Inverkan av leverresektion på Intrahepatisk tumörtillväxt
Summary
A high incidence of tumor recurrence after resection of liver metastases remains an unsolved problem. The illustrated mouse model may be useful to investigate the reasons for such recurrences. It combines a liver resection model with intrahepatic tumor cell injection for the first time.
Abstract
Den höga förekomsten av tumörrecidiv efter resektion av metastatiska leverskador är fortfarande ett olöst problem. Små tumörcells insättningar, som inte detekteras genom rutinmässig klinisk avbildning, kan stimuleras av leverregenereringsfaktorer efter leverresektion. Det är inte helt klarlagt, men vilka faktorer som är avgörande för tumörrecidiv.
De presenterade musmodellen kan vara värdefullt att undersöka de mekanismer som spelar en roll i utvecklingen av återkommande maligna lesioner efter leverresektion. Modellen kombinerar lätt utföra och reproducerbara tekniker för definierade mängder av levervävnad bort och tumörinduktion (genom injektion) i möss. Djuren behandlades med antingen en enda laparotomi, en 30% leverresektion, eller en 70% leverresektion. Alla djur mottog därefter en tumörcellinjektion i det återstående levervävnaden. Efter två veckor av observation, var levrarna och tumörer utvärderades med avseende på storlek och vikt ochundersöktes genom immunhistokemi.
Efter en 70% leverresektion, var tumörvolymen och vikt ökade signifikant jämfört med en laparotomi enbart (p <0,05). Dessutom immunohistokemi (Ki67) visade en ökad tumörproliferationshastighet i Fristationen gruppen (p <0,05).
Dessa fynd visar påverkan av leverregenereringsmekanismer på intrahepatisk tumörtillväxt. I kombination med metoder som histologiska upparbetning eller RNA-analys, kan den beskrivna musmodell tjäna som grund för en noggrann undersökning av olika faktorer som är inblandade i tumörtillväxt och metastatisk sjukdom återfall i levern. Ett stort antal variabler som längden på postoperativ observation, den cellinje som används för injektion eller tidpunkten för injektion och leverresektion erbjuder flera vinklar när utforska en specifik fråga i samband med efter hepatektomi metastaser. Begränsningarna med detta förfarande är authorization att utföra proceduren på djur, tillgång till ett lämpligt djur testanläggning och förvärv av viss utrustning.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) står för nästan 9% av samtliga elakartade tumörer. Det är den tredje vanligaste cancerformen, både i USA och i hela världen. Global dödlighet från CRC intervallet från 300.000 till över 500.000 per år 1. Tjugo procent av patienterna lider av levermetastaser vid upptäckten av deras kolorektal tumör. Resekerbara metastaser normalt behandlas av en partiell leverresektion 2,3. Förbättrade kirurgiska tekniker, nya multimodala strategier och nya definitioner av resekerbara metastaser gör behandlingen av en partiell leverresektion möjligt för ett ökande antal patienter 4.
Återfall av sekundära lever maligniteter, dock är en utmanande klinisk sequalae i modern gastrointestinal kirurgi. Patienter med CRC som genomgick resektion av levermetastaser har en chans 30-50% att utveckla en ny tumör i deras kvarleva lever fem. Därför finns det ett behov av ytterligare forskning ommekanismer som är involverade i återkommande levermetastaser.
En lever resektion av ca 70% är normalt kompenseras inom några veckor av den återstående levervävnad. Denna regenerering inbegriper multipla mekanismer, inklusive cytokiner såsom interleukin 6 (IL-6), tumömekrosfaktor alfa (TNF-α), hepatocyt tillväxtfaktor (HGF), transformerande tillväxtfaktor beta (TGF-β), vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF ), matrismetalloproteaser (MMP-2 och MMP-9) och CXC-kemokiner 6-11. Dessa ämnen stödjer leverregenerering och kan även vara ansvarig för de höga återfallsfrekvens av primära och sekundära lever maligniteter genom att inducera tillväxt av små tumörcells insättningar i den kvarvarande levern som inte upptäcks av rutinmässig klinisk avbildning. Denna orsakssamband har inte visat sig så långt.
Följande hypotes bildades. Efter partiell leverresektion, de faktorer som spridning är ansvariga för levander hypertrofi kan också inducera tillväxten av tidigare oupptäckta tumörceller i levern. En musmodell designades som kombinerade de metoder för leverresektion och tumörinduktion. Trettio atymiska naken-foxn1nu / nu-möss delades in i tre grupper om tio djur vardera. Var och en av dem behandlades med antingen en laparotomi enbart (grupp A), en 30% leverresektion (grupp B) eller en 70% leverresektion (grupp C). Djur i alla grupper mottog därefter en tumörcell injektion i en definierad återstående delen av levern, för att simulera vilande tumörceller. Djur där observerades under två veckor och sedan utvärderades med avseende på tumörtillväxt och leverhypertrofi.
Målet var att skapa en modell som kan användas för att söka efter de molekylära och patogenetiska faktorer som kan spela en roll i efter hepatektomi tumörbildning. Denna metod kan vara till hjälp vid bedömningen: ursprung endokrina faktorer som lever regenerering; de ansvariga mekanismer för intrahepatisk tumeller tillväxt efter leverresektion; och leverresektion volym som behövs för intrahepatisk tumörtillväxt induktion. Följande metod har endast utförts på djur, eftersom de lovar att bidra till förståelsen av grundläggande biologiska principer och utveckling av kunskap som kan förväntas gynna människor genom förbättrade behandlingsalternativ. På grund av de mekanismer som är involverade i dessa frågor, måste det undersökas in vivo, som in vitro-metoder inte kan ge en realistisk återgivning av den mänskliga patologi.
Dessa undersökningar kan leda till upptäckten av relevanta mål för profylaktiska behandlingsalternativ för att minska tumöråterfall.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidigare experiment som utför kirurgi i gnagare har kunnat identifiera vissa variabler som kan tjäna som källor för partiskhet. För att få tillförlitliga och giltiga resultat, beakta följande försiktighetsåtgärder.
Rutin pre-op fasta kan leda till leversteatos 12, som kan hämma leverregenerering 13,14. Det rekommenderas därför inte. Den högsta mitotiska aktiviteten hos hepatocyter varierar under dagen 15. Om möjligt, genomföra förfaranden vi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Särskilda bekräftelser gå till Dr Benjamin Motsch för hans hjälp i tekniska frågor. Författarna vill också tacka för Dr Marcus Forschner och Birk Müller för deras stöd för multimedia, Erica Magelky för sin redaktionella kompetens och Lisa Hornung, Dr Roland Jurgons och professor Stephan von Hörsten (alla från Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) för sin professionalism i djurhantering och omsorg. Vi tackar professor Michael Neumaier vid Institutionen för klinisk kemi, medicinska fakulteten Mannheim vid universitetet i Heidelberg, Tyskland för att ge MC38 tumörceller.
Den nuvarande arbete utfördes för att uppfylla kraven för att erhålla examen "Dr. med." vid Friedrich-Alexander-University Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items | |||
| (NOTE: Quantities are per animal and procedure) | |||
| Foliodrape sterile cover (45x75cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0,9%NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept – 250ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26G canula (Sterican) – for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30G canula (Sterican) – for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (=Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5mL | Eppendorf | 22363778 | |
| 4×4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 | |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
