Abstract
La alta incidencia de la recurrencia del tumor después de la resección de las lesiones hepáticas metastásicas sigue siendo un problema sin resolver. depósitos celulares de tumores pequeños, que no son detectables por imágenes clínicas de rutina, pueden ser estimuladas por factores de regeneración hepática después de la resección hepática. Sin embargo, no está del todo claro, que los factores son cruciales para la recurrencia del tumor.
El modelo de ratón se presenta puede ser útil para explorar los mecanismos que desempeñan un papel en el desarrollo de lesiones malignas recurrentes después de la resección hepática. El modelo combina las técnicas fáciles de realizar y reproducibles de cantidades definidas de extracción de tejido del hígado y la inducción de tumores (por inyección) en ratones. Los animales fueron tratados con una sola laparotomía, una resección hepática 30%, o una resección hepática 70%. Todos los animales recibieron posteriormente una inyección de células tumorales en el tejido hepático restante. Después de dos semanas de observación, se evaluaron los hígados y tumores de tamaño y peso yexaminado por inmunohistoquímica.
Después de una resección hepática 70%, el volumen del tumor y el peso se incrementaron significativamente en comparación con una laparotomía sola (p <0,05). Además, la inmunohistoquímica (Ki67) mostró una tasa de proliferación del tumor aumentó en el grupo de resección (p <0,05).
Estos hallazgos demuestran la influencia de los mecanismos de la regeneración hepática en el crecimiento tumoral intrahepática. En combinación con métodos como el estudio diagnóstico histológico o el análisis de ARN, el modelo de ratón descrito podría servir como base para un examen detallado de los diferentes factores que intervienen en el crecimiento del tumor y la recurrencia de la enfermedad metastásica en el hígado. Un considerable número de variables como la duración de la observación postoperatoria, la línea celular utilizada para la inyección o el momento de la inyección y la resección hepática ofrecen múltiples ángulos cuando se explora una pregunta específica en el contexto de metástasis después de la hepatectomía. Las limitaciones de este procedimiento son el aurización para realizar el procedimiento en animales, el acceso a una instalación de pruebas con animales apropiados y adquisición de ciertos equipos.
Introduction
El cáncer colorrectal (CCR) es responsable de casi el 9% de todos los tumores malignos. Es el tercer cáncer más común, tanto en los EE.UU. y en todo el mundo. Las tasas de mortalidad globales de gama CRC de 300.000 a más de 500.000 por año 1. El veinte por ciento de los pacientes que sufren de metástasis hepáticas en el descubrimiento de su tumor colorrectal. Metástasis resecables se tratan normalmente por un 2,3 resección parcial del hígado. Las mejores técnicas quirúrgicas, nuevas estrategias multimodales y nuevas definiciones de metástasis resecables hacen que la terapia de una resección parcial del hígado posible que un número creciente de pacientes 4.
La recurrencia de tumores malignos hepáticos secundarios, sin embargo, es un reto secuelas clínicas en cirugía gastrointestinal moderna. Los pacientes con CCR que se sometieron a la resección de metástasis hepáticas tienen una probabilidad del 30 al 50% de desarrollar un nuevo tumor en el hígado remanente 5. Por lo tanto, hay una necesidad de más investigación sobre lamecanismos implicados en la recurrencia de metástasis hepáticas.
Una resección hepática de alrededor del 70% se compensa normalmente dentro de unas pocas semanas por el tejido hepático restante. Esta regeneración implica múltiples mecanismos, incluyendo citoquinas como la interleuquina 6 (IL-6), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), factor de crecimiento de hepatocitos (HGF), factor de crecimiento transformante beta (TGF-β), el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF ), metaloproteasas de matriz (MMP-2 y MMP-9) y CXC-quimiocinas 6-11. Estas sustancias apoyan la regeneración hepática y también pueden ser responsables de las altas tasas de recurrencia de tumores malignos hepáticos primarios y secundarios mediante la inducción del crecimiento de los depósitos pequeños de células tumorales en el hígado restante que no son detectados por imágenes clínicas de rutina. Esta causalidad no se ha demostrado hasta el momento.
Se estableció la siguiente hipótesis. Después de la resección parcial del hígado, los factores de proliferación que son responsables de vivor hipertrofia también puede inducir el crecimiento de células tumorales no descubiertos previamente en el hígado. Un modelo de ratón fue diseñado, que combina las técnicas de resección hepática y la inducción de tumores. Treinta nude-foxn1nu / nu atímicos se dividieron en tres grupos de diez animales cada uno. Cada uno de ellos se trató con o bien una laparotomía solo (Grupo A), una resección del 30% del hígado (Grupo B) o una resección hepática 70% (Grupo C). Los animales en todos los grupos recibieron posteriormente una inyección de células tumorales en una parte restante definida del hígado, para simular las células tumorales inactivas. Animales donde observaron durante dos semanas y luego se evaluaron para el crecimiento tumoral y la hipertrofia del hígado.
El objetivo era crear un modelo que se podría utilizar para la búsqueda de los factores moleculares y patogénicos que pueden desempeñar un papel en la formación de tumores después de la hepatectomía. Este método puede ser útil para evaluar: el origen de los factores endocrinos implicados en la regeneración del hígado; Los mecanismos responsables de tum intrahepáticao el crecimiento después de la resección hepática; y el volumen de la resección hepática necesaria para la inducción del crecimiento tumoral intrahepática. El siguiente método sólo se ha realizado en animales, ya que prometen contribuir a la comprensión de los principios biológicos fundamentales y para el desarrollo del conocimiento que se puede esperar para beneficiar a los humanos por la mejora de las opciones de tratamiento. Debido a los mecanismos implicados en estos asuntos, que tuvo que ser examinada in vivo, como los métodos in vitro pueden no proporcionar una representación realista de la patología humana.
Estas investigaciones pueden conducir al descubrimiento de los objetivos relevantes para las opciones de tratamiento profiláctico para disminuir la recurrencia del tumor.
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Protocol
El gobierno de Franconia Media en Baviera, Alemania, el permiso para las técnicas descritas concedida. Cualquier experimentos similares requieren autorización previa de las autoridades correspondientes.
Nota: El siguiente manual se puede utilizar para grupos discutido previamente la A a la C. pasos que se han de quedar fuera en los grupos A y B están marcados en consecuencia.
1. Preparativos
- Póngase los guantes, coloque la almohadilla de poliestireno bajo el microscopio, y enfocar la lente en la zona un poco por encima de la almohadilla.
- Dividir la hoja estéril y coloque la mitad sobre la almohadilla de poliestireno y la otra mitad justo al lado de ella.
- Esterilizar los instrumentos quirúrgicos y colocarlos en una bandeja estéril al lado de la almohadilla de poliestireno.
- Enderece un clip de papel grande para formar un arco. Coloque boca abajo y presionar en la almohadilla de poliestireno en el extremo superior - justo al lado de donde la cabeza del animal se acuesta.
- Coloque la boquilla del vaporizador entre las dos extremidadess del arco. (Figura 7)
- Configurar una lámpara de calentamiento de unos 40 cm desde el lugar donde la cabeza del animal se acuesta. Asegúrese de que el calor en el plano de la almohadilla de poliestireno no exceda de 40 ° C.
- Preparar una jaula separada para los animales operados.
- Preparar una cantidad y volumen definido (máximo de 50 l) de las células tumorales en un tubo flexible y almacenarla en hielo.
2. anestesia
- Coloque el ratón en una caja de plexiglás y comenzar la inducción anestésica en isoflurano alto flujo (5% de isoflurano a un caudal de 10 L / min).
- Después de pasar por las diferentes etapas de la anestesia, retire el ratón de la caja de plexiglás justo después de que ha entrado en la fase de respiración agónica, que puede ser fácilmente reconocido por una drástica disminución de la frecuencia respiratoria (<20 / min) y jadeos profundos que sacuden la todo el cuerpo del animal.
- Coloque rápidamente el animal panza arriba sobre las tallas cubierta de la almohadilla de poliestireno estéril y continuarla ventilación de isoflurano de bajo flujo mediante la inserción de hocico del ratón en la boquilla para mantener la anestesia. Utilice una fracción inspiratoria de 1.8 a 2.2% a un caudal de aproximadamente 1 L / min.
- Evaluar la profundidad de la anestesia durante la operación mediante el cálculo de la frecuencia respiratoria, que es lo ideal es entre 45 y 60 respiraciones por minuto. Adaptar la fracción isoflurano inspiratorio en consecuencia si este no es el caso.
Nota: Los cambios en la fracción inspiratoria de isoflurano toman alrededor de 60 segundos hasta que entren en vigor. Evitar realizar cambios drásticos rápidamente. En su lugar, modificar la aplicación de la anestesia gradualmente.
3. Operación
- Desinfectar el pecho y el abdomen con un desinfectante adecuado y cambiar los guantes después.
- Inyectar un volumen adaptado-peso de carprofeno (5 mg / kg de peso corporal) en el muslo del animal.
- pellizcar suavemente la piel del abdomen con una pinza para poner a prueba si la profundidad de la anestesia es adecuada.
- diseccionar cuidadosamente el área alrededor de la xifoides para exponerlo a partir del tejido circundante.
- Colocar una sutura a través de la estancia xifoides (del interior al exterior) y conecte los dos hilos a la retención de los animales por encima de la cabeza con la abrazadera.
- Pellizcar las extremidades del retractor juntos e introducir lentamente la punta del retractor "U" a lo largo de la pared abdominal interna del animal.
Nota: Estas medidas exponen al hígado para facilitar el acceso a los diferentes lóbulos. La identificación del lóbulo lateral izquierdo y la mediana del hígado debería ser posible ahora. - Use un hisopo de algodón empapada en solución salina y empuje suavemente el lóbulo medio hacia abajo. Diseccionar las ventrales tres cuartas partes del ligamento falciforme, que ahora serán visibles entre la superficie del lóbulo medio y el diafragma.
- Ahora, usa dos hisopos de algodón remojados en solución salina para cambiar la medianalóbulo y dejó lóbulo lateral hacia arriba contra el diafragma.
- Visualizar la membrana delgada entre el lóbulo lateral izquierdo y el lóbulo caudado y diseccionar cuidadosamente.
Nota: Al realizar este protocolo en los animales del grupo A, saltar al paso 3.18 en este punto. - Colocar una ligadura tamaño de 4-0 en diagonal a lo largo de la base del lóbulo lateral izquierdo.
- A continuación, utilice el hisopo de algodón para devolver el lóbulo lateral izquierdo a su posición original.
- atar con cuidado la ligadura lo más cerca a la base del lóbulo como sea posible y evaluar el cambio de color en el lóbulo para la prueba de suministro de sangre interrumpido adecuadamente.
- Resección del lóbulo lateral izquierda siguiendo la línea de la base del lóbulo y tenga en cuenta el peso del lóbulo resecado.
Nota: Al realizar este protocolo en los animales del grupo B, salta al paso 3.18 en este punto. - Colocar una segunda ligadura entre el muñón del lóbulo lateral izquierdo y la base del lóbulo medio.
- Vuelva a colocar el lóbulo medio como well y atar la ligadura. Una vez más, evaluar el cambio de color en el lóbulo para la prueba de suministro de sangre interrumpido adecuadamente.
- Resección del lóbulo medio y anotar su peso.
- Coloque la jeringa de 1 ml de la aguja 30 G y llenarlo con las células tumorales del tubo flexible sin inclinar la jeringa en cualquier momento.
- Utilice los bastoncillos de algodón para mover las asas intestinales a la izquierda del animal con el fin de exponer el lóbulo inferior derecho.
- Inserte la jeringa cargada por células en el dispositivo de "tercera mano" en un ángulo de 30 ° respecto a la vertical.
- Con cuidado, mueva el dispositivo junto a la del ratón con la aguja justo por encima del lóbulo inferior derecho.
- avanzar lentamente la jeringa dentro del tercer dispositivo de mano hasta la punta de la aguja se encuentra en la parte central del lóbulo inferior derecho.
- Inyectar el volumen en parte central del lóbulo durante un período de 30-45 seg.
- Comprimir el sitio de inyección durante al menos tres minutos hasta que el sangrado se ha detenido.
- Cerrar la fascia con una sutura reabsorbible 5-0 nudos utilizando un solo botón.
- Cierre la piel con una sutura 4-0, no reabsorbible usando nudos botón.
- Iniciar la ventilación del ratón en alto flujo de oxígeno durante aproximadamente 1 minuto.
4. Post-op procedimiento
- Colocar el animal en un ambiente caliente (aproximadamente 40 ° C) durante la siguiente media hora para asegurar una adecuada recuperación.
- Aditivo para el agua potable del animal con 5 mg / ml de metamizol para postoperatoria de 72 h.
- Examinar la integridad de las suturas de cerca durante al menos tres días después del procedimiento.
5. Período de observación y la eutanasia
- Medir el peso del animal al día durante un total de 14 días. Puntuación ellos con respecto a su bienestar y limitaciones, respectivamente.
- Después de 14 días, anestesiar Los animales de los pasos 2.1 y 2.2 del protocolo operativo de unand proceder con el protocolo de la institución para la eutanasia de los animales.
- Realizar una laparotomía media, como se explica en el paso 3.4. Para facilitar el acceso al abdomen, extender la incisión cm caudalmente 1-1,5. Inserte el retractor como se ha señalado en el punto 3.7.
- Diseccionar a lo largo del resto del ligamento falciforme y cortar la vena cava inferior justo cuando sale de la cranealmente hígado.
- Separar el hígado desde el diafragma, agarrando el diafragma con las pinzas y sin rodeos disección en el espacio entre el hígado y el tejido muscular.
- Levantar el tejido hepático movilizado fuera del retroperitoneo y analizarlo fuera de las estructuras restantes que todavía está unido a: tejido adiposo retroperitoneal, la vena cava inferior y la vena porta.
- Inspeccionar el hígado después de la extracción de cualquier tejido adicional, lo que falsamente contribuir a su tamaño real y el peso. Un hígado extraído y su tumor se muestran en la Figura 6.
- Diseccionar el tumor fuera de la inferior lóbulo derecho.
- Medir el tamaño y el peso de tanto el tumor y el parénquima hepático.
- Conservar muestras adicionales de tejido del peritoneo, los ganglios linfáticos u otros órganos, según sea necesario para el análisis de tejidos
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Representative Results
En nuestro experimento específico, se incluyeron 30 ratones atímicos desnudos-foxn1nu / nu. Recibieron una laparotomía mediana, las inyecciones de células tumorales de 500.000 células tumorales MC38 (disuelto en 50 l de solución salina), y se trataron posteriormente, ya sea con una resección del 70% del hígado, resección hepática 30%, o ninguna intervención adicional.
Después de 14 días, la regeneración casi completa del resto del hígado después de 30% o 70% resecciones hepáticas (hígado hipertrofia-índice del grupo resección hepática 30% fue 1,06 frente a 0,8 del grupo resección hepática 70%) se observó.
Después de una sola laparotomía, el peso medio de los tumores intrahepáticos fue 332 mg (rango: 10 a 608 mg). El peso medio del tumor de los tumores intrahepáticos fue 656 mg (rango: 76-1,873 mg) después de un 30% de la resección hepática versus 961 mg (rango: 189 mg- 3030 mg) después de una hepatectomía parcial del 70% con p & #60; 0,05 (Figura 1). Después de una hepatectomía del 30%, el volumen del tumor fue de 950 mm3 (rango: 439-2,326 mm 3) frente a 1.385 mm3 (rango: 411-2,366 mm 3) después de una hepatectomía parcial del 70%, y 511 mm3 (rango: 87-1,693 mm 3) después de una laparotomía a solas con p <0,05 (Figura 2).
Las secciones de tejido desde el tejido del tumor se tomaron y se analizaron a través de KI-67 inmunohistoquímica. Se evaluaron las células en los portaobjetos con respecto a su tasa de proliferación. La tasa de proliferación de las células tumorales promedio del grupo de laparotomía fue del 47% (rango: 39-56%) en comparación con el 61% (rango: 51-69%) de los animales que habían sido sometidos a una resección hepática del 70% (p <0,05) y 53% (rango: 38 a 69%) a partir de animales que habían sido sometidos a una resección hepática de 30% (p = 0,22), lo que demuestra un aumento de la tasa de proliferación celular en los grupos sometidos a resección hepática (Figuras 3 - 5).
Figura 1:. Peso de los tumores intrahepáticos El diagrama compara el peso medio de los tumores entre los grupos A, B y C después de la disección del hígado y muestra el aumento de peso en los tumores del grupo B y C. Las barras de error representan SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Volumen de tumores intrahepáticos El diagrama compara el volumen medio del tumor entre los grupos A, B y C después de la disección del hígado y muestra el aumento de los volúmenes de los tumores del grupo B y C. Las barras de error representan SEM. ank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: la tasa de proliferación de los tumores del Grupo A. KI-67 Inmunohistoquímica de una corredera de una muestra de tumor del grupo A demuestra la proliferación moderada de las células tumorales. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: la tasa de proliferación de los tumores del Grupo B. KI-67 Inmunohistoquímica de una corredera de una muestra de tumor del grupo B demuestra la proliferación moderada de las células tumorales. Barra de escala = 100 micras.obtener = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: la tasa de proliferación de los tumores del Grupo C. KI-67 Inmunohistoquímica de una corredera de una muestra de tumor del grupo de C demuestra marcada proliferación de las células tumorales. Barra de escala = 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Extraído de muestras de hígado / tumor desde el Grupo B. Este se extrajo el hígado de los 14 días después de realizar una resección hepática 30% y la inyección de células tumorales simultánea. Un gran tumor en el lóbulo inferior derecho se puede ver, mientras que la derecha superior, la mediana y el lóbulo caudados han pasado por una hipertrofia significativa.
* = Tumor en el lóbulo inferior derecho, SRL = lóbulo superior derecho, ML = lóbulo medio, CL = lóbulo caudado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7:. O Tabla de configuración La almohadilla de poliestireno está cubierta por un paño estéril. Un clip de papel doblada abierta es presionado en la almohadilla en su extremo superior que cubre el tubo de respiración con su boquilla. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Experimentos previos que realizan cirugía en roedores han podido identificar algunas variables que podrían servir como fuentes de sesgo. Con el fin de obtener resultados fiables y válidos, tenga en cuenta las siguientes precauciones.
Rutina de ayuno antes de la operación puede dar lugar a esteatosis hepática 12, que puede inhibir la regeneración del hígado 13,14. Por lo tanto, no se recomienda. La actividad mitótica más alto de hepatocitos varía durante el día 15. Si es posible, llevar a cabo los procedimientos en un momento determinado durante el día para todos los grupos. la regeneración del hígado murino es más eficaz en animales de 4-6 semanas de edad. Los animales mayores de 10 meses de edad tienen una significativa disminución de la capacidad de regeneración 16. Utilice los ratones de la misma raza, sexo y edad de los experimentos para minimizar la posibilidad de sesgo. Trabajar en un ambiente estéril es generalmente importante en un procedimiento abierto de esta manera. Especialmente en los organismos inmunodeprimidos, como el athymi c ratones utilizados en el video, el riesgo de infección, lo que puede conducir a la muerte prematura o resultados sesgados, es alto. La búsqueda de una de tres zonas a la instalación que consiste en una preparación, una cirugía y un área de recuperación, por lo tanto se justifica 17. Debido a sus graves efectos hepatotóxicos, la buprenorfina se utiliza comúnmente no se recomienda para el tratamiento analgésico intra o postoperatoria 18,19. Utilizar otras sustancias como el carprofeno o metamizol para proporcionar una analgesia adecuada. Desde metamizol no está disponible en muchos países, carprofeno también se puede usar para controlar el dolor después del procedimiento. Realizar una inyección subcutánea de peso corporal 5mg / kg una vez al día durante tres días para sustituir metamizol.
La recuperación postoperatoria se logra mejor cuando el ratón se coloca en la recuperación de un ambiente tranquilo y de fácil acceso a los alimentos y el agua. Lo ideal es aislado de otros ratones durante la noche, para evitar que los animales más dominantes de hacer daño a los más vulnerables 17.
jove_content "> Aunque el protocolo es muy sencillo, hay algunas trampas menores para evitar la hora de realizar este tipo de cirugía en ratones. La disección del ligamento falciforme, una estructura de conexión del aspecto ventral del lóbulo medio a la pared abdominal, es esencial para lograr una flexibilidad hígado apropiado. Como este ligamento se expande a una zona muy próxima al punto donde la vena cava inferior sale del hígado craneal, se debe tener precaución con el fin de evitar daños a esta vena principal. en promedio, la disección de que cerca de tres cuartas partes de la manera se asegurará la movilización satisfactoria y al mismo tiempo mantener la distancia adecuada para el recipiente.El uso de la cantidad correcta de tensión cuando ligación de un lóbulo con una ligadura es una tarea tremendamente importante cuando se realiza el protocolo de la resección. Las ligaduras con nudos de aire o ligaduras mal apretada puede conducir a la inadecuada interrumpe el suministro de sangre, hemorragia, shock y muerte. Al mismo tiempo, un attempt para apretar a fondo un nudo de ligadura puede resultar en la ruptura de ligadura con el daño asociado a los tejidos circundantes y los órganos. Una forma eficaz de evaluación de la integridad de ligadura es la observación del cambio de color cianótico dentro del lóbulo ligaron. Selección del material de sutura correcta también juega un papel importante. suturas trenzadas son más propensos a comprimir el tejido, mientras que los materiales monofilamentous que más bien disecar a través del tejido hepático suave y causa hemorragia.
Otro paso crítico en la eliminación de los lóbulos del hígado en ratones implica la colocación correcta de las ligaduras. La ligadura debe llevarse a cabo perpendicular a los principales vasos que entran en los lóbulos. Si bien esto es bastante sencillo en el lóbulo medio, resección adecuada del lóbulo lateral izquierdo es más difícil. Sus buques entren en el lóbulo en una dirección ventro-caudal. Como resultado, el hilo de ligadura debe ser colocado a lo largo de una línea imaginaria entre la base embestida izquierda en el lóbulo inferior derecho de la liver.
En el lóbulo medio, sin embargo, la resección puede comprometer la vena cava inferior. Debido a que este vaso principal corre a través de la parte dorsal del lóbulo, es propenso a sufrir daños, lo que puede conducir a la necrosis hepática. Por otra parte, la vinculación de la ligadura con demasiada tensión en esta zona, puede resultar en la rotura de la membrana y / o neumotórax.
Manejo adecuado de las células tumorales es también importante cuando se trata de obtener resultados comparables. Aunque las técnicas de cultivo celular exactas no están destinados a ser parte de este protocolo, la manipulación de las células tumorales en el procedimiento es tan importante como la preparación perfecta de antemano. Al llenar la jeringa con las células tumorales, es vital para mantenerlo en posición vertical en todo momento. Major inclinación de la jeringa puede dar lugar a células tumorales que se adhieren a la pared jeringas, por lo tanto resulta en la pérdida de las células en el momento de la inyección. Sólo inclinación menor está garantizado en el momento de la inyección, con el fin de insertar la aguja porperpendicular a la superficie del lóbulo inferior derecho.
La hemorragia y peritoneales metástasis pueden ocurrir como resultado de la hemorragia y el derrame desde el sitio de punción en la superficie del hígado. Por lo tanto, una compresión suave del lóbulo con un hisopo de algodón por un período de tres minutos es esencial para controlar la hemorragia del parénquima del hígado y evitar que el fluido de las células tumorales con fugas en el peritoneo.
Publicaciones que contienen protocolos de actuación para las operaciones intraabdominales en los roedores rara vez contienen información sobre el tipo de cierre abdominal. Sin embargo, este aspecto es otra posible fuente de complicaciones. Incluso con un control adecuado del dolor, los animales van a tratar de eliminar los cuerpos extraños en su pared abdominal. Las consecuencias pueden ser infección intraabdominal, un abdomen abierto o incluso la muerte. Esto se puede evitar por tanto que realizan puntos interrumpidos individuales para el cierre de heridas en lugar de una sutura continua y el cierre de la pared abdominal en dos capas.
ratones nude-foxn1nu / nu atímicos hembra (proporcionado por Harlan Laboratories BV, Kreuzelweg 53, NL-5961 NM Horst) se utilizaron en este experimento. La deficiencia de células T esta raza es conocida por permite el crecimiento del tumor relativamente sin restricciones y condiciones, por lo tanto ideales para la implantación del tumor. Con el fin de minimizar la influencia de la clasificación de las peleas entre los animales, sólo se utilizaron animales hembra. Los resultados preliminares utilizando diferentes cepas como las C57BL / 6 ratones endogámicos también han demostrado significativa, sin embargo, un menor crecimiento tumoral volumen. Por lo tanto, la técnica puede ser muy probable practicable en incluso más cepas de ratón.
Sin embargo, el uso de organismos inmunodeprimidos en esta configuración requiere precauciones especiales de higiene de los animales, ya que los patógenos pueden interferir con el crecimiento tumoral 20. Medidas como el uso de animales centinelas para vigilar la presencia de agentes patógenos 21 como se realizó en las instalaciones de la experimentación con animales nuestro estudio tuvieron lugar en puede ser helpful en la detección de posibles fuentes de sesgo.
Este experimento utilizó una línea celular de cáncer colorrectal murino denominado MC38 (obtenido del Instituto de Química Clínica en la Facultad de Medicina de Mannheim, Alemania). 5 x 10 5 células tumorales se disolvieron en 50 l de solución salina. La concentración se determinó en experimentos preliminares, en los que esta cantidad fue identificado como ideal para la formación de tumor sólido dentro de dos semanas. Dependiendo de la inmunocompetencia de los animales utilizados en estos experimentos (véase la discusión anterior), podría muy bien también ser posible utilizar células de cáncer colorrectal humano y por lo tanto crear un xenoinjerto. Las pruebas iniciales realizadas en nude-foxn1nu ratones sin timo / nu utilizando células tumorales SW480 humana fue capaz de demostrar con éxito el crecimiento del tumor en el hígado remanente después de la resección. Debido a la dimensión de los hígados murinos, se recomienda a los volúmenes de uso de sólo un máximo de 50 l para prevenir complicaciones. Una posible mejora en este punto seríaser para etiquetar las células tumorales con luciferasa. Dependiendo del problema que se está investigando, información interesante puede surgir cuando es posible una vigilancia más estrecha de crecimiento de células tumorales y tamaño.
Formas alternativas de ligación lóbulos del hígado incluyen el método de recorte 22 o una técnica híbrida recorte de sutura-23. La colocación de dispositivos de recorte, sin embargo, puede hacer que los métodos de recorte difícil. realizado de manera adecuada la ligadura de sutura sigue siendo una técnica fácil de aprender y es muy probable que sea la forma más rentable de la eliminación de un lóbulo en este experimento.
Debido a que los animales vivos se utilizan en este experimento, se requiere la autorización previa de las autoridades correspondientes. Dependiendo de la región, esto puede ser una tarea costosa y que consume tiempo. Incluso después de la aprobación oficial, los experimentos con animales son mucho menos accesible que los métodos de investigación como prueba de cultivo celular o métodos moleculares. Además de la infraestructura de unamodernas instalaciones de ensayos con animales, equipo especial tiene que ser asignado para llevar a cabo el protocolo. Por otra parte, un período de dos a cuatro semanas debe ser programado para dominar esta técnica. Este protocolo puede aplicable para una amplia gama de líneas celulares en un gran número de cepas de ratón. Sin embargo, con respecto a las posibles modificaciones mencionadas anteriormente, no todos los línea celular puede ser estudiada en cada organismo.
Un objetivo principal de los estudios de investigación que utilizan este protocolo será el sistema del factor de crecimiento complejo implicado en la regeneración del hígado y sus efectos exactos sobre la recurrencia de tumores malignos del hígado. Con el fin de investigar estos posibles correlaciones adecuadamente, es esencial para poner en práctica un experimento con animales, en contraste con los métodos moleculares diferentes o experimentos de cultivo celular. Estos métodos bien deben utilizarse como medios complementarios de investigación. Aunque varios modelos de resección hepática diferentes se han publicado hasta la fecha 22-24, este procedimientopor primera vez implementa inyección de células tumorales simultánea en una operación bien establecida.
Este modelo de ratón demuestra que la resección hepática en ratones es un método bastante simple, factible y fácilmente reproducible. la regeneración del hígado después de resecciones menores y mayores era capaz de compensar la pérdida de tejido por la hipertrofia de un plazo de dos semanas. Los ratones pueden hacer frente a las reducciones de volumen de hígado de hasta 70%.
Las células tumorales fueron capaces de crecer dentro del hígado remanente y tumores sólidos se pueden establecer. El crecimiento del tumor y la proliferación de células tumorales correlacionadas con la cantidad de tejido hepático resecado. El proceso de plomo resección a una activación del crecimiento del tumor en el hígado restante, que se expresó, por mayores pesos de los tumores y volúmenes. Este mayor grado de proliferación se pudo demostrar por los exámenes de inmunohistoquímica.
Es bien sabido que la cantidad de fac regeneración hepáticares liberados para la hipertrofia del hígado aumenta con la extensión de la resección hepática 25,26. Por lo tanto, puede existir una relación entre los factores de regeneración del hígado y el crecimiento de las células tumorales. Esto está en concordancia con las observaciones clínicas donde recurrencia metastásica se correlaciona con la cantidad de metástasis en el hígado antes de la resección. Las metástasis hepáticas que son visibles en las imágenes preoperatorias pueden reflejar sólo la punta del iceberg, mientras más, sin embargo, no son depósitos de células tumorales detectables, pueden estar presentes al momento del diagnóstico. Después de la resección del hígado, factores de regeneración hepática puede entonces estimular el crecimiento de estas células tumorales, lo que eventualmente se hacen evidentes como metástasis recurrentes.
Aunque la correlación mencionado anteriormente es muy probable, que no se ha demostrado hasta el momento. La influencia de los mecanismos de regeneración hepática sobre el progreso del tumor intrahepático, por tanto, requiere más análisis moleculares. instrucciones precisas, así como un vídeo ilustrativo permitir una rápida adopciónde la técnica introducida en este video. Puede servir como una base para diferentes tipos de estudios en todo el mundo que están tratando de descubrir el eslabón perdido en esta conocida cadena de acontecimientos.
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Acknowledgments
Reconocimiento especial al Dr. Benjamin Motsch por su ayuda en cuestiones técnicas. Los autores también desean reconocer el Dr. Marcus Forschner y Birk Müller por su apoyo multimedia, Erica Magelky por su experiencia editorial y Lisa Hornung, el Dr. Roland Jurgons y el profesor Stephan von Hörsten (todos de la Franz-Penzoldt-Center, Universidad de Erlangen) por su profesionalismo en el manejo de los animales y el cuidado. Agradecemos al profesor Michael Neumaier en el Instituto de Química Clínica, Facultad de Medicina de la Universidad de Mannheim de Heidelberg, Alemania para proporcionar células tumorales MC38.
El presente trabajo se llevó a cabo en cumplimiento de los requisitos para la obtención del título "Dr. med." en el Friedrich-Alexander de Erlangen-Universidad-Nürnberg (FAU).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items (NOTE: Quantities are per animal and procedure) |
|||
| Foliodrape sterile cover (45 cm x 75 cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0.9% NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept - 250 ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1 ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26 G canula (Sterican) - for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30 G canula (Sterican) - for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (= Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5 ml | Eppendorf | 22363778 | |
| 4 x 4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 |
References
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