Vi beskriver en effektiv, robust og kostnadseffektiv metode for å utvinne nukleinsyre fra vattpinner for karakterisering av bakterielle samfunn ved hjelp av 16S rRNA-genet amplicon sekvensering. Fremgangsmåten gjør det mulig for en vanlig behandling tilnærming for flere prøvetyper og har plass til en rekke nedstrøms analytiske prosesser.
Det er en økende forståelse for rollen som mikrobielle samfunn som kritiske modulatorer av menneskers helse og sykdom. Høy gjennomstrømning sekvenseringsteknologi har gjort det mulig for rask og effektiv karakterisering av bakterielle miljøer ved hjelp av 16S rRNA-genet sekvensering fra en rekke kilder. Selv om lett tilgjengelige verktøy for 16S rRNA sekvensanalyse har standardiserte beregnings arbeidsflyt, utvalgets behandling for DNA-ekstraksjon forblir en fortsatt kilde til variasjon på tvers av studier. Her beskriver vi en effektiv, robust og kostnadseffektiv metode for å utvinne nukleinsyre fra vattpinner. Vi har også avgrense nedstrømsfremgangsmåter for 16S rRNA-genet sekvensering, inkludert generering av sekvensbiblioteker, kvalitetskontroll av dataene, og sekvensanalyse. Arbeidsflyten kan romme flere prøver typer, inkludert avføring og vattpinner samlet inn fra en rekke anatomiske steder og vertsarter. I tillegg utvinnes DNA og RNA kan separeres og benyttesfor andre programmer, inkludert hele genomsekvensering eller RNA-seq. Fremgangsmåten som er beskrevet gjør det mulig for en vanlig behandling tilnærming for flere prøvetyper og har plass til nedstrøms analyse av genomisk, metagenomic og transkripsjonen informasjon.
Den menneskelige lavere skjede, gastrointestinal system, luftveiene og huden blir kolonisert av komplekse bakteriesamfunn som er kritiske for å opprettholde vev homeostase og støtte helsen til verten en. For eksempel, viss laktobasiller skape et ugjestmildt miljø for patogener ved å surgjøre vaginal hvelv, produsere antimikrobielle effektorer og moduler lokale verten immunitet 2-4. Den voksende forståelse for bakteriell mikrobiomer betydning har også økt interesse for å karakterisere bakteriesamfunn i mange kliniske sammenhenger. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å bestemme sammensetningen av den bakterielle mikrobiomer av genital spinner. Protokollen kan lett modifiseres for avføringsprøver og vattpinner hentet fra andre anatomiske steder og andre vertsarter.
På grunn av de iboende begrensninger i antall prøver som kan samles og lagres fra en gitt study deltaker, denne protokollen ble utformet for å trekke ut DNA, RNA, og potensielt også protein fra en enkelt pinne ved hjelp av en tilpasset fenol-kloroform basert perle-juling metode 5,6. Kombinasjonen av fysisk forstyrrelse av bakteriecellevegger med perle-vibrerende og kjemisk avbrudd med vaskemidler tillater hurtig lysering av grampositive, gramnegative og syrefaste bakterier, uten ytterligere enzymatisk oppslutning trinn. For å oppnå høy kvalitet RNA, er det anbefalt å bruke tørre kompresser som ble holdt på eller under 4 ° C umiddelbart etter innsamling og under transport til laboratoriet (hvis aktuelt), og lagret langsiktig ved -80 ° C.
For å bestemme bakterie mikrobiomer innenfor en gitt prøve, benytter denne prosedyren 16S rRNA-genet fragment sekvensering, som for tiden er den mest kostnadseffektive måten å omfattende tildele bakteriell taksonomi og utfører relativ kvantifisering. Alternative metoder omfatter målrettet qPCR 7, tilpasset microarrays 8, og hel-genomsekvense 9. 16S rRNA-genet inneholder ni hypervariable områder, og det er ingen enighet om den optimale V-regionen å sekvensere for vaginal mikrobiomer studier. Her bruker vi 515F / 806R primer sett og bygge på rørledningen designet av Caporaso et al. 10-12. Caporaso et al. 'S 515F / 806R primer sett muliggjør multipleksing av hundrevis av prøver på et enkelt sekvense løp på grunn av tilgjengeligheten av tusenvis av validerte strekkode primere og kompatibilitet med Illumina sekvense plattformer. I motsetning til den menneskelige mikrobiomer Prosjektets 27F / 338R primersett 13, 515F / 806R også effektivt forsterker Bifidobacteriaceae og dermed nøyaktig fanger Gardnerella vaginalis, et viktig medlem av vaginal mikrobielle samfunnet i noen kvinner. Alternativt har et 338F / 806R primerpar blitt brukt for pyrosekvensering av vaginale prøver 14 og en 515F / 926R primerpar har recently blir tilgjengelige for neste generasjons sekvense 12.
Til slutt gir denne protokollen grunnleggende instruksjoner for å utføre 16S fragment analyse ved hjelp av kvantitative Innsikt i Microbial Ecology (QIIME) programvarepakken 15. Vellykket gjennomføring av QIIME kommandoene som er beskrevet her gir en tabell som inneholder bakterie taksonomiske hopetall for hver prøve. Mange flere kvalitetskontrolltrinn, taksonomiske klassifisering metoder, og analysefremgangsmåten kan bli innlemmet i analysen, som beskrevet i detalj på QIIME nettsted (http://qiime.org/index.html). Dersom analysen vil bli utført på en Apple-maskin, den MacQIIME pakke 16 gir enkel installasjon av QIIME og dens avhengigheter. Alternative programvarepakker for 16S rRNA-genet sekvensanalyse inkluderer Mothur 17 og UPARSE 18.
Her beskriver vi en protokoll for identifikasjon og karakterisering av relative bakterielle abundances innenfor et menneske vaginal vattpinne. Denne protokollen kan enkelt tilpasses for andre prøvetyper, for eksempel avføring og vattpinner av andre kroppssider, og for prøver samlet inn fra en rekke kilder. Utvinning av nukleinsyre ved kule-juling i en bufret oppløsning av fenol og kloroform gir mulighet for isolering av både DNA og RNA, noe som er spesielt viktig når man arbeider med kostbare prøver innsamlet gjennom kliniske studier. Det isolerte bakterielt DNA er utmerket for bakteriell taksonomisk identifikasjon og genomisk montering, mens den samtidig samling av RNA gir mulighet for å bestemme funksjonelle bakterielle, vert, og virale bidrag gjennom RNA-seq. Den beskrevne protokollen bruker en validert ett-trinns primersett som har blitt utplassert på en lang rekke prøvetyper, inkludert menneske, hund, og miljøprøver 10 </sup>. Tilgjengeligheten av tusenvis av strekkode primere muliggjør multipleksing av prøver og enorme besparelser på sekvense kostnader. Den totale kostnadene (inkludert alle reagenser, et enkelt sekvense løp, og primere men ikke utstyr) er ca $ 20 per prøve når 200 prøver er multiplekset. I tillegg er det meget høy reproduserbarhet når flere vattpinner fra det samme prøvestedet behandles uavhengig av hverandre gjennom hele rørledningen. Totalt sett er protokollen kostnadseffektiv, fleksibel, pålitelig og repeterbare.
Den nukleinsyre utvinning del av denne protokollen er begrenset av sikkerhetstiltakene som kreves når du arbeider med fenol og kloroform, og utfordringene ved å automatisere rørledningen til en høy gjennomstrømming, 96-brønns plate format. I tillegg er sprek perle juling brukes for mekaniske lysesakser bakteriell DNA til ca 6 kilobase fragmenter; hvis lengre DNA-fragmenter er nødvendig for nedstrøms applikasjoner, varigheten av vulsten vibrerende should bli forkortet. Begrensningene for bakteriell identifikasjon del av denne protokollen er iboende til noen metode som er avhengig av 16S rRNA-genet sekvensering. 16S rRNA sekvensering er ideell for bakteriell identifikasjon til slekten og selv artsnivå, men sjelden gir belastning nivå identifikasjon. Mens V4 variable region av 16S rRNA-genet gir robust diskriminering blant de fleste bakteriearter 11, kan ytterligere beregningsmetoder som Oligotyping 31 må benyttes for å identifisere visse arter, som for eksempel Lactobacillus crispatus. Endelig kan informasjon om den nøyaktige bakterielle funksjonelle evner innen en bestemt prøve ikke bestemmes av 16S rRNA-genet sekvensering alene, selv om denne protokollen muliggjør uttak av hele genomet DNA og RNA som kan brukes til dette formål.
Den mest kritiske skritt for å sikre suksess med denne protokollen tar stor forsiktighet for å hindre forurensning during prøvetaking, nukleinsyre ekstraksjon og PCR-amplifikasjon. Sørg for sterilitet på tidspunktet for prøvetaking av seg rene hansker og bruker sterile kompresser, rør og saks. For å vurdere for forurensning av oppsamlingsmateriell, samle negative kontrollpensler ved å plassere ekstra ubrukte vattpinner direkte i transportrørene på tidspunktet for prøvetaking. I laboratoriet, utføre alle pre-forsterkertrinn i et sterilisert panseret som kun inneholder dekontaminert forsyninger og med bare molekylær klasse, DNA-fri reagenser. Under nukleinsyre utvinning, forhindre krysskontaminering ved hjelp av nye steril pinsett og frisk hansker med hver prøve, og holde alle rør lukket med mindre i bruk. Behandler ubrukte vattpinner parallelt sikrer sterilitet både prøvetaking og nukleinsyre utvinning; ubrukte vattpinner bør ikke gi en pellet etter isopropanol nedbør og etanol vask. Hvis en pellet vises, utfører 16S rRNA-genet forsterkning for å bestemme en mulig kilde tilforurensning (for eksempel, vil tilstedeværelsen av Streptococcus eller Staphylococcus indikere hudforurensning). I tillegg utføre PCR-amplifikasjoner uten mal kontrollreaksjoner i parallell for å sikre at PCR-reagenser og reaksjoner ikke er blitt forurenset. Hvis et band vises i en ingen mal kontroll, kast reagenser og gjenta forsterkning med ferske reagenser. Å ta disse forholdsreglene vil sikre vellykket sekvensering av bakterier av interesse.
PCR forsterkning skritt tendens til å kreve mest feilsøking. Forsterke i sett på tolv prøvene gir en balanse mellom effektivitet og konsistens. Den komplette fravær av bånd på tvers av alle prøvene i en gitt forsterkning sett indikerer en systematisk svikt, for eksempel å glemme å legge til en reagens eller feil programmering av termo. Fraværet av et band fra noen prøver er vanligvis på grunn av menneskelige feil, og de presiseringer bør re-run med samme sammenkobling av prøve og revers primer. I tilfelle av fort fravær av et bånd, kan prøven på nytt amplifisert ved å bruke en revers primer med en annen strekkode. Gjentatte forsterkningsfeil med flere reverse primere kan indikere en inhibitor til stede i prøven. I så fall vil rensing av DNA med en kolonne ofte fjerne inhibitorer uten vesentlig å endre de relative bakterielle abundances. Hvis flere bånd resultere etter forsterkning, re-forsterke prøven sammen med et annet revers primer strekkode.
I tillegg til å hindre miljøforurensning og sikre forsterkning av en enkelt bestemt produkt, avhengig vellykket sekvense om omsorg når du forbereder biblioteket bassenget. Målet er å kombinere ekvimolare mengder av hver prøve er amplikonene for å sikre tilnærmet det samme antall sekvense leser per prøve. Hvis nukleinsyresekvensene konsentrasjoner før amplifikasjon er sammenlignbare, er det bare å tilsette like volumer av hver sample er amplikonene er tilstrekkelig når du oppretter biblioteket bassenget. Men hvis nukleinsyre-konsentrasjoner er vesentlig forskjellig og tilsatt i like volum, prøven med lav nukleinsyre konsentrasjon vil bli dårlig representert med et lavt antall lesninger. I dette tilfelle er det mulig å legge til et høyere volum av amplikonene fra den lave konsentrasjon prøven basert på den relative intensitet av gelen bandet. Alternativt er det mulig å fjerne mer rigorøst primere fra de enkelte amplikonene, kvantifisere enkelt prøve største fragment konsentrasjon ved anvendelse av en fluorometrisk dsDNA kvantifisering kit, og presist kombinere ekvimolare mengder av hver prøve.
Når en velbalansert amplicon bassenget er generert, blir det avgjørende å nøye måle bassenget konsentrasjon. Etterfølgende forsiktig fortynning og spike-in med pHix å øke lese kompleksiteten er avgjørende for å oppnå optimale sekvense resultater. Høy gjennomstrømming sequencere som bruker Sekvenscing ved syntese er svært følsomme for klyngen tetthet på strømningscellen. Legge et bibliotek basseng som er for konsentrert vil resultere i overclustering, med færre kvalitetspoeng, lavere datautgang, og unøyaktig demultiplexing 32. Legge et bibliotek basseng som er for tynn vil også føre til lav datautgang. Nøye kvantifisere biblioteket bassenget før sekvensering vil sikre optimale resultater.
16S rRNA-genet sekvensering gir en helhetlig vurdering av bakteriene innenfor en gitt prøve, og er en helt avgjørende første skritt i hypotesen generasjon. Tilstedeværelsen av et rikt sett av metadata videre gjør det mulig for forskeren å teste sammenhengen mellom bestemte bakteriearter og viktige biologiske faktorer. Videre kan den samme 16S informasjonen kan brukes til å utlede den bakterielle funksjoner ved hjelp av med verktøy som PICRUSt 33. Det ultimate målet er å bruke 16S karakterisering til å identifisere nye foreninger som kan væreytterligere testet og validert i modellsystemer, og legger til vår voksende forståelse av virkningen av bakteriell mikrobiomer på menneskers helse og sykdom.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Elizabeth Byrne, David Gootenberg, og Christina Gosmann for kritiske tilbakemeldinger på protokollen; Megan Baldridge, Scott Handley, Cindy Monaco, og Jason Norman for prøveopparbeidelse veiledning og demonstrasjoner; Wendy Garrett, Curtis Huttenhower, Skip Virgin, og Bruce Walker for protokollen råd og fruktbare diskusjoner; og Jessica Hoisington-Lopez for sekvensering støtte. Dette arbeidet ble støttet av Bill og Melinda Gates Foundation og NIAID (1R01AI111918). DSK fikk ekstra støtte fra Burroughs Wellcome fondet. MNA ble støttet av award nummer T32GM007753 fra NIGMS, og Paul og Daisy Soros Fellowship. Innholdet er utelukkende ansvaret til forfatterne og ikke nødvendigvis representerer den offisielle utsikt over NIGMS eller NIH.
Equipment: | |||
Mini-Beadbeater-16 | BioSpec | 607 | |
PCR workstation | Any PCR hood can be used, e.g., the AirClean 600. | ||
Thermocycler | Any thermal cycler with a heated lid can be used, e.g., MJ Research PTC-200. | ||
Electrophoresis system | Any electrophoresis system can be used, e.g. the Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis system. | ||
Nanodrop | Thermo Scientific | 2000C | Any other DNA quantification method will be sufficient |
Bioanalyzer | Agilent | 2100 | An alternative is the Agilent 2200 TapeStation Instrument. Not absolutely necessary but very helpful. |
MiSeq or HiSeq | Illumina | ||
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Materials: | |||
Catch-All Sample Collection swab | Epibio | QEC89100 | Other swabs can be used but the Catch-All swab is recommended by the Human Microbiome Project. |
ELIMINase | Fisher | 04-355-31 | |
SteriFlip 50 mL filtration device (0.22 µm) | EMD Millipore | SCGP00525 | |
0.1 mm glass beads | BioSpec | 11079101 | |
2 mL screw-cap tubes | Sarstedt | 72.694.006 | For bead beating |
UltraPure 5M NaCl | Life Technologies | 24740-011 | Molecular Biology Grade |
1 M Tris-HCl | Ambion (Invitrogen) | AM9856 | Molecular Biology Grade |
0.5 M EDTA | Ambion (Invitrogen) | AM9260G | Molecular Biology Grade |
Sodium Dodecyl Sulfate, 20% Solution | Fisher | BP1311-200 | Molecular Biology Grade |
UltraPure DNase/RNase-free distilled water | Ambion | 10977-015 | Molecular Biology Grade, for buffer preparation |
2-Propanol BioReagent, for molecular biology, ≥99.5% | Sigma | I9516-500ML | Molecular Biology Grade |
Phenol:Chloroform:IAA, 25:24:1 | Invitrogen | AM9730 | Warning: Toxic |
3 M Sodium Acetate, pH 5.5 | Life Technologies | AM9740 | Molecular Biology Grade |
Disposable sterile polystyrene forceps, PS | Cole Parmer | EW-06443-20 | |
1.5 mL, clear, PCR clean tubes | Eppendorf | 22364120 | |
PCR grade water | MoBio | 17000-11 | For PCR |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
dNTP mix | Sigma | D7295-0.5mL | |
0.2 ml PCR 8-tube with attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1492-3900 | Any 8-tube strips that are DNase, RNase, DNA, and PCR inhibitor free will work |
Agarose | BioExpress | E-3121-25 | |
50X TAE buffer | Lonza | 51216 | |
DNA gel stain | Invitrogen | S33102 | |
6X DNA Loading Dye | Thermo (Fisher) | R0611 | |
50bp GeneRuler Ladder | Thermo (Fisher) | SM0373 | |
AllPrep DNA/RNA kit | Qiagen | 80284 | |
UltraClean PCR Clean-up Kit | MoBio | 12500-100 | |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | P11496 | An alternative is Qubit Fluorometric Quantification (Life Technologies) |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Primers: | |||
515F (forward primer) 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3' |
Order at 100 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** | ||
Reverse primers, see the Supplemental Code File and: ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt |
IDT is recommended | If ordering large sets of primers, order as a 96-well plate at the 100 nmole scale. Resuspend at 100 μM. Full directions for primer ordering and resuspension at http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc. **Critical: primers must be resuspended with MoBio PCR Grade Water (see above) in a hood to avoid contamination.** |
|
Read 1 Sequencing Primer 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3' | 25 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Read 2 Sequencing Primer 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3' | 26 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
Index Sequencing Primer 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3' | 27 nmole; Purification: Standard Desalting. Resuspend at 100 µM. | ||
PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | Required if performing the sequencing in-house. If the sequencing will be performed by a third-party sequencing center, they will already have PhiX. |