Vi viser en metode for analyse av aflatoksiner og transgene ekspresjon i peanut frø som inneholder RNA-interferenssignaler for lyddemping aflatoksin-syntese-genene i soppen Aspergillus flavus. RNAi-formidlet kontroll av mykotoksiner i planter har ikke tidligere blitt rapportert.
Food and Agriculture Organization of the United Nations anslår at 25% av matplanter i verden er forurenset med aflatoksiner. Som representerer 100 millioner tonn mat blir ødelagt eller viderekoblet til ikke-konsum hvert år. Aflatoksiner er kraftige karsinogener normalt akkumulert av sopp Aspergillus flavus og A. parasiticus i korn, nøtter, rot avlinger og andre landbruksprodukter. Stanse av fem aflatoksin-syntese gener ved RNA-interferens (RNAi) i peanut planter ble brukt til å kontrollere aflatoksin akkumulering etter inokulering med A. flavus. Tidligere ingen metode eksisterte for å analysere effekten av RNAi i enkelte peanut transgene hendelser, da disse vanligvis produserer noen frø, og tradisjonelle metoder for store feltforsøk etter aflatoksin-bidrar forholdene var ikke et alternativ. I feltet, er sannsynligheten for å finne naturlig forurensede frø ofte 1/100 til 1/1000. I tillegg er aflatoksin forurensning ikke er jevnt fordelt. Vår metode bruker noen frø per transgen hendelse, med små biter bearbeidet for real-time PCR (RT-PCR) eller små RNA sekvensering, og for analyse av aflatoksin akkumulering av ultra-væskekromatografi (UPLC). RNAi-uttrykke peanut linjer 288-72 og 288-74, møtte opp til 100% reduksjon (p≤0.01) i aflatoksin B 1 og B 2 sammenlignet med kontrollgruppen som akkumulert opp til 14 000 ng. G -1 av aflatoksin B 1 når inokulert med aflatoxigenic A. flavus. Som referanse, er den maksimale totalt aflatoksiner tillatte for konsum i USA 20 ng. G -1. Denne protokollen beskriver anvendelsen av RNAi-mediert kontroll av aflatoksiner i transgene peanut frø og metoder for sin vurdering. Vi tror at dens anvendelse i avl av peanut og andre avlinger vil bringe raske utviklingen innen dette viktige området av vitenskap, Medisin og human ernæring, og vil bidra vesentlig til den internasjonale innsatsen for å kontrollere aflatoksiner, og potensielt andre mykotoksiner i store matplanter.
Omtrent 4,5 milliarder mennesker er kronisk utsatt for aflatoksiner 1, de mektigste karsinogener kjent i naturen 2. Disse mykotoksiner forurense 25% av matplanter i verden 3, inkludert mais, kassava, ris, nøtter, korn og krydder. 4. Aflatoksiner årsak stunting hos barn 5, svekke immunforsvaret 6, er til stede i 58% av hepatocellulært-karsinom i menneske biopsier 7,8, og drepe hundrevis av mennesker i løpet av periodiske utbrudd av aflatoxicosis 9,10. Aflatoksiner er polyketide-avledet mykotoksiner som normalt blir produsert av Aspergillus flavus og A. parasiticus; aflatoksiner B 1 og B 2 er produsert av A. flavus, mens A. parasiticus også produserer G 1 og G 2. Den kjemiske struktur av disse forbindelser og et kromatogram som viser deres separasjon ved UPLC er vist i figur 1. </strong>
Figur 1. Aflatoksiner og RNAi sett Top:. Kjemiske strukturen (venstre) og eksempel på kromatogram (høyre) av de fire vanligste polyketide-avledet aflatoksiner: B 1, B 2, G 1 og G 2, produsert av Aspergillus parasiticus, A . flavus produserer B 1 og B 2 Bunn: Skjematisk av genfragmenter i RNAi konstruere p5XCAPD brukes for peanut transformasjon, tall i henhold til pilene er gen-fragment deponeringsnummer i Aspergillus flavus genomet;. PIV2: potet intron; bp: basepar; RT_5X_1 og RT_5X_2. Real-Time PCR primer nettsider Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Økonomiske tap i eksporten som følge av aflatoksiner i peanut alene overstige $ 450 millioner amerikanske dollar hvis beregnet basert på 4 ng. G -1 grense på aflatoksin tillatt for konsum i EU 11. Aflatoksiner har vært kjent i 60 år 12; Men selv om mange jordbrukspraksis ble utviklet for å redusere deres effekt, herunder anvendelse av andre soppstammer 13,14 finnes det ingen konsistent metode for kontroll, og resistente plantesorter er ikke tilgjengelige. Testing anlegg genmateriale for resistens mot aflatoksiner er særlig vanskelig, fordi selv under betingelser som bidrar til patogen invasjon, er mykotoksin akkumulering uforutsigbar og ikke følger en normalfordeling. Dermed eksperimenter krever som regel store plante områder, hundrevis av frø og flere prøver av 100-1,700 g å redusere variabiliteten i dataene 15,16.
RNA interferens varoppdaget i 1998 17; og fordelene ved «stanse» blir nå undersøkt i en rekke nye anvendelser, f.eks., i human terapi mot metastatisk brystkreft 18, leverkreft 19, myeloid leukemi 20, og i plante beskyttelse mot insekter og nematoder 22 21. I planter, kan RNA interferens signalene celle til celle, med små RNA forstyrre (siRNA) og høy molekylvekt RNA være ansvarlig for systemisk posttranskripsjonelt genet stanse 23,24, selv inne sopp patogener som er i nær kontakt med plantevert 25. Effektiviteten av RNAi på plante-mediert stanse av sopp-patogen gener har blitt beskrevet i noen plante pathosystems, for disse, visuell undersøkelse av symptomer i luftig deler av planter (blader) lov sykdom kvantifisering, dvs. oomycete Bremia i salat 26 , puccinia i hvete <sup> 27 og Fusarium i banan 28. Mye mer vanskelig er å evaluere RNAi effektivitet til å kontrollere mykotoksiner i planter, spesielt aflatoksiner i jordnøtter som bladene viser ingen symptomer på infeksjon, organer invaderte (frø) er under flere inches av jord, er uforutsigbar, og bare kjemisk forekomst av infeksjon analyse kan bestemme tilstedeværelsen av aflatoksiner. I tillegg har hver transgen hendelse i peanut normalt produserer noen frø (4-6 per plante); Derfor er tradisjonell testing for en no-aflatoksin akkumulering egenskap i store felt tomter, som varer hele beskjæring sesonger, og ved hjelp av hundrevis av frø ikke gjennomførbart. En metode er beskrevet her for å analysere på mindre enn en uke, RNAi peanut frø for tilstedeværelsen av transgenet og for en no-aflatoksin akkumulering egenskap, ved hjelp av bare noen få frø.
Plante-verts RNAi-mediert stanse av gener i sopp-patogener er demonstrert 27,43, men det er ingen publikasjoner som viser gjennomførbarheten av RNAi-formidlet kontroll av mykotoksin akkumulering i planter. En begrensende faktor for disse studiene i peanut var mangelen på en metode for å evaluere en no-aflatoksin akkumulering fenotype i enkelte anlegg, som bladene viser ingen symptomer ved soppinfeksjon i underjordiske pods. I tillegg har de ikke-normalfordelt akkumulering av aflatoksiner, og behovet for store prøver for kjemisk analyse 15,16 hindret kvantifisering av RNAi potensiell effekt på en enkelt plante. Metoden som presenteres her består av 72 timers forsøk under anvendelse av fem frø for å utføre tre 24-timers-samplings intervall i triplikat (tabell 1, figur 7). Sammenlignet med den typiske aflatoksin analyse som krever ikke mindre enn 100 g av frø, er vår metode spesielt egnet for individual transgene hendelser peanut planter som i utgangspunktet produserer ikke mer enn to eller tre pods.
RNA-mediert stanse av aflatoksin syntese har blitt demonstrert av genetisk trans Aspergillus flavus og A. parasiticus. Siden aflR er en viktig regulator av aflatoksin produksjon i A. flavus og A. parasiticus 44,45, blir det et interessant mål for RNA-mediert stanse i planter. Imidlertid har genetiske variasjoner i aflR vist seg blant Aspergillus arter 46, og disse genetiske varianter kunne unnslippe stanse hvis det ikke er perfekt sekvens passer med RNAi signal som produseres i plantevert. Dermed aflR var ett av målene for lyddemping i vektor p5XCAPD, men var ikke den eneste. Inverterte gjentakelser av aflR genet innført i A. flavus og A. parasiticus ved transformasjon resulterte i lyddemping og minimal eller ingen produktion av aflatoksiner 47 (McDonald et al., 2005b). Også stanse AFLD genet forhindret aflatoksin produksjonen med opptil 98% i A. flavus og A. parasiticus i direkte transformasjon 48. For å øke sannsynligheten for å lykkes i vårt system, ble peanut transformert med invertert gjenta fragmenter av fem gener som er involvert i aflatoksin produksjon i A. flavus. Her er det vist at bruk p5XCAPD som er rettet for å kneble flere gener i aflatoksin syntese sti, 90% -100% lavere nivåer av aflatoksin B 1 og B 2 ble oppnådd i tråd 288-72, og 60-100% lavere nivåer akkumulert i linje 288 til 74 sammenlignet med kontrollen, når halvparten cotyledons ble inokulert med A. flavus, Figurene 4, 7. Viktigst denne fremgangsmåte påvises statistisk signifikante forskjeller i aflatoksin akkumulering av linjer 288-72, 288-74 vs. kontroll i hele eksperimentet ved å bruke parametrisk statistics, figur 7. Gitt den lille størrelsen på utvalget, er det viktig å understreke behovet for å bruke en kraftig metode for å detektere aflatoksiner, ble disse eksperimentene analysert ved UPLC som har en høy oppløsning, fem ganger høyere ytelse og tre ganger høyere følsomhet enn HPLC 49.
Uttrykk for RNAi innsatsen i 288-74 ble bare påvist i umodne cotyledons (gule) på 24 timers inkubasjon. RNAi innsatsen ble ikke oppdaget av RT-PCR på modne cotyledons av 288-74 på 24 timer, eller på noen forfall gruppe på 48 timer, figur 6. Det samme fenomenet ble observert i andre RNAi transgene peanut linjer (Arias, RS, 2015 upublisert), hvor vanligvis RNAi transkripsjoner ble bare oppdaget på umodne cotyledons på 24 timer. RNA-prøvene ble behandlet med DNAse før cDNA-syntese, dataene ble normalisert til nivået av aktin ekspresjon og ingen tegn på DNA-kontaminering ble observert. Dersom DNA som har vært til stede i prøvene, bør deter påvist i de 48 hr prøver også, men konsekvent det var ikke tilfelle. Ekspresjon under kontroll av 35S-promoteren er ikke alltid ensartet; det kan påvirkes av miljøforhold 50, typen av vev og utviklingsstadiet 51,52. På samme tid, i banen til RNA-interferens, kan hastigheten av mRNA-forfall, og frekvensen av siRNA forråtnelse variere betydelig 53. Det er mulig at den raske nedbrytning av mRNA ved mekanismen av RNA interferens kunne forhindret mRNA-deteksjon ved 48 timers inkubering. Enten fravær av uttrykk på 48 timer var grunnet lav 35S-promoter drevet transkripsjon, eller til rask nedbrytning av dsrna av dicer gjenstår å bli besvart. Dermed vil påvisning av små RNA med høy throughput sequencing gi en bedre innsikt i de prosessene som foregår gjennom RNAi 54 i disse forsøkene. Men siden RNA Slå sprer systemisk, hovedsakelig gjennom barken fra photosynthater kilder til sukrose synker (i dette tilfellet peanut frø) 55, ved å stanse all aflatoksin-syntese kan oppstå i frø uten lokal uttrykk for RNAi innsatsen. Mye forskning gjenstår å bestemme terskelnivå av små interfererende RNA (siRNAs) som er nødvendige for å forhindre aflatoksin akkumulering i frø. Det er viktig å understreke det faktum at både mRNA ekspresjon av RNAi konstruere (figur 6), og akkumulering av aflatoksiner B 1 og B 2 (figur 7) viser forskjellige resultater for umodne (gul) vs. modne (brun) cotyledons. Peanut planter har ubestemmelige vekst, det vil si, de presenterer ved innhøsting en rekke forfall pods, figur 2. I tillegg frø fra ulike forfalls grupper har ulik kjemisk sammensetning, f.eks., 2,4% sukrose i umodne frø, og 1,9% i modne frø under samme feltforhold 56,57. Derfor, for å forstå den faktiske efficiency av RNA-mediert kontroll av aflatoksin akkumulering, er det viktig å analysere forfall grupper separat.
En naturlig forsvar av peanut frø er produksjon av phytoalexins, som varierer i mangfoldet av stoffer som produseres og deres relative mengder avhengig av modenhet av frø og miljøforhold 58-61, og det er særlig høyere i embryoer i forhold til cotyledons 62. Embryoer har også betydelig høyere konsentrasjoner av nukleinsyrer, både DNA og RNA enn cotyledons (Arias RS, upublisert). Som peanut frø modne, endringer i fysiologi og kjemisk sammensetning oppstår 63. Fenoliske antioksidanter i peanut testa skjema kondensert tanniner med fungistatiske aktivitet 64; Dette er også tydelig i mesocarp farge som gjenspeiler forfall etapper, gul til svart 35, som dens innhold av tanniner og fenoliske forbindelser øker med forfall 65. Således nærvær av testa eller embryoer i forsøket, gitt deres antimikrobielle egenskaper, kan ha begrenset soppvekst, og derfor overvurdert effekten av RNAi stanse, derfor ble de fjernet. Også fjerning av Testa og embryoer bidrar til å begrense de kilder til variasjon i analysen, da halvparten hjerteblad som bærer fosteret vil ha flere phytoalexins og mer RNA-innhold.
I tillegg til analyse ved løpetidsgrupper og fjerning av Testa og embryo i disse forsøkene, er det viktig å påpeke noen flere observasjoner: a) selv om resultatene er vist i opp til 96 timers inkubasjon, er det anbefalt å bruke ikke mer enn 72 hr å oppnå konsistente resultater, som frø blir degradert av 96 timer; og b), mens halvparten cotyledons fra samme frø, men samplet tilfeldig, utgjør ikke helt uavhengige utvalg, RT-PCR og aflatoksin opphopning innenfor transgene hendelser viste minimum variasjon mellom frø. Også en nøyaktig soppspore telle, Inokulumvolumets av 2 ul, og anvendelse av sporer på snittflaten av cotyledons unngå drypp på sidene er viktig å sørge for at de spirer sporer blir utsatt for plantevevet. Vann / agar på platene bør være på 1,5% (w / v), mykere agar fører til avrenning av sporer som vist i det siste bildet i Figur 4 (nederst). Skulle frø periode fra en bestemt hendelse transgen være begrenset, kan sampling gjøres i duplikat i stedet for triplikat å oppnå lignende resultater (dvs. figur 7); vil imidlertid triplikate prøver å redusere standardfeil. Den eneste begrensning med denne metoden er at den krever et meget sensitivt system (UPLC) for aflatoxin påvisning / kvantifisering, men på samme tid dette reduserer sannsynligheten for å overestimere effekten av RNAi aflatoksiner bør ikke bli oppdaget av mindre følsomme metoder.
Som konklusjon, har denne metoden for første gang en pålitelig metode for å studereEffekten av RNAi i kontroll av aflatoksiner. Redusere tiden for et eksperiment fra en hel beskjæring sesong til mindre enn en uke, vil denne metoden enormt akselerere forskning på RNAi-peanut / Aspergillus pathosystem mot utslippsreduksjoner og / eller eliminering av aflatoksiner.
The authors have nothing to disclose.
This work received the financial support of USDA-ARS CRIS project 6604-21000-004-00D, CRIS project 6604-42000-008-00D, and USAID Feed-the-Future program Agreement number 58-0210-3-012. We thank Valerie Orner, LaTanya Johnson, Joseph Powell and Kathy Gray for their technical assistance. Mention of trade names or commercial products in this article is solely for the purpose of providing specific information and does not imply recommendation or endorsement by the US Department of Agriculture.
Primers, oligonucleotides | DNA Technologies, Coralville, IA, USA | n/a | |
Dneasy Plant Mini Kit | Qiagen, Valencia, CA | 69106 | |
Czapek Dox agar medium | Oxoid, by Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | CM0095 | |
Agar | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | BP 1423 | |
Freezer -80°C | n/a | n/a | |
Aluminum Oxide, Al2O3 | Fisher Scientific | A941 | |
SPE Reservoirs 1.5 mL | Grace Davison Discovery Scientific | 210011 | |
Frits for 1.5 mL SPE reservoir | Grace Davison Discovery Scientific | 211401 | |
Autosampler vials | Waters Corporation, Milford, MA | 186005221 | |
Waters Acquity Ultra-Performance Liquid-Chromatography (UPLC) instrument; UPLC-H-Class Quaternary Solvent Manager; UPLC Sample Manager; UPLC Fluorescent detector (FLR); UPLC BEH C18 2.1mmx50mm, 1.7mm column | Waters Corporation, Milford, MA | ||
Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer, with Xcalibur version 1.4 software | Thermo Electron Corp., San Jose, CA | ||
Aflatoxin standards, B1, B2, G1 and G2 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A6636; A9887; A0138; A0263 | |
Systat Software 12.2 | SYSTAT Software Inc., Point Richmond, CA | ||
Trizol reagent | Invitrogen, CA | 15596-018 | |
SuperScript III First Strand Synthesis Super Mix | Invitrogen, CA | 11752-050 | |
ABI 7500 Real-Time PCR | Lifetechnologies, Grand Island, NY | 4406984 | |
Luria Broth-Miller | Fisher Scientific | R453642 | |
pENTR1A | Invitrogen, CA | A10462 | |
LR Clonase II enzyme mix | Invitrogen, CA | 11791-020 | |
T4 DNA Ligase | NEB Biolabs | M0202L | |
Gelrite | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | G1919 | |
Acetosyringone | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D134406 | |
QIAcube robot workstation | Qiagen, Valencia, CA | 9001292 | |
Antibiotics: kanamycin, cefotaxime, gentamicin; streptomycin | Goldbio, St. Louis, MO | cef.: C-104-25; kan: K-120-5; gent.: G-400-1; strep.: S-150-50 | |
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity | Invitrogen, CA | 11304-029 |