精製とのアミロイド線維にリフォールディング（彼）<sub> 6</sub>内封入体として発現された組換えShadooタンパク質をタグ付き<em>大腸菌</em
Summary
A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.
Abstract
大腸菌発現系は、組換え真核生物のタンパク質の産生のための強力なツールです。我々はそれがShadoo、プリオンファミリーに属するタンパク質を産生するために使用します。 （His）6の精製の ためのクロマトグラフィー法は、封入体が記載されているように、組換えShadooが発現-タグ。封入体は、8M尿素で可溶化し、イオンアフィニティークロマトグラフィーを実行するようにNi 2+ -chargedカラムに結合されています。結合したタンパク質を、イミダゾールの勾配により溶出されます。 Shadooタンパク質を含有する画分を高度に精製されたタンパク質を得るために、サイズ排除クロマトグラフィーに供されます。最後のステップで精製Shadooで塩、尿素およびイミダゾールを除去するために、脱塩します。組換えShadooタンパク質はプリオン病に存在するタンパク質の立体構造の障害の生物物理学的および生化学的研究のための重要な試薬です。多くのレポートは、プリオンの神経変性疾患を刺すの沈着に由来することを実証しましたル、アミロイド線維を命じました。酸性および中性/基本的なpHでアミロイド線維にShadooをフィブリル化する方法を説明するサンプル・プロトコルが提示されています。それは、迅速かつ低コストな方法でタンパク質の大量生産を可能にするためShadooを生成し、フィブリル化する方法についての方法は、プリオン病の作業を実験室での研究を容易にすることができます。
Introduction
牛で牛海綿状脳症を含むプリオン神経変性疾患、ヒトでの羊とクロイツフェルト・ヤコブ病におけるスクレイピーは、致命的と不治です。プリオン病は、クロスβシートに、主にαヘリックスから成る細胞性プリオンタンパク質の立体構造変化によって特徴付けられる1,2の配座異性アミロイドを豊かに。クロスβ-構造が密に充填し、非常に規則正しい結晶のようなβシートは、水素結合3,4で安定化されています。プリオンアミロイドが原因募集し、単量体タンパク質ユニットを変換するためのテンプレートを提供し、成長エッジにおけるβ鎖に自己複製することができます。
「タンパク質のみ」の仮説によると、プリオンタンパク質のアミロイドコンフォーマーは唯一の感染性病原体です。しかしながら、いくつかの他の生体分子は、プリオン疾患に必須であることが提案されています。例えば、細胞膜は場所conversiであると考えられています上で行われ、いくつかの負に荷電した脂質は、変換プロセス5,6を増強することが示されています。加えて、いくつかのタンパク質はまた、プリオン病態に関与し得ます。ドッペルとShadoo 7,8：具体的には、プリオンタンパク質ファミリーの他の二つのメンバーがあります。ドッペルはジスルフィド橋で安定化し、比較的剛直な構造を有しており、アミロイド線維9に自己重合し、集計に失敗します。対照的に、プリオンタンパク質と同様に、Shadooは、アミロイド原線維構造にβシートに富む構造と自己会合を採用することができます。それはShadooがネイティブの条件下または負に帯電した膜10,11を結合する際にフィブリル化できることが示されました。アミロイド様繊維へShadooの変換は、病理に関連してもよいです。実際、アミロイド様構造は、疾患を引き起こすメカニズムはよく理解されていません。
Shadooが疎水性ドメイン（HD）とタンデムのArg /グリシンのシリーズを負い同様のトンを繰り返し、プリオンタンパク質（ 図1A）のN末端 部分、O。プリオンタンパク質のN末端 部分として、Shadooは高度に正に荷電し、ネイティブ非構造タンパク質であると思われる11,12れます。 Shadooは、直接プリオンタンパク質に結合することができるので、プリオン疾患に関連した機能的であると思われます。また、その発現がダウンプリオン病理13,14の間に調節されます。しかし、プリオン病におけるShadooの役割は未だ確立されていません。
我々は、マウスShadoo遺伝子のコード配列を有するプラスミドを開発しました。プラスミドを大腸菌を形質転換しました N末端His 6融合Shadooタンパク質の産生のための大腸菌 。この発現系はよく我々の研究室で確立され、一般的に我々の進行中のプロジェクトで使用されている6,15,16。 Shadooの発現のための重要な問題は、Eの選択であります大腸菌菌株。コンピテントBL21細菌株は、一般的に、組換えプロの発現のために使用されますteins Shadooが正常にのみ変換さSoluBL21細菌株から発現および精製しました。 SoluBL21 コンピテントE. 大腸菌は、その発現が、 親BL21中に検出可溶性生成物は得られなかったタンパク質の産生のために開発さBL21宿主株の改良された変異体です。 SoluBL21 大腸菌における Shadooの高レベルの発現大腸菌は、封入体中のタンパク質の蓄積をもたらします。非天然タンパク質を高大腸菌で発現される一般的な特徴として、 大腸菌は 、このタンパク質は、不溶性の封入体中に蓄積する傾向があります。 Shadooはおそらく様々な程度に折り畳まれたタンパク質によって形成された高濃縮動的構造体に非共有結合、疎水性またはイオン性相互作用（またはその両方の組み合わせ）を介して集約します。 （I）変性媒体の他の生体分子からのタンパク質の選択的分離、および（ii）精製されたタンパク質の再生は 、in vitroフォールディングに用いた：結果として、精製は、少なくとも二つの工程を含みます技術。
Shadooの選択的分離は、8M尿素（または6Mグアニジン-HCl）を含む緩衝液中で達成されました。 Shadoo重合を得るために、pHを≥7の溶液中で構造化されていない単量体Shadooタンパク質、または（ii）の再生を得るために酸性pHの溶液中で（I）再生：尿素の除去及びタンパク質の再生は、様々なプロトコルを適用することによって行うことができます特徴的なクロスβシートモチーフを有する安定したアミロイド繊維へ。
Protocol
Representative Results
Discussion
組換えマウスShadooタンパク質の大量の発現および精製の双方のための簡単で効率的なプロトコルが提供されます。記載されている方法は、成功した可溶化および（彼6）タグ付き組換えShadooタンパク質の精製を可能にします。 、タイトルに指摘したようにそれは、重要なことは、原核生物細菌大腸菌で発現された場合大腸菌 Shadooは、封入体に蓄積します。 Shadoo精製?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Natalie Doude and David Westerway (University of Alberta) for providing us Sho cDNA, Christophe Chevalier (INRA) for plasmid construction, Michel Brémont (INRA) for providing us BL21Sol bacteria; Christine Longin (INRA) for TEM assistance and Edith Pajot-Augy (INRA) for comments and proofreading.
Materials
| AKTA FPLC | GE, Amersham | # 1363 | |
| HiLoad 16/60 Superdex | GE Healthcare | 17-1069-01 | |
| HiTrap IMAC | GE Healthcare | GE17-0920-05 | |
| HiPrep26/10 Desalting column | GE Healthcare | GE17-5087-01 | |
| SoluBL21 Competent E. coli | Genlantis | C700200 | |
| pET-28b+ | Novogen | 69865-3 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LB-Broth medium | Sigma-Aldrich | L3022 | |
| Eppendorf Biophotometar | Eppendorf | 550507804 | |
| Trito X-100 | Life Technologies | 85111 | |
| NiSO4 | Sigma-Aldrich | 656895 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E6758 | |
| Tris-HCl | Sigma-Aldrich | RES3098T | |
| Protease Inhibitor Cocktail Tablets | Roche | 4693116001 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Imidazol | Sigma-Aldrich | I5513 | |
| Gdn-HCl | Sigma-Aldrich | G4505 | |
| protein size marker | Thermo Fisher Scientific | 26620 |
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