tørrvekt av frø brikke i ng..
    7. For analyse av data, konvertere aflatoksin resultatene til log (ng. G -1 1), etterfulgt av Tukey test for gjen- sammenligninger.

    6. Gene Expression, RT-PCR behandling av prøver

    1. Ta de 2 ml slipe rør inneholdeing prøver fra -80 ° C fryser, og umiddelbart (uten tining) male dem i en kulemølle homogenisator ved 3100 rpm i 40 sekunder, går du videre til RNA ekstraksjon ved hjelp Trizol i henhold til produsentens instruksjoner.
    2. Forbered cDNA fra hver prøve ved anvendelse av 1 pg RNA og like mengder av oligo dT og tilfeldige heksamerer, lage en 1: 8 fortynning av cDNA og bruke 2 ul per reaksjon i RT-PCR (som tidligere beskrevet 39).
      1. For påvisning av ekspresjon av RNAi innsats anvender primere: RT_5X_1_105F: 5'GGTGGCATTGGACCGTCTTG-3 ', RT_5X_1_232R: 5'-CGCATCGAGGACAGGTTGTG-3'; og RT_5X_2_95F: 5'-CCATGTTTCTGGTGGCATTG-3 ', RT_5X_2_229R: 5'-ATCGAGGACAGGTTGTGTTG-3'.
      2. For påvisning av ekspresjon av den selekterbare markør NPTII, anvender primere: RT_NPTII_1_6871F: 5'-CTCGCTCGATGCGATGTTTC-3 ', RT_NPTII_1_7004R: 5'-GCAGGATCTCCTGTCATCTC-3'. Bruk husholdningsgenet Actin for standardisering, og primere: Actin-Fw: CACATGCCATCCTTCGATTG; Actin-Rv: CCAAGGCAACATATGCAAGCT 40.
    3. Analysere resultatene etter Delta-deltaet C T metode 41 standardisert for Actin uttrykk. Representerer de resultatene som gangers økning over kontrollen.

Representative Results

Plasmid p5XCAPD ble gjort som et derivat av pCAPD 29, og brukte den til å forvandle peanut planter; denne vektoren bærer inverterte gjentakelser av fem små fragmenter, 70-80 bp hver, av aflatoksin-syntese gener av A. flavus atskilt av et intron (figur 1). Fragmenter av AFL2G_07224 (aflR), AFL2G_07223 (aflS eller aflJ), AFL2G_05027 (aflatoksin efflukspumpen, aflep), AFL2G_07228 (aflC / pksA / pksL1), og AFL2G_07731 (pes1) ble anvendt for konstruksjonen, tallene på figur 1 tilsvarer A . flavus genom merknad i BROAD Institute, Cambridge, MA, og litteraturen 42. Totalt 99 peanut linjer ble regenerert etter å ha gått gjennom transformasjonsprosessen, var 50 PCR positive for NPTII oppdaget av STN-PCR, og 33 linjer var PCR positive og produsert frø. Bare syv PCR positive linjer ble clonally formeres og testet av gavet metode for aflatoxin akkumulering, alle syv viste mellom 60% og 100% mindre aflatoksin akkumulering enn kontrollen. Her viser vi resultatene fra to av de sju linjene. Som enkelttransgene hendelser vanligvis produserer noen frø, ble det utviklet en metode for å bruke et minimum antall frø samtidig være i stand til å gjøre parametrisk statistisk analyse. Et flytdiagram av prøvepreparering og eksperimentelle oppsettet er vist i figur 5 og tabell 1. Selv om den første generasjonen av transgene frø er typisk hemizygous, er det forventet at celle-til-celle og systemisk bevegelse av små RNA interfererende (siRNA) som genereres gjennom RNA interferens bør konferere aflatoksin-syntese stanse hele anlegget.

Figur 5
Figur 5. Skjematisk flytskjema av fremgangsmåten for å analysere effektiviteten av RNAi i stanse Aspergillus aflatoksin-syntese gener i peanut frø. Grafisk fremstilling av arbeidsflyt ved behandling av peanut prøver for genekspresjon eller aflatoksin analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

RNAi peanut linjer 288-72 og 288-74 viste nærvær av NPTII valgbar maker når testet av STN-PCR, er gel seksjoner vist i figur 6 (øverst), originale bilder er tilgjengelig fra forfatterne på forespørsel. Plasmid pCAPD ble ikke brukt som en kontroll for transformasjon, siden det koder inverterte gjentagelser av to gener CMR (kloramfenikol-resistens) og CCDB (toksin) med ukjent effekt på planter. PCR negative peanut linje 288-9 og andre som gikk gjennom fornyelsesprosessen og ble dyrket i de samme vilkår som RNAi linjer, ble brukt som negativ conkontrollen.

Figur 6
. Figur 6. Påvisning av transgene og Real Time uttrykk for RNAi innsats Top: Single-tube, Nøstet PCR påvisning av transgene peanut linjer RNAi-288-72 og RNAi-288-74, positive planter. Controls: W (vann), PP (positiv plante), MM (master mix), p (plasmid p5XCAPD); Fraksjonene 1/2 1/4 1/8 1/16 representerer to-gangers fortynninger av DNA bunn.: Real-Time PCR deteksjon av ekspresjon av RNAi innsats (primersett: RT_5X_1, RT_5X_2, som i figur 1, på umodne ( gul) og moden (brun) cotyledons av transgene linjer på 24 og 48 timers inkubasjon, grå linje: C T = 1. Histograms representerer gjennomsnitt og standardfeilfelt (T) av tre biologiske prøvermed tre tekniske replikater. Den relative kvantifisering av RNAi innsats var normalisert med hensyn til renhold genet Actin som en intern kontroll og sammenlignende fold uttrykk av transgenet beregnet som beskrevet i 5.2.2 og 5.3. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

For å teste effektiviteten av plante-host RNAi-mediert potensial kontroll av aflatoksin akkumulering, ble nyhøstet conidia av Aspergillus flavus NRRL 3357 søkt på snittflaten av en halv cotyledons hvorfra embryoer og testa hadde blitt fjernet (Tall 3, 4). A. flavus NRRL 3357, hvor genomet har blitt sekvensert og var grunnlaget for utforming p5XCAPD, ble vennlig levert av Dr. Horn ved USDA-ARS-NPRL. Den resulterende fungal invasjon av en halv cotyledon etter 24, 48 og 72 timer ved 30 ° C er å vise n i figur 4. Prøver av inokulerte halv cotyledons ble samlet ved 24, 48, 72, 96 timer inkubasjon og analysert for hoved fire aflatoksiner b 1, b 2, G 1 og G 2 ved hjelp av UPLC og bekreftet ved LC-MS ; Resultatene er vist i figur 6. aflatoksin Konsentrasjoner ble bestemt ved bruk av en publisert fremgangsmåte med modifikasjoner 36. Ved 96 timers inkubasjon cotyledons begynne å gå i oppløsning på grunn av soppinfeksjon. RNAi linje 288-72 viste signifikant lavere nivåer av aflatoksiner enn kontrollgruppen på alle prøvetakingsdatoer i umodne cotyledons og på de fleste utvalgs datoer i de modne seg. RNAi linje 288-74 viste signifikant lavere nivåer av aflatoksiner på de fleste prøvedatoer. Nivåer av betydningen av Tukey test er merket med stjerne i grafisk i figur 7.

g7.jpg "/>
. Figur 7. Aflatoksiner B 1 og B 2 i halv peanut cotyledons etter inkubering (24, 48, 72 og 96 timer) med Aspergillus flavus Control: frø av 288-9 ikke-transgen linje; RNAi: frø fra RNAi-288-72 og RNAi-288-74, transgen for RNAi p5XCAPD til taushet fem aflatoksin-syntese gener. (A) Aflatoksin B 1 i modne frø (brun); (B) Aflatoksin B 2 modne frø; (C) Aflatoksin B 1 i umodne frø (gule) og (D) Aflatoksin B 2 i umodne frø. Middelverdiene med de tilsvarende standard-feilstolpene (T) i duplikat biologiske prøver er representert. Statistisk signifikante forskjeller Tukey test *: p ≤ 0,05, **: p ≤ 0,01, ***: p ≤ 0,001.s: //www.jove.com/files/ftp_upload/53398/53398fig7large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Totalt sett, RNAi-288-72 viste i løpet av eksperimentet (24 til 96 timers inkubasjon), en 94% -100% reduksjon av aflatoksin B 2, og en 90% -100% reduksjon av aflatoksin B 1 sammenlignet med kontrollen. RNAi-288-74 viste en 63% -100% reduksjon i aflatoksin B 2 og 60% -100% reduksjon i aflatoksin B 1, figur 7.

Primere som brukes for Real-Time PCR deteksjon av uttrykk for RNAi innsats er vist i figur 1. Peanut-frø cotyledons ble analysert uten embryoer, for å fjerne sine naturlige forsvar og være i stand til å oppdage den potensielle effekten av RNAi på området mest utsatt for sopp invasjon, cotyledons. Uttrykk for RNAi innsatsen påvist i umodne cotyledons (gule) på linje 288-74 av primer satt RT_5X_1 var fire ganger over C T (figur 1, 6). Uttrykk av RNAi innsats ble ikke påvist i modne cotyledons på 24 timer, eller om modne eller umodne cotyledons på 48 timers inkubasjon, figur 6 (nederst).

Peanut Linje Tidspunkt for prøvetaking Prøver for RT-PCR Prøver for aflatoksin analyse (vaksinert) Numbra av frø
(non inokulert)
Rep 1 Rep 2 Rep 3 Rep 1 Rep 2 Rep 3
RNAi (gul) 24-timers 1 1 1 1 1 1 4.5
48 timer 1 1 1 1 1
72 timer 1 1 1 1 1 1
Kontroll 24-timers 1 1 1 1 1 1 4.5
(gul) 48 timer 1 1 1 1 1 1
72 timer 1 1 1 1 1 1

Tabell 2. Eksempel på små prøveoppsett for å analysere genekspresjon og aflatoksin akkumulering i RNAi peanut frø. Fullstendig analyse av ekspresjon og aflatoksiner for en modenhet gruppe (f.eks., Gul), med tre prøvetakings ganger (24, 48 og 72 hr) , i tre eksemplarer, vil kreve 4,5 frø, hvert nummer én i tabellen representerer halvparten cotyledon.

Discussion

Plante-verts RNAi-mediert stanse av gener i sopp-patogener er demonstrert 27,43, men det er ingen publikasjoner som viser gjennomførbarheten av RNAi-formidlet kontroll av mykotoksin akkumulering i planter. En begrensende faktor for disse studiene i peanut var mangelen på en metode for å evaluere en no-aflatoksin akkumulering fenotype i enkelte anlegg, som bladene viser ingen symptomer ved soppinfeksjon i underjordiske pods. I tillegg har de ikke-normalfordelt akkumulering av aflatoksiner, og behovet for store prøver for kjemisk analyse 15,16 hindret kvantifisering av RNAi potensiell effekt på en enkelt plante. Metoden som presenteres her består av 72 timers forsøk under anvendelse av fem frø for å utføre tre 24-timers-samplings intervall i triplikat (tabell 1, figur 7). Sammenlignet med den typiske aflatoksin analyse som krever ikke mindre enn 100 g av frø, er vår metode spesielt egnet for individual transgene hendelser peanut planter som i utgangspunktet produserer ikke mer enn to eller tre pods.

RNA-mediert stanse av aflatoksin syntese har blitt demonstrert av genetisk trans Aspergillus flavus og A. parasiticus. Siden aflR er en viktig regulator av aflatoksin produksjon i A. flavus og A. parasiticus 44,45, blir det et interessant mål for RNA-mediert stanse i planter. Imidlertid har genetiske variasjoner i aflR vist seg blant Aspergillus arter 46, og disse genetiske varianter kunne unnslippe stanse hvis det ikke er perfekt sekvens passer med RNAi signal som produseres i plantevert. Dermed aflR var ett av målene for lyddemping i vektor p5XCAPD, men var ikke den eneste. Inverterte gjentakelser av aflR genet innført i A. flavus og A. parasiticus ved transformasjon resulterte i lyddemping og minimal eller ingen produktion av aflatoksiner 47 (McDonald et al., 2005b). Også stanse AFLD genet forhindret aflatoksin produksjonen med opptil 98% i A. flavus og A. parasiticus i direkte transformasjon 48. For å øke sannsynligheten for å lykkes i vårt system, ble peanut transformert med invertert gjenta fragmenter av fem gener som er involvert i aflatoksin produksjon i A. flavus. Her er det vist at bruk p5XCAPD som er rettet for å kneble flere gener i aflatoksin syntese sti, 90% -100% lavere nivåer av aflatoksin B 1 og B 2 ble oppnådd i tråd 288-72, og 60-100% lavere nivåer akkumulert i linje 288 til 74 sammenlignet med kontrollen, når halvparten cotyledons ble inokulert med A. flavus, Figurene 4, 7. Viktigst denne fremgangsmåte påvises statistisk signifikante forskjeller i aflatoksin akkumulering av linjer 288-72, 288-74 vs. kontroll i hele eksperimentet ved å bruke parametrisk statistics, figur 7. Gitt den lille størrelsen på utvalget, er det viktig å understreke behovet for å bruke en kraftig metode for å detektere aflatoksiner, ble disse eksperimentene analysert ved UPLC som har en høy oppløsning, fem ganger høyere ytelse og tre ganger høyere følsomhet enn HPLC 49.

Uttrykk for RNAi innsatsen i 288-74 ble bare påvist i umodne cotyledons (gule) på 24 timers inkubasjon. RNAi innsatsen ble ikke oppdaget av RT-PCR på modne cotyledons av 288-74 på 24 timer, eller på noen forfall gruppe på 48 timer, figur 6. Det samme fenomenet ble observert i andre RNAi transgene peanut linjer (Arias, RS, 2015 upublisert), hvor vanligvis RNAi transkripsjoner ble bare oppdaget på umodne cotyledons på 24 timer. RNA-prøvene ble behandlet med DNAse før cDNA-syntese, dataene ble normalisert til nivået av aktin ekspresjon og ingen tegn på DNA-kontaminering ble observert. Dersom DNA som har vært til stede i prøvene, bør deter påvist i de 48 hr prøver også, men konsekvent det var ikke tilfelle. Ekspresjon under kontroll av 35S-promoteren er ikke alltid ensartet; det kan påvirkes av miljøforhold 50, typen av vev og utviklingsstadiet 51,52. På samme tid, i banen til RNA-interferens, kan hastigheten av mRNA-forfall, og frekvensen av siRNA forråtnelse variere betydelig 53. Det er mulig at den raske nedbrytning av mRNA ved mekanismen av RNA interferens kunne forhindret mRNA-deteksjon ved 48 timers inkubering. Enten fravær av uttrykk på 48 timer var grunnet lav 35S-promoter drevet transkripsjon, eller til rask nedbrytning av dsrna av dicer gjenstår å bli besvart. Dermed vil påvisning av små RNA med høy throughput sequencing gi en bedre innsikt i de prosessene som foregår gjennom RNAi 54 i disse forsøkene. Men siden RNA Slå sprer systemisk, hovedsakelig gjennom barken fra photosynthater kilder til sukrose synker (i dette tilfellet peanut frø) 55, ved å stanse all aflatoksin-syntese kan oppstå i frø uten lokal uttrykk for RNAi innsatsen. Mye forskning gjenstår å bestemme terskelnivå av små interfererende RNA (siRNAs) som er nødvendige for å forhindre aflatoksin akkumulering i frø. Det er viktig å understreke det faktum at både mRNA ekspresjon av RNAi konstruere (figur 6), og akkumulering av aflatoksiner B 1 og B 2 (figur 7) viser forskjellige resultater for umodne (gul) vs. modne (brun) cotyledons. Peanut planter har ubestemmelige vekst, det vil si, de presenterer ved innhøsting en rekke forfall pods, figur 2. I tillegg frø fra ulike forfalls grupper har ulik kjemisk sammensetning, f.eks., 2,4% sukrose i umodne frø, og 1,9% i modne frø under samme feltforhold 56,57. Derfor, for å forstå den faktiske efficiency av RNA-mediert kontroll av aflatoksin akkumulering, er det viktig å analysere forfall grupper separat.

En naturlig forsvar av peanut frø er produksjon av phytoalexins, som varierer i mangfoldet av stoffer som produseres og deres relative mengder avhengig av modenhet av frø og miljøforhold 58-61, og det er særlig høyere i embryoer i forhold til cotyledons 62. Embryoer har også betydelig høyere konsentrasjoner av nukleinsyrer, både DNA og RNA enn cotyledons (Arias RS, upublisert). Som peanut frø modne, endringer i fysiologi og kjemisk sammensetning oppstår 63. Fenoliske antioksidanter i peanut testa skjema kondensert tanniner med fungistatiske aktivitet 64; Dette er også tydelig i mesocarp farge som gjenspeiler forfall etapper, gul til svart 35, som dens innhold av tanniner og fenoliske forbindelser øker med forfall 65. Således nærvær av testa eller embryoer i forsøket, gitt deres antimikrobielle egenskaper, kan ha begrenset soppvekst, og derfor overvurdert effekten av RNAi stanse, derfor ble de fjernet. Også fjerning av Testa og embryoer bidrar til å begrense de kilder til variasjon i analysen, da halvparten hjerteblad som bærer fosteret vil ha flere phytoalexins og mer RNA-innhold.

I tillegg til analyse ved løpetidsgrupper og fjerning av Testa og embryo i disse forsøkene, er det viktig å påpeke noen flere observasjoner: a) selv om resultatene er vist i opp til 96 timers inkubasjon, er det anbefalt å bruke ikke mer enn 72 hr å oppnå konsistente resultater, som frø blir degradert av 96 timer; og b), mens halvparten cotyledons fra samme frø, men samplet tilfeldig, utgjør ikke helt uavhengige utvalg, RT-PCR og aflatoksin opphopning innenfor transgene hendelser viste minimum variasjon mellom frø. Også en nøyaktig soppspore telle, Inokulumvolumets av 2 ul, og anvendelse av sporer på snittflaten av cotyledons unngå drypp på sidene er viktig å sørge for at de spirer sporer blir utsatt for plantevevet. Vann / agar på platene bør være på 1,5% (w / v), mykere agar fører til avrenning av sporer som vist i det siste bildet i Figur 4 (nederst). Skulle frø periode fra en bestemt hendelse transgen være begrenset, kan sampling gjøres i duplikat i stedet for triplikat å oppnå lignende resultater (dvs. figur 7); vil imidlertid triplikate prøver å redusere standardfeil. Den eneste begrensning med denne metoden er at den krever et meget sensitivt system (UPLC) for aflatoxin påvisning / kvantifisering, men på samme tid dette reduserer sannsynligheten for å overestimere effekten av RNAi aflatoksiner bør ikke bli oppdaget av mindre følsomme metoder.

Som konklusjon, har denne metoden for første gang en pålitelig metode for å studereEffekten av RNAi i kontroll av aflatoksiner. Redusere tiden for et eksperiment fra en hel beskjæring sesong til mindre enn en uke, vil denne metoden enormt akselerere forskning på RNAi-peanut / Aspergillus pathosystem mot utslippsreduksjoner og / eller eliminering av aflatoksiner.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Primers, oligonucleotides DNA Technologies, Coralville, IA, USA n/a
Dneasy Plant Mini Kit Qiagen, Valencia, CA 69106
Czapek Dox agar medium Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA CM0095
Agar Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA BP 1423
Freezer -80 °C n/a n/a
Aluminum Oxide, Al2O3 Fisher Scientific A941
SPE Reservoirs 1.5 ml Grace Davison Discovery Scientific 210011
Frits for 1.5 ml SPE reservoir Grace Davison Discovery Scientific 211401
Autosampler vials Waters Corporation, Milford, MA 186005221
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1 mm x 50 mm, 1.7 mm column Waters Corporation, Milford, MA
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software Thermo Electron Corp., San Jose, CA
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO A6636; A9887; A0138; A0263
Systat Software 12.2 SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA
Trizol reagent Invitrogen, CA 15596-018
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix Invitrogen, CA 11752-050
ABI 7500 Real-Time PCR Lifetechnologies, Grand Island, NY 4406984
Luria Broth-Miller Fisher Scientific R453642
pENTR1A Invitrogen, CA A10462
LR Clonase II enzyme mix Invitrogen, CA 11791-020
T4 DNA Ligase NEB Biolabs M0202L
Gelrite Sigma-Aldrich, St. Louis, MO G1919
Acetosyringone Sigma-Aldrich, St. Louis, MO D134406
QIAcube robot workstation Qiagen, Valencia, CA 9001292
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin Goldbio, St. Louis, MO cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Invitrogen, CA 11304-029

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Williams, J. H., et al. Human aflatoxicosis in developing countries: a review of toxicology, exposure, potential health consequences, and interventions. The American Journal of Clinical Nutrition. 80, 1106-1122 (2004).
  2. American Association for Cancer Research: AACR. An evaluation of chemicals and industrial processes associated with cancer in humans based on human and animal data: IARC Monographs Volumes 1 to 20. Cancer Research. 40, 1-12 (1980).
  3. Turner, P. C. The molecular epidemiology of chronic aflatoxin driven impaired child growth. Scientifica. , (2013).
  4. Rasooly, R., Hernlem, B., He, X., Friedman, M. Non-linear relationships between aflatoxin B1 levels and the biological response of monkey kidney vero cells. Toxins (Basel). 5, 1447-1461 (2013).
  5. Gong, Y. Y., et al. Determinants of aflatoxin exposure in young children from Benin and Togo, West Africa: the critical role of weaning. International Journal of Epidemiology. 32, 556-562 (2003).
  6. Eaton, D. L., Groopman, J. D. The toxicology of aflatoxins: human health, veterinary, and agricultural significance. , Academic Press. (1994).
  7. Murugavel, K. G., et al. Prevalence of aflatoxin B1 in liver biopsies of proven hepatocellular carcinoma in India determined by an in-house immunoperoxidase test. Journal of Medical Microbiology. 56, 1455-1459 (2007).
  8. Wang, J. S., et al. Hepatocellular carcinoma and aflatoxin exposure in Zhuqing Village, Fusui County, People's Republic of China. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 10, American Association for Cancer Research. 143-146 (2001).
  9. Azziz-Baumgartner, E., et al. Case-control study of an acute aflatoxicosis outbreak, Kenya, 2004. Environmental Health Perspectives. 113, 1779-1783 (2005).
  10. Lye, M. S., Ghazali, A. A., Mohan, J., Alwin, N., Nair, R. C. An outbreak of acute hepatic encephalopathy due to severe aflatoxicosis in Malaysia. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 53, 68-72 (1995).
  11. Villers, P. Aflatoxins and safe storage. Frontiers in Microbiology. 5, 158 (2014).
  12. Kensler, T. W., Roebuck, B. D., Wogan, G. N., Groopman, J. D. Aflatoxin: A 50-year odyssey of mechanistic and translational toxicology. Toxicological Sciences. 120, S28-S48 (2011).
  13. Dorner, J. W., Cole, R. J., Wicklow, D. T. Aflatoxin reduction in corn through field application of competitive fungi. Journal of Food Protection. 62, 650-656 (1999).
  14. Cotty, P. J., Bhatnagar, D. Variability among atoxigenic Aspergillus flavus strains in ability to prevent aflatoxin contamination and production of aflatoxin biosynthetic-pathway enzymes. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2248-2251 (1994).
  15. Whitaker, T. B. Standardisation of mycotoxin sampling procedures: an urgent necessity. Food Control. 14, 233-237 (2003).
  16. Whitaker, T. B., Dorner, J. W., Giesbrecht, F. G., Slate, A. B. Variability among aflatoxin test results on runner peanuts harvested from small field plots. Peanut Science. 31, 59-63 (2004).
  17. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  18. Rafael, D., et al. EMT blockage strategies: Targeting Akt dependent mechanisms for breast cancer metastatic behaviour modulation. Current Gene Therapy. , (2015).
  19. Li, G., Chang, H., Zhai, Y. P., Xu, W. Targeted silencing of inhibitors of apoptosis proteins with siRNAs: a potential anti-cancer strategy for hepatocellular carcinoma. Asian Pacific. Journal of Cancer Prevention: APJCP. 14, 4943-4952 (2013).
  20. Koldehoff, M. Targeting bcr-abl transcripts with siRNAs in an imatinib-resistant chronic myeloid leukemia patient: challenges and future directions. Methods in Molecular Biology. 1218, 277-292 (2015).
  21. Zhang, J., et al. Pest control. Full crop protection from an insect pest by expression of long double-stranded RNAs in plastids. Science. 347, 991-994 (2015).
  22. Ajjappala, H., Chung, H. Y., Sim, J. S., Choi, I., Hahn, B. S. Disruption of prefoldin-2 protein synthesis in root-knot nematodes via host-mediated gene silencing efficiently reduces nematode numbers and thus protects plants. Planta. 241, 773-787 (2015).
  23. Jose, A. M., Hunter, C. P. Transport of sequence-specific RNA interference information between cells. Annual Review of Genetics. 41, 305-330 (2007).
  24. Vazquez, F., Hohn, T. Biogenesis and biological activity of secondary siRNAs in plants. Scientifica. , Hindawi Publishing Corporation. (2013).
  25. Tinoco, M. L. P., Dias, B. B. A., Dall'Astta, R. C., Pamphile, J. A., Aragao, F. J. L. In vivo trans-specific gene silencing in fungal cells by in planta expression of a double-stranded RNA. BMC Biology. 8, (2010).
  26. Govindarajulu, M., Epstein, L., Wroblewski, T., Michelmore, R. W. Host-induced gene silencing inhibits the biotrophic pathogen causing downy mildew of lettuce. Plant Biotechnology Journal. , (2014).
  27. Yin, C., Jurgenson, J. E., Hulbert, S. H. Development of a host-induced RNAi system in the wheat stripe rust fungus Puccinia striiformis f. sp. tritici. Molecular Plant-Microbe Interactions. 24, 554-561 (2011).
  28. Ghag, S. B., Shekhawat, U. K., Ganapathi, T. R. Host-induced post-transcriptional hairpin RNA-mediated gene silencing of vital fungal genes confers efficient resistance against Fusarium. wilt in banana. Plant Biotechnology Journal. 12, 541-553 (2014).
  29. Filichkin, S. A., et al. Efficiency of gene silencing repeats vs. transitive RNAi in Arabidopsis: direct inverted vectors. Plant Biotechnology Journal. 5, 615-626 (2007).
  30. Sciaky, D., Montoya, A. L., Chilton, M. D. Fingerprints of Agrobacterium Ti Plasmids. Plasmid. 1, 238-253 (1978).
  31. Clark, D. J., Maaloe, O. DNA Replication and Division Cycle in Escherichia coli. Journal of Molecular Biology. 23, 99-112 (1967).
  32. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plantarum. 15, 473-497 (1962).
  33. Srinivasan, T., Kumar, K. R. R., Kirti, P. B. Establishment of efficient and rapid regeneration system for some diploid wild species of Arachis. Plant Cell Tissue and Organ Culture. 101, 303-309 (2010).
  34. Gomes, A. L. V., et al. Single-tube nested PCR using immobilized internal primers for the identification of dengue virus serotypes. Journal of Virology Methods. 145, 76-79 (2007).
  35. Williams, E. J., Drexler, J. S. A non-destructive method for determining peanut pod maturity. Peanut Science. 8, 134-141 (1981).
  36. Sobolev, V. S., Dorner, J. W. Cleanup procedure for determination of aflatoxins in major agricultural commodities by liquid chromatography. Journal of AOAC International. 85, 642-645 (2002).
  37. Empower Software, Getting Started Guide. , Waters Corporation. Milford, MA. Available from: http://sites.chem.colostate.edu/diverdi/C431/experiments/high%20pressure%20liquid%20chromatography/references/Empower%20getting%20started%2071500031203rA.pdf (2002).
  38. Biselli, S., Hartig, L., Wegner, H., Hummert, C. Analysis of Fusarium. toxins using LC-MS-MS: Application to various food and feed matrices. LC GC North America. 23, 404-413 (2005).
  39. Arias, R. S., Sobolev, V. S., Orner, V. A., Dang, P. M., Lamb, M. C. Potential involvement of Aspergillus flavus laccases in peanut invasion at low water potential. Plant Pathology. 63, 353-363 (2014).
  40. Dang, P. M., Chen, C. Y., Holbrook, C. C. Evaluation of five peanut (Arachis hypogaea) genotypes to identify drought responsive mechanisms utilising candidate-gene approach. Functional Plant Biology. 40, 1323-1333 (2013).
  41. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C-T method. Nature Protocols. 3, 1101-1108 (2008).
  42. Amaike, S., Keller, N. P. Aspergillus flavus. Annual Review of Phytopathology. 49, 107-133 (2011).
  43. Nowara, D., et al. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen Blumeria graminis. Plant Cell. 22, 3130-3141 (2010).
  44. Woloshuk, C. P., et al. Molecular characterization of aflR, a regulatory locus for aflatoxin biosynthesis. Applied and Environmental Microbiology. 60, 2408-2414 (1994).
  45. Price, M. S., et al. The aflatoxin pathway regulator AflR induces gene transcription inside and outside of the aflatoxin biosynthetic cluster. FEMS Microbiology Letters. 255, 275-279 (2006).
  46. Ehrlich, K. C., Montalbano, B. G., Cotty, P. J. Sequence comparison of aflR from different Aspergillus. species provides evidence for variability in regulation of aflatoxin production. Fungal Genetics and Biology. 38, 63-74 (2003).
  47. McDonald, T., Brown, D., Keller, N. P., Hammond, T. M. RNA silencing of mycotoxin production in Aspergillus and Fusarium species. Molecular Plant Microbe Interactions. 18, 539-545 (2005).
  48. Abdel-Hadi, A. M., Caley, D. P., Carter, D. R., Magan, N. Control of aflatoxin production of Aspergillus flavus. and Aspergillus parasiticus. using RNA silencing technology by targeting aflD. (nor-1) gene. Toxins (Basel). 3, 647-659 (2011).
  49. Swartz, M. E. Ultra performance liquid chromatography (UPLC): An introduction: Separation Science Redefined. LCGC North America. , Suppl ement 8. 8-14 (2005).
  50. Maghuly, F., Khan, M. A., Fernandez, E. B., Druart, P., Watillon, B., Laimer, M. Stress regulated expression of the GUS-marker gene (uidA) under the control of plant calmodulin and viral 35S promoters in a model fruit tree rootstock: Prunus incisa x serrula. Journal of Biotechnology. 135, 105-116 (2008).
  51. de Mesa, M. C., Santiago-Doménech, N., Pliego-Alfaro, F., Quesada, M. A., Mercado, J. A. The CaMV 35S promoter is highly active on floral organs and pollen of transgenic strawberry plants. Plant Cell Reports. 23, 32-38 (2004).
  52. Sunilkumar, G., Mohr, L., Lopata-Finch, E., Emani, C., Rathore, K. S. Developmental and tissue-specific expression of CaMV 35S promoter in cotton as revealed by GFP. Plant Molecular Biology. 50, 463-474 (2002).
  53. Groenenboom, M. A. C., Maree, A. F. M., Hogeweg, P. The RNA silencing pathway: The bits and pieces that matter. PLoS Computational Biology. 1, 155-165 (2005).
  54. Zhao, D., Song, G. Q. High-throughput sequencing as an effective approach in profiling small RNAs derived from a hairpin RNA expression vector in woody plants. Plant Science: an International Journal of Experimental Plant Biology. 228, 39-47 (2014).
  55. Kamthan, A., Chauduri, A., Kamthan, M., Datta, A. Small RNAs in plants: recent development and application for crop improvement. Frontiers in Plant Science. 6, 208 (2015).
  56. Manda, A., Bodapati, P. N., Rachaputi, N. C., Wright, G., Fukai, S. Aflatoxins and their relationship with sugars in peanut (Arachis hypogaea L). 4th International Crop Science Congress, 2004, , Available from: http://www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/5/1/3/625_manda.htm (2004).
  57. Uppala, S. S. Factors affecting pre-harvest aflatoxin contamination of peanut (Arachis hypogaea L). , Auburn University. (2011).
  58. Sobolev, V. S. Localized production of phytoalexins by peanut (Arachis hypogaea) kernels in response to invasion by Aspergillus species. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 56, 1949-1954 (2008).
  59. Sobolev, V. S., Guo, B. Z., Holbrook, C. C., Lynch, R. E. Interrelationship of phytoalexin production and disease resistance in selected peanut genotypes. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 55, 2195-2200 (2007).
  60. Sobolev, V. S., Neff, S. A., Gloer, J. B. New stilbenoids from peanut (Arachis hypogaea) seeds challenged by an Aspergillus caelatus strain. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 57, 62-68 (2009).
  61. Dorner, J. W., Cole, R. J., Sanders, T. H., Blankenship, P. D. Interrelationship of kernel water activity, soil temperature, maturity, and phytoalexin production in preharvest aflatoxin contamination of drought-stressed peanuts. Mycopathologia. 105, 117-128 (1989).
  62. Sobolev, V. S. Production of phytoalexins in peanut (Arachis hypogaea) seed elicited by selected microorganisms. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 61, 1850-1858 (2013).
  63. Basha, S. M. M., Cherry, J. P., Young, C. T. Changes in free amino acids, carbohydrates, and proteins of maturing seeds from various peanut (Arachis hypogaea L.) cultivars. Cereal Chemistry. 53, 586-596 (1976).
  64. Lansden, J. A. Aflatoxin inhibition and fungistasis by peanut tannins. Peanut Science. 9, 17-20 (1982).
  65. Yen, G. C., Duh, P. D., Tsai, C. L. Relationships between antioxidant activity and maturity of peanut hulls. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 41, 67-70 (1993).

Tags

Environmental Sciences RNA interferens Silencing groundnut frø transgene,
RNAi-mediert Kontroll av Aflatoksiner i Peanut: Metode for å analysere mykotoksin Produksjon og transgene uttrykk i Peanut /<em&gt; Aspergillus</em&gt; Pathosystem
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev,… More

Arias, R. S., Dang, P. M., Sobolev, V. S. RNAi-mediated Control of Aflatoxins in Peanut: Method to Analyze Mycotoxin Production and Transgene Expression in the Peanut/Aspergillus Pathosystem. J. Vis. Exp. (106), e53398, doi:10.3791/53398 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter