Vi visar en metod för analys av aflatoxiner och transgenexpression i jordnötter frön som innehåller RNA-interferens signaler för att tysta aflatoxin-syntesgener i svampen Aspergillus flavus. RNAi-medierad kontroll av mykotoxiner i växter har inte tidigare rapporterats.
Livsmedels- och jordbruksorganisation FN uppskattar att 25% av livsmedelsgrödor i världen är kontaminerade med aflatoxiner. Det motsvarar 100 miljoner ton livsmedel förstörs eller omdirigeras till icke-livsmedel varje år. Aflatoxiner är kraftfulla cancerframkallande normalt ackumulerade av svampen Aspergillus flavus och A. parasiticus för spannmål, nötter, rotfrukter och andra jordbruksprodukter. Tysta fem aflatoxin-syntes gener genom RNA-interferens (RNAi) i jordnötsplantor användes för att styra aflatoxin ackumulering efter ympning med A. flavus. Tidigare fanns ingen metod för att analysera effekten av RNAi i enskilda jordnötssmör transgena händelser, eftersom de vanligtvis producerar några frön och traditionella metoder för stora fältförsök i aflatoxin-främjar villkor inte ett alternativ. På fältet är sannolikheten att finna naturligt förorenade frön ofta 1/100 till 1/1,000. Dessutom är halten aflatoxiner inte jämnt fördelade. Vår metod använder några frön per transgen event, med små bitar som behandlats för realtids-PCR (RT-PCR) eller små RNA-sekvensering, och för analys av aflatoxin ackumulering av ultra-vätskekromatografi (UPLC). RNAi-uttryck jordnöt linjer 288-72 och 288-74, visade upp till 100% reduktion (p≤0.01) i aflatoxin B 1 och B 2 jämfört med kontrollen som samlats upp till 14.000 ng. G -1 av aflatoxin B 1 när inokulerades med aflatoxigenic A. flavus. Som referens, är den maximala summan av aflatoxiner tillåtna för mänsklig konsumtion i USA 20 ng. G -1. Detta protokoll beskriver tillämpningen av RNAi-medierad kontroll av aflatoxiner i transgena jordnötssmör frön och metoder för utvärdering. Vi anser att dess tillämpning i avel av jordnötter och andra grödor kommer att ge snabba framsteg inom detta viktiga område av vetenskap, Medicin och människoföda, och kommer att bidra avsevärt till de internationella insatserna för att kontrollera aflatoxiner, och eventuellt andra mykotoxiner i viktiga livsmedelsgrödor.
Ungefär 4,5 miljarder människor är kroniskt utsätts för aflatoxiner 1, den mest kraftfulla cancerframkallande kända i naturen 2. Dessa mykotoxiner förorena 25% av livsmedelsgrödor i världen 3, inklusive majs, kassava, ris, nötter, spannmål och kryddor. 4. Aflatoxiner orsaka dvärgväxt hos barn 5, försämra immunförsvaret 6, finns i 58% av hepatocellulära-karcinom i mänskliga biopsier 7,8, och döda hundratals människor under periodiska utbrotten av aflatoxicosis 9,10. Aflatoxiner är polyketid härledda mykotoxiner normalt produceras av Aspergillus flavus och A. parasiticus; aflatoxiner B 1 och B 2 produceras av A. flavus, medan A. parasiticus producerar också G 1 och G 2. Den kemiska strukturen hos dessa föreningar och ett kromatogram som visar deras separation genom UPLC visas i figur 1. </strong>
Figur 1. Aflatoxiner och RNAi infoga Top. Kemiska struktur (till vänster) och exempel på kromatogrammet (höger) av de fyra vanligaste polyketid härrörande aflatoxiner: B 1, B 2, G 1 och G 2, som framställts av Aspergillus parasiticus, A . flavus producerar B 1 och B 2 Nederst: Schematisk bild av genfragment i RNAi konstruera p5XCAPD används för jordnöt transformation, siffror enligt pilar är gen-fragment anslutningsnummer i Aspergillus flavus genomet;. PIV2: potatis intron; bp: baspar; RT_5X_1 och RT_5X_2. Realtids-PCR primerställena Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Ekonomiska förluster i exporten på grund av aflatoxiner i jordnötter enbart överstiger $ 450 miljoner US-dollar om beräknas baserat på 4 ng. G -1 gränsen för aflatoxin tillåtas för livsmedel i EU 11. Aflatoxiner har varit känt i 60 år 12; Men, även om många jordbruksmetoder har utvecklats för att lindra deras effekt, inklusive tillämpning av andra svampstammar 13,14, finns ingen konsekvent metod för kontroll och resistenta växtsorter är inte tillgängliga. Testning växt arvsmassa för resistens mot aflatoxiner är särskilt svårt, eftersom även under gynnsamma förhållanden för patogen invasion, är oförutsägbar mykotoxiner ackumulering och inte följer en normalfördelning. Således, experiment kräver oftast stora planteringsområden, hundratals frön och flera prover av 100-1,700 g för att minska variationen i data 15,16.
RNA-interferens varupptäcktes 1998 17; och fördelarna med "tysta" är för närvarande undersöks i ett antal nya applikationer, t ex. i mänskliga terapier mot metastaserande bröstcancer 18, levercancer 19, myeloid leukemi 20, och växtskydd mot insekter 21 och nematoder 22. I växter, kan RNA-interferens signaler cell till cell, med små störande RNA (siRNA) och hög molekylvikt RNA är ansvarig för system posttranskriptionell genen tysta 23,24, även inne svamp patogener som är i nära kontakt med växtvärd 25. Effekten av RNAi på växt-medierad tysta svamp-patogen gener har beskrivits i några växt pathosystems, för dessa, visuell undersökning av symptom i antenn delar av växter (blad) får sjukdomen kvantifiering, dvs Algsvampar Bremia i sallat 26 , Puccinia i vete <sup> 27 och Fusarium i banan 28. Mycket svårare är att utvärdera RNAi effektivitet för att kontrollera mykotoxiner i växter, särskilt aflatoxiner i jordnötter som bladen visar några symtom på infektion, organ invaderade (frön) är under flera inches av jord, är oförutsägbar, och endast kemiska förekomsten av infektion analys kan fastställa förekomsten av aflatoxiner. Dessutom har varje transgen händelse i jordnöts producerar normalt några frön (4-6 per anläggning); därför inte är möjligt traditionell testning för en no-aflatoxin ackumulering drag i stora fält tomter, som varar hela odlingssäsonger, och med hjälp av hundratals frön. En metod beskrivs här för att analysera mindre än en vecka, RNAi jordnötter frön för förekomst av transgen och för en no-aflatoxin ackumulering drag, med enbart några frön.
Växt-värd RNAi-medierad tysta gener i svamppatogener har demonstrerats 27,43, finns det dock inga publikationer som visar genomförbarheten av RNAi-medierad reglering av mykotoxiner ackumulering i växter. En begränsande faktor för dessa studier i jordnötter var avsaknaden av en metod för att utvärdera en no-aflatoxin ackumulering fenotyp i enskilda anläggningar, som löv visar inga symptom vid svampinfektion i underjordiska skida. Dessutom har inte-normalfördelad ackumulering av aflatoxiner, och behovet av stora prover för kemisk analys 15,16 hindrade kvantifiering av potentiella RNAi effekt på en enda anläggning. Den metod som presenteras här består av 72 timmar experiment med fem frön att utföra tre 24 hr-intervall provtagningar i tre exemplar (tabell 1, figur 7). Jämfört med den typiska aflatoxinanalys som kräver inte mindre än 100 g frön, är vår metod särskilt lämplig för individualiseradel transgena händelser jordnötsplantor som initialt producerar mer än två eller tre baljor.
RNA-medierad tysta aflatoxin syntes har visats genom genetiskt omvandla Aspergillus flavus och A. parasiticus. Eftersom aflR är en viktig regulator av aflatoxin produktion A. flavus och A. parasiticus 44,45, blir det en intressant mål för RNA-medierad tysta i växter. Emellertid har genetiska variationer i aflR visats bland Aspergillus arter 46, och de genetiska varianter kunde undkomma tysta om det inte finns någon perfekt sekvens matchning med RNAi-signalen som produceras i växtvärden. Således, aflR var ett av målen för tysta i vektor p5XCAPD, men var inte den enda. Inverterade upprepningar av aflR gen införd i A. flavus och A. parasiticus genom ombildning resulterade i att tysta och minimal eller ingen produktion av aflatoxiner 47 (McDonald et al., 2005b). Också, tysta Afld gen förhindrade aflatoxinproduktionen med upp till 98% i A. flavus och A. parasiticus i direkt transformation 48. För att öka sannolikheten för framgång i vårt system, var jordnöt transformerad med inverterade upprepade fragment av fem gener som är involverade i aflatoxin produktion A. flavus. Här visas att användning av p5XCAPD som riktar sig till tysta flera gener i aflatoxin syntesväg, 90% -100% lägre nivåer av aflatoxin B 1 och B 2 uppnåddes i linje 288-72, och 60-100% lägre nivåer samlats i linjen 288-74 jämfört med kontrollen, när halva kotyledoner inokulerades med A. flavus, figurerna 4, 7. Viktigast denna metod upptäcktes statistiskt signifikanta skillnader i aflatoxin ackumulering av linjerna 288-72, 288-74 kontra kontroll hela experimentet genom att tillämpa parametrisk statistics, figur 7. Med tanke på små provmängder, är det viktigt att framhålla behovet av att använda en kraftfull metod för att upptäcka aflatoxiner, var dessa experiment analyserats UPLC som har en hög upplösning, fem gånger högre prestanda och tre gånger högre känslighet än HPLC 49.
Expression av RNAi insatsen i 288-74 endast påvisas i omogna hjärtbladen (gul) vid 24 h inkubation. RNAi insatsen inte upptäcks av RT-PCR på mogna kotyledoner av 288-74 vid 24 timmar, eller på eventuell löptidsgrupp på 48 timmar, figur 6. Samma fenomen observerades i andra RNAi transgena jordnötter linjer (Arias, RS, 2015 opublicerad), där vanligtvis RNAi transkript endast detekterades på omogna hjärtbladen på 24 timmar. RNA-prov behandlades med DNAs före cDNA-syntes, data som normaliserades till den nivå av aktin-expression och inget bevis på DNA-förorening observerades. Skulle DNA har funnits i proven, bör dethar upptäckts i de 48 hr proverna också, men genomgående så var inte fallet. Expression under kontroll av 35S-promotorn är inte alltid enhetlig; Det kan påverkas av miljöförhållanden 50, typ av vävnad och utvecklingsstadiet 51,52. Samtidigt, i vägen för RNA-interferens kan hastigheten av mRNA förfall och hastigheten för siRNA förfall variera signifikant 53. Det är möjligt att den snabba nedbrytningen av mRNA genom mekanismen för RNA-interferens kunde ha förhindrat mRNA detektion vid 48 h inkubation. Huruvida avsaknad av uttryck vid 48 timmar var på grund av låga 35S-promotorn driven transkription, eller snabb nedbrytning av dsRNA av Dicer återstår att besvara. Således skulle detektering av små RNA från hög genomströmning sekvensering ger en bättre insikt om de processer som äger rum genom RNAi 54 i dessa experiment. Eftersom RNA tysta sprider system, främst genom floemet från photosynthatar källor till sackaros sänkor (i detta fall jordnötter frön) 55, den tysta aflatoxin-syntes kan förekomma i frön utan lokal uttryck av RNAi insatsen. Mycket forskning återstår att göra för att fastställa tröskelvärdet för små störande RNA (siRNA) är nödvändiga för att förhindra aflatoxin ackumulering i frön. Det är viktigt att understryka det faktum att båda mRNA uttryck av RNAi konstruktionen (Figur 6), och ackumulering av aflatoxiner B 1 och B 2 (Figur 7) visade olika resultat för omogna (gul) vs. mogna (brun) kotyledoner. Jordnötsplantor har obestämd tillväxt, det vill säga, presenterar de vid skörd en rad löptider skida, figur 2. Dessutom frön från olika löptid grupper skiljer sig åt i deras kemiska sammansättning, till exempel., 2,4% sackaros i omogna frön, och 1,9% i mogna frön under samma fältförhållanden 56,57. Således, för att förstå den verkliga effektiviteten såy av RNA-medierad kontroll av aflatoxin ackumulering, är det viktigt att analysera löptidsgrupper separat.
En naturlig försvar av jordnötter frön är produktionen av fytoalexiner, som varierar i olika föreningar som produceras och deras relativa mängder beroende på löptid frön och miljöförhållanden 58-61, och det är särskilt hög i embryon jämfört med hjärtbladen 62. Embryon har också signifikant högre koncentrationer av nukleinsyror, både DNA och RNA än hjärtbladen (Arias RS, opublicerad). Som jordnötter frön mogna, förändringar i fysiologi och kemiska sammansättning förekommer 63. Fenolantioxidanter i jordnöts testa bildar kondenserade tanniner med fungistatisk aktivitet 64; Detta är också tydligt i mesocarp färg som speglar mognadsstadier, gult till svart 35, som dess innehåll av tanniner och fenolföreningar ökar med förfall 65. Sålunda närvaro av testa eller embryon i experimentet, med tanke på deras antimikrobiella egenskaper, kunde ha begränsat svamptillväxt och därför överskattat effekten av RNAi tysta, därför var de bort. Även avlägsnande av testa och embryon hjälper begränsa källorna till variation i analysen, eftersom den halva cotyledon som bär embryot kommer att ha fler fytoalexiner och mer RNA innehåll.
Utöver analysen av löptidsgrupper och avlägsnande av testa och embryo i dessa experiment, är det viktigt att påpeka några fler observationer: a) om resultaten visas för upp till 96 timmars inkubation, rekommenderas att inte använda mer än 72 hr att få konsekventa resultat, eftersom frön får försämras med 96 h; och b) medan hälften kotyledoner från samma frö, men slumpmässiga prov, inte utgör helt oberoende prover, RT-PCR och aflatoxin ackumulering inom transgena händelser visade minsta variation mellan frön. Även en noggrann svampspor räkna, inokulat volyms 2 pl och tillämpning av sporer på snittytan av hjärtbladen undvika droppande på sidorna är viktigt att se till de grodda sporerna utsätts för växtvävnaden. Vatten / agar på plattorna bör vara 1,5% (w / v), orsakar mjukare agar avrinningen av sporer som visas på den sista bildrutan i fig 4 (botten). Bör utsäde tillgänglighet från en viss transgen händelse begränsas, kan provtagningen göras i två exemplar i stället för trippel få liknande resultat (dvs figur 7); kommer emellertid triplikatprover bidra till att minska medelfelet. Den enda begränsningen av denna metod är att den kräver ett mycket känsligt system (UPLC) för aflatoxin detektion / kvantifiering, men samtidigt det minskar sannolikheten för att överskatta effekten av RNAi bör aflatoxiner inte upptäckas av mindre känsliga metoder.
Sammanfattningsvis erbjuder denna metod för första gången en tillförlitlig metod för att studeraeffekten av RNAi i kontrollen av aflatoxiner. Minska tiden för ett experiment från en hel odlingssäsong till mindre än en vecka, kommer denna metod oerhört påskynda forskningen om RNAi-jordnöt / Aspergillus pathosystem mot begränsning och / eller eliminering av aflatoxiner.
The authors have nothing to disclose.
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
Primers, oligonucleotides | DNA Technologies, Coralville, IA, USA | n/a | |
Dneasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69106 | |
Czapek Dox agar medium | Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | CM0095 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | BP 1423 | |
Freezer -80°C | n/a | n/a | |
Aluminum Oxide, Al2O3 | Fisher Scientific | A941 | |
SPE Reservoirs 1.5 mL | Grace Davison Discovery Scientific | 210011 | |
Frits for 1.5 mL SPE reservoir | Grace Davison Discovery Scientific | 211401 | |
Autosampler vials | Waters Corporation, Milford, MA | 186005221 | |
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software | Thermo Electron Corp., San Jose, CA | ||
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A6636; A9887; A0138; A0263 | |
Systat Software 12.2 | SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA | ||
Trizol reagent | Invitrogen, CA | 15596-018 | |
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix | Invitrogen, CA | 11752-050 | |
ABI 7500 Real-Time PCR | Lifetechnologies, Grand Island, NY | 4406984 | |
Luria Broth-Miller | Fisher Scientific | R453642 | |
pENTR1A | Invitrogen, CA | A10462 | |
LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-020 | |
T4 DNA Ligase | NEB Biolabs | M0202L | |
Gelrite | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1919 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406 | |
QIAcube robot workstation | Qiagen, Valencia, CA | 9001292 | |
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin | Goldbio, St. Louis, MO | cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, CA | 11304-029 |