Vi beskriver en effektiv, robust og omkostningseffektiv metode til ekstraktion af nukleinsyre fra svaberprøver til karakterisering af bakterielle samfund ved hjælp 16S rRNA-genet amplicon sekventering. Metoden giver mulighed for en fælles behandling tilgang til flere prøvetyper og rummer en række downstream analytiske processer.
Der er en voksende forståelse for den rolle, mikrobielle samfund som kritiske modulatorer af menneskers sundhed og sygdom. High throughput sekventering teknologier har tilladt for en hurtig og effektiv karakterisering af bakterielle samfund ved hjælp 16S rRNA-genet sekventering fra en række forskellige kilder. Selv let tilgængelige værktøjer til 16S rRNA sekvensanalyse har standardiserede beregningsmæssige arbejdsgange, prøve behandling for DNA-ekstraktion er stadig en fortsat kilde til variation på tværs af studierne. Her beskriver vi en effektiv, robust og omkostningseffektiv metode til ekstraktion af nukleinsyre fra podninger. Vi afgrænse også downstream fremgangsmåder til 16S rRNA-genet sekventering, herunder generering af sekventering biblioteker, kvalitetskontrol, og sekvensanalyse. Arbejdsgangen kan rumme flere prøver typer, herunder afføring og podninger opsamlet fra en række forskellige anatomiske steder og vært arter. Derudover udvundne DNA og RNA kan adskilles og anvendestil andre anvendelser, herunder hele genomet sekventering eller RNA-seq. Den beskrevne fremgangsmåde giver mulighed for en fælles behandling tilgang til flere prøvetyper og plads nedstrøms analyse af genomisk, metagenomisk og transkriptionel information.
Den menneskelige lavere reproduktive tarmkanalen, gastrointestinale system, luftveje og hud er koloniseret af komplekse bakterielle samfund, der er kritiske for opretholdelse vævshomeostase og støtte sundheden for værten en. For eksempel visse mælkesyrebakterier skabe et ugæstfrit miljø for patogener ved syrning af vaginal hvælving, der producerer antimikrobielle effektorer og modulerende lokale vært immunitet 2-4. Den voksende påskønnelse for den bakterielle microbiome betydning har også øget interesse i at karakterisere bakterielle samfund i mange kliniske sammenhænge. Her beskriver vi en metode til at bestemme sammensætningen af den bakterielle microbiome fra genitalsvaberprøver. Protokollen kan let modificeres til afføringsprøver og podninger opsamlet fra andre anatomiske steder og andre værtsarter.
På grund af de iboende begrænsninger i antallet af prøver, der kan indsamles og lagres fra en given study deltager, var dette protokol designet til at udtrække DNA, RNA, og potentielt endnu protein fra en enkelt vatpind ved anvendelse af en tilpasset phenol-chloroform baseret perle-bankende metode 5,6. Kombinationen af fysisk afbrydelse af bakterielle cellevægge med perle-slå og kemisk forstyrrelse med detergenter muliggør hurtig lyse af grampositive, gramnegative og syrefaste bakterier uden yderligere enzymatisk fordøjelse trin. For at opnå kvalitet RNA højt, anbefales det at bruge tørre vatpinde, der blev holdt ved eller under 4 ° C umiddelbart efter indsamlingen og under transporten til laboratoriet (hvis relevant), og lagret på lang sigt ved -80 ° C.
For at bestemme den bakterielle microbiome inden for en given prøve, denne procedure anvender 16S rRNA-genet amplicon sekventering, som i øjeblikket er den mest omkostningseffektive middel til omfattende tildele bakteriel taksonomi og udføre relative kvantificering. Alternative metoder omfatter målrettet qPCR 7, custom microarrays 8, og hel-genom sekventering 9. 16S rRNA-genet indeholder ni hypervariable regioner, og der er ikke enighed om den optimale V-regionen at sekventere for vaginal microbiome studier. Her bruger vi 515F / 806R primer sæt og bygge på rørledningen designet af Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al. 'S 515F / 806R primer sæt muliggør multiplexing af hundredvis af prøver på en enkelt sekventering køre på grund af tilgængeligheden af tusindvis af validerede stregkodede primere og kompatibilitet med Illumina sekventering platforme. I modsætning til den menneskelige microbiome Projects 27F / 338R primer sæt 13, 515F / 806R også effektivt forstærker Bifidobacteriaceae og dermed præcist indfanger Gardnerella vaginalis, et vigtigt medlem af den vaginale mikrobielle samfund i nogle kvinder. Alternativt har en 338F / 806R primerpar succes blevet anvendt til pyrosekventering af vaginale prøver 14 og en 515F / 926R primerparret har recently bliver tilgængelige for næste generation sekventering 12.
Endelig er denne protokol giver grundlæggende instruktioner til at udføre 16S amplicon analyse ved hjælp af kvantitative Indblik i mikrobiel økologi (QIIME) softwarepakke 15. En vellykket gennemførelse af de QIIME kommandoer beskrevet her giver en tabel med bakterielle taksonomiske forekomster for hver prøve. Mange trin yderligere kvalitetskontrol, taksonomiske klassifikation metoder og trin analyse kan indarbejdes i analysen, som beskrevet i detaljer på QIIME hjemmeside (http://qiime.org/index.html). Hvis vil blive udført analysen på en Apple computer, MacQIIME pakken 16 giver nem installation af QIIME og dens afhængigheder. Alternative softwarepakker til 16S rRNA-genet sekvensanalyse omfatter Mothur 17 og UPARSE 18.
Her beskriver vi en protokol for identifikation og karakterisering af relative bakterielle forekomster inden for et menneske vaginal podning. Denne protokol kan nemt tilpasses til andre prøvetyper, såsom afføring og svaberprøver fra andre steder på kroppen, og for prøver indsamlet fra en lang række kilder. Udvindingen af nukleinsyre ved perle-bankende i en bufret opløsning af phenol og chloroform muliggør isolering af både DNA og RNA, hvilket er særligt vigtigt, når man arbejder med kostbare prøver indsamlet i kliniske studier. Det isolerede bakterie-DNA er fremragende til bakteriel taksonomisk identifikation og genomisk samling, medens den samtidige indsamling af RNA giver mulighed for at bestemme funktionel bakteriel, vært og virale bidrag gennem RNA-seq. Den beskrevne protokol anvender en valideret ettrins primer sæt, der er blevet indsat på en lang række prøvetyper, inklusive menneske, hund og miljøprøver 10 </sup>. Tilgængeligheden af tusindvis af stregkodede primere muliggør multiplexing af prøver og enorme besparelser på sekventering omkostninger. Den komplette omkostninger (herunder alle reagenser, en enkelt sekventering køre, og primere men ikke udstyr) er omkring $ 20 per prøve, når 200 prøver multiplekses. Desuden er der meget høj reproducerbarhed, når flere podninger fra samme prøvested behandles uafhængigt gennem hele rørledningen. Samlet set er den protokol omkostningseffektiv, fleksibel, pålidelig og gentagelig.
Den nukleinsyre udvinding del af denne protokol er begrænset af de sikkerhedsregler, der kræves, når man arbejder med phenol og chloroform, og udfordringerne i at automatisere rørledningen til en high-throughput, 96 brønde format. Derudover kraftig vulst bankende anvendes til mekaniske lysis saks det bakterielle DNA til ca. 6 kilobase-fragmenter; hvis længere DNA-fragmenter er nødvendige for downstream-applikationer, varigheden af perle slå should afkortes. Begrænsningerne i den bakterielle identifikation del af denne protokol er uløseligt forbundet med enhver metode, der bygger på 16S rRNA-genet sekventering. 16S rRNA sekventering er ideel til bakteriel identifikation til slægten og endda artsniveau, men sjældent giver identifikation stamme. Mens V4 variable region af 16S rRNA-genet giver robust diskrimination blandt de fleste bakteriearter 11, kan være nødvendigt at blive anvendt til præcist at identificere visse arter, såsom Lactobacillus crispatus yderligere beregningsmæssige metoder såsom Oligotyping 31. Endelig kan oplysninger om de præcise bakterielle funktionelle egenskaber inden for en bestemt prøve ikke bestemmes ved 16S rRNA-genet sekventering alene, selvom denne protokol muliggør ekstraktion af hele genomet DNA og RNA, som kan anvendes mod dette formål.
Det mest kritiske skridt til at sikre succes med denne protokol tager stor omhu for at forhindre forurening during prøveindsamling, nukleinsyre ekstraktion og PCR-amplifikation. Sørg sterilitet på tidspunktet for prøvetagning ved at bære rene handsker og bruge sterile vatpinde, rør, og sakse. For at vurdere om forurening af indsamlingsmateriel, indsamle negative kontrol svaberprøver ved at placere yderligere ubrugte podninger direkte ind transport rør på tidspunktet for prøveudtagningen. I laboratoriet, udføre alle pre-forstærkning trin i en steriliseret hætte, der kun indeholder dekontamineres forsyninger og hjælp kun molekylærbiologisk kvalitet, DNA-fri reagenser. Under nukleinsyre udvinding, undgå krydskontaminering ved hjælp af nye steril pincet og friske handsker med hver prøve, og holde alle rør lukket, medmindre i brug. Forarbejdning ubrugte svaberprøver parallelt sikrer sterilitet af både prøveopsamlings- og nukleinsyre-ekstraktion; de ubrugte podninger bør ikke give en pille efter isopropanol nedbør og ethanol vask. Hvis en pellet kommer frem udføre 16S rRNA-genet amplifikation for at bestemme en mulig kilde tilforureningen (f.eks ville tilstedeværelsen af Streptococcus eller Staphylococcus indikere forurening af huden). Derudover udføre PCR-amplifikationer uden skabelon kontrolreaktioner parallelt at sikre, at PCR-reagenser og reaktioner ikke er blevet forurenet. Hvis et band optræder i en ingen skabelon kontrol, kassere reagenserne og gentag forstærkning med friske reagenser. Tager disse forholdsregler vil sikre en vellykket sekventering af bakterier af interesse.
PCR-amplifikation trin tendens til at kræve den mest fejlfinding. Forstærker i sæt af tolv prøver giver en balance mellem effektivitet og sammenhæng. Den fuldstændige fravær af bands på tværs af alle prøver i en given forstærkning sæt angiver en systematisk fejl, fx glemmer at tilføje et reagens eller forkert programmering af thermocycler. Fraværet af et band fra et par prøver er normalt på grund af menneskelige fejl, og amplificeringer bør re-run med den samme parring af prøve og reverse primer. I tilfælde af vedvarende fravær af et bånd, prøven kan re-amplificeres under anvendelse af en revers primer med en anden stregkode. Gentagne amplifikationsprodukter svigt med flere reverse primere kan indikere en inhibitor til stede i prøven. I så fald, rengøring af DNA med en kolonne vil ofte fjerne hæmmere uden væsentlig ændring relative bakterielle forekomster. Hvis multiple bånd resulterer efter amplifikation, re-amplificere prøven med en anden reverse primer stregkode.
Ud over at forhindre miljøforurening og sikre forstærkning af et enkelt specifikt produkt, vellykket sekventering afhængig pleje ved udarbejdelsen af biblioteket pool. Målet er at kombinere ækvimolære mængder af hver prøve er amplikoner at sikre tilnærmelsesvis det samme antal sekventering læser per prøve. Hvis nukleinsyre-koncentrationer før amplifikation er sammenlignelige, blot at tilføje lige store volumener af hver sample s amplikoner er tilstrækkelig, når du opretter biblioteket pool. Men hvis nukleinsyre-koncentrationer er meget forskellige og tilsat i lige volumen, prøven med den lave nukleinsyrekoncentration vil blive dårligt repræsenteret med et lavt antal læser. I dette tilfælde er det muligt at tilsætte en større mængde af de amplikoner fra den lave koncentration prøve baseret på den relative intensitet af gelen band. Alternativt er det muligt at mere stringent fjerne primere fra de enkelte amplikoner, kvantificere individuelle prøves amplicon koncentration på en fluorometrisk dsDNA kvantificering kit, og præcist kombinere ækvimolære mængder af hver prøve.
Når en velafbalanceret amplicon pool genereres, bliver det vigtigt at omhyggeligt måle poolens koncentration. Efterfølgende omhyggelig fortynding og spike-in med PhiX at øge den læste kompleksitet er afgørende for at opnå optimale sekventeringsresultaterne. High-throughput sequencers der bruger sequencing ved syntese er meget følsomme over klyngen tæthed på flowcellen. Ilægning et bibliotek pulje, der er alt for koncentreret, vil resultere i overclustering, med lavere kvalitet scoringer, lavere data output, og unøjagtig demultiplexing 32. Ilægning et bibliotek pulje, der er for fortyndet vil også resultere i lav data output. Omhyggeligt kvantificere biblioteket pulje før sekventering vil sikre optimale resultater.
16S rRNA-genet sekventering giver en samlet vurdering af de bakterier, der er til stede inden for en given prøve, og er en helt afgørende første skridt i hypotese generation. Tilstedeværelsen af et rigt sæt af metadata yderligere muliggør forskeren at teste sammenhænge mellem bestemte bakteriearter og vigtige biologiske faktorer. Desuden kan det samme 16S oplysninger bruges til at udlede de bakterielle funktioner med med værktøjer som PICRUSt 33. Det endelige mål er at bruge 16S karakterisering at identificere nye foreninger, der kan væreyderligere testet og valideret i modelsystemer, tilføjelse til vores voksende forståelse af konsekvenserne af den bakterielle microbiome på menneskers sundhed og sygdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Elizabeth Byrne, David Gootenberg, og Christina Gosmann for kritisk feedback på protokollen; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco, og Jason Norman for prøveforberedelse vejledning og demonstrationer; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower, Skip Virgin, og Bruce Walker til protokol rådgivning og frugtbare drøftelser; og Jessica Hoisington-Lopez til sekventering support. Dette arbejde blev støttet af Bill og Melinda Gates Foundation og NIAID (1R01AI111918). DSK modtaget yderligere støtte fra Burroughs Wellcome fonden. MNA blev støttet af award nummer T32GM007753 fra NIGMS, og Paul og Daisy Soros Fellowship. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle udsigt over NIGMS eller NIH.
Equipment: | |||
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers: | |||
515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |