Den Indflydelse af leverresektion på Intrahepatisk tumorvækst
Summary
A high incidence of tumor recurrence after resection of liver metastases remains an unsolved problem. The illustrated mouse model may be useful to investigate the reasons for such recurrences. It combines a liver resection model with intrahepatic tumor cell injection for the first time.
Abstract
Den høje forekomst af tumor tilbagefald efter resektion af metastatiske leverlæsioner fortsat et uløst problem. Små tumor celle indskud, som ikke kan påvises ved rutinemæssig klinisk billeddiagnostik, kan blive stimuleret af hepatiske regenerering faktorer efter leverresektion. Det er ikke helt klart, hvilke faktorer der er afgørende for tumor tilbagefald.
Den præsenterede musemodel kan være nyttigt at undersøge de mekanismer, der spiller en rolle i udviklingen af recidiverende maligne læsioner efter leverresektion. Modellen kombinerer de er lette at udføre og reproducerbare teknikker til definerede mængder af levervæv fjernelse og tumor induktion (ved injektion) i mus. Dyrene blev behandlet med enten en enkelt laparotomi, en 30% leverresektion, eller en 70% leverresektion. Alle dyr modtog efterfølgende en tumorcelle injektion i det resterende levervæv. Efter to ugers observation blev leverne og tumorer evalueret for størrelse og vægt ogundersøgt ved immunhistokemi.
Efter en 70% leverresektion, blev tumoren volumen og vægt signifikant forøget sammenlignet med en laparotomi alene (p <0,05). Derudover immunhistokemi (Ki67) viste en øget tumor proliferationshastighed i resektion (p <0,05).
Disse resultater viser indflydelsen af hepatiske regenerering mekanismer på intrahepatisk tumorvækst. Kombineret med metoder som histologisk oparbejdning eller RNA-analyse, kunne den beskrevne musemodel tjene som grundlag for en nærmere undersøgelse af forskellige faktorer involveret i tumorvækst og metastatisk sygdom tilbagefald i leveren. Et betydeligt antal variabler som længden af postoperativ observation, den cellelinje anvendes til injektion eller timingen af injektion og leverresektion tilbyder flere vinkler, når udforske et specifikt spørgsmål i forbindelse med post-hepatektomi metastaser. Begrænsningerne af denne procedure er authorization at udføre proceduren på dyr, adgang til et passende anlæg og erhvervelse af visse former for udstyr dyreforsøg.
Introduction
Colorectal cancer (CRC) tegner sig for næsten 9% af alle maligne tumorer. Det er den tredje mest almindelige kræftform, både i USA og på verdensplan. Globale dødelighed fra CRC spænder fra 300.000 til over 500.000 om året en. Tyve procent af patienterne lider af levermetastaser efter opdagelsen af deres kolorektal tumor. Resekterbare metastaser behandles normalt ved en delvis leverresektion 2,3. Forbedrede kirurgiske teknikker, nye multimodale strategier og nye definitioner af resekterbare metastaser gør terapien af en delvis leverresektion muligt for et stigende antal patienter 4.
Gentagelse af sekundære liver maligniteter, er imidlertid en udfordrende klinisk sequalae i moderne gastrointestinal kirurgi. Patienter med CRC, der gennemgik resektion af levermetastaser har en 30 til 50% chance for at udvikle en ny tumor i deres rest lever fem. Derfor er der behov for yderligere forskning påmekanismer involveret i en gentagelse af levermetastaser.
En leverresektion på omkring 70% er normalt kompenseres inden for et par uger af det resterende levervæv. Denne regenerering omfatter flere mekanismer, herunder cytokiner som interleukin 6 (IL-6), tumornekrosefaktor-alfa (TNF-α), hepatocytvækstfaktor (HGF), transformerende vækstfaktor beta (TGF-β), vaskulær endothelial vækstfaktor (VEGF ), matrix-metalloproteaser (MMP-2 og MMP-9) og CXC-Chemokiner 6-11. Disse stoffer understøtter hepatisk regenerering og kan også være ansvarlig for de høje tilbagefald satser af primære og sekundære lever maligniteter ved at inducere væksten af små tumor celle indskud i den resterende leveren, der ikke er opdaget af rutinemæssig klinisk billeddannelse. Denne kausalitet er ikke blevet bevist hidtil.
Følgende hypotese blev etableret. Efter partiel leverresektion, spredning faktorer, der er ansvarlige for levender hypertrofi kan også inducere væksten af hidtil uopdagede tumorceller i leveren. En musemodel er designet som kombinerede de teknikker til leverresektion og tumor induktion. Tredive athymiske nøgne-foxn1nu / nu mus blev inddelt i tre grupper på ti dyr i hver. Hver af dem blev behandlet med enten en laparotomi alene (gruppe A), en 30% leverresektion (gruppe B) eller en 70% leverresektion (gruppe C). Dyr i alle grupper modtog efterfølgende en tumorcelle injektion i en defineret resterende del af leveren, for at simulere hvilende tumorceller. Dyr, hvor observeret i to uger og derefter vurderet for tumorvækst og leverhypertrofi.
Målet var at skabe en model, der kunne anvendes til at søge efter de molekylære og patogenetiske faktorer, der kan spille en rolle i post-hepatektomi tumordannelse. Denne metode kan være nyttige i at vurdere: oprindelsen af endokrine faktorer involveret i lever regenerering; de ansvarlige mekanismer for intrahepatisk tumeller vækst efter leverresektion; og leverresektion volumen nødvendig for intrahepatisk tumorvækst induktion. Følgende metode er kun blevet udført på dyr, fordi de lover at bidrage til forståelsen af grundlæggende biologiske principper samt til udvikling af viden, der kan forventes at gavne mennesker ved forbedrede behandlingsmuligheder. På grund af de involverede i disse spørgsmål mekanismer, det skulle undersøges in vivo, som in vitro-metoder ikke kan give en realistisk gengivelse af den humane patologi.
Disse undersøgelser kan føre til opdagelsen af relevante mål til profylaktiske behandlingsmuligheder for faldende tumor tilbagefald.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere forsøg udfører kirurgi hos gnavere har været i stand til at identificere bestemte variabler, der kunne tjene som kilder til bias. For at opnå pålidelige og gyldige resultater, overveje følgende forholdsregler.
Rutinemæssig præ-op faste kan føre til lever steatosis 12, som kan inhibere leverregenerering 13,14. Det anbefales derfor ikke. Den højeste mitotiske aktivitet af hepatocytter varierer i løbet af dag 15. Hvis det er muligt, udføre …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Særlige anerkendelser gå til Dr. Benjamin Motsch for hans hjælp i tekniske spørgsmål. Forfatterne vil også gerne anerkende Dr. Marcus Forschner og Birk Müller for deres multimedier, Erica Magelky for hendes redaktionelle ekspertise og Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons og professor Stephan von Hörsten (alle fra Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) for deres professionalisme i håndtering af dyr og pleje. Vi takker professor Michael Neumaier på Institut for Klinisk Kemi, Medicinske Fakultet Mannheim ved universitetet i Heidelberg, Tyskland for at give MC38 tumorceller.
Den nuværende arbejde blev udført i opfyldelse af kravene til opnåelse af den grad "Dr. med." på Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items | |||
| (NOTE: Quantities are per animal and procedure) | |||
| Foliodrape sterile cover (45x75cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0,9%NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept – 250ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26G canula (Sterican) – for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30G canula (Sterican) – for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (=Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5mL | Eppendorf | 22363778 | |
| 4×4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 | |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
