تأثير الكبد استئصال الورم على النمو داخل الكبد
Summary
A high incidence of tumor recurrence after resection of liver metastases remains an unsolved problem. The illustrated mouse model may be useful to investigate the reasons for such recurrences. It combines a liver resection model with intrahepatic tumor cell injection for the first time.
Abstract
ارتفاع نسبة عودة الورم بعد استئصال الآفات الكبد النقيلي لا يزال يشكل مشكلة لم تحل بعد. الودائع الخلايا السرطانية الصغيرة، التي لا يمكن كشفها بواسطة التصوير السريري الروتيني، قد يحفزه العوامل تجديد الكبد بعد استئصال الكبد. وليس واضحا تماما، ولكن الذي عوامل حاسمة لعودة الورم.
قد يكون نموذج الفأر قدم المفيد استكشاف الآليات التي تلعب دورا في تطور الآفات الخبيثة المتكررة بعد استئصال الكبد. نموذج يجمع بين تقنيات سهلة إلى أداء وقابلة للتكرار كميات محددة من إزالة أنسجة الكبد وتحريض الورم (عن طريق الحقن) في الفئران. تم علاج الحيوانات إما مع البطن واحدة، 30٪ استئصال الكبد، أو 70٪ استئصال الكبد. وتلقى جميع الحيوانات في وقت لاحق حقن الخلايا السرطانية في أنسجة الكبد المتبقية. بعد أسبوعين من المراقبة، تم تقييم الكبد والأورام لحجم ووزن وفحصها من قبل المناعية.
بعد 70٪ استئصال الكبد، وزاد حجم الورم والوزن بشكل ملحوظ مقارنة البطن وحدها (ع <0.05). وبالإضافة إلى ذلك، أظهرت المناعية (Ki67) زيادة معدل انتشار الورم في مجموعة استئصال (ع <0.05).
تظهر هذه النتائج تأثير آليات تجديد الكبد على نمو الورم داخل الكبد. جنبا إلى جنب مع أساليب مثل workup النسيجي أو تحليل الحمض النووي الريبي، يمكن للنموذج الفأر وصفت بمثابة الأساس لفحص دقيق من العوامل المختلفة المشاركة في نمو الورم وتكرار المرض المنتشر داخل الكبد. وهناك عدد كبير من المتغيرات مثل طول الملاحظة بعد العملية الجراحية، خط الخلية المستخدمة للحقن أو توقيت الحقن واستئصال الكبد تقدم زوايا متعددة عند استكشاف سؤالا محددا في سياق الانبثاث بعد استئصال الكبد. قيود من هذا الإجراء هي الاتحاد الافريقيthorization لتنفيذ الإجراء على الحيوانات، والوصول إلى منشأة التجارب على الحيوانات المناسب والحصول على بعض المعدات.
Introduction
سرطان القولون والمستقيم (CRC) يمثل ما يقرب من 9٪ من جميع الأورام الخبيثة. وهو ثالث أكثر أنواع السرطان شيوعا، سواء في الولايات المتحدة وحول العالم. معدلات الوفيات العالمية من مجموعة CRC من 300،000 إلى أكثر من 500،000 سنويا 1. عشرين في المئة من المرضى الذين يعانون من الانبثاث الكبد على اكتشاف الورم القولون والمستقيم. يتم التعامل مع الانبثاث Resectable عادة جزئي 2،3 استئصال الكبد. تحسين التقنيات الجراحية واستراتيجيات متعددة الوسائط الجديدة وتعريفات جديدة الانبثاث resectable تجعل العلاج لاستئصال الكبد الجزئي من الممكن بالنسبة لعدد متزايد من المرضى (4).
تكرار الأورام الخبيثة في الكبد الثانوية، ومع ذلك، هو sequalae السريري تحديا في جراحة الجهاز الهضمي الحديثة. المرضى الذين يعانون من اتفاقية حقوق الطفل الذي خضع لاستئصال النقائل الكبد لديهم فرصة 30 إلى 50٪ من تطوير ورم جديد في الكبد بقايا من 5. لذلك، هناك حاجة لإجراء المزيد من البحوث علىالآليات التي تشارك في تكرار الانبثاث الكبد.
يتم تعويض واستئصال الكبد حوالي 70٪ عادة في غضون بضعة أسابيع من أنسجة الكبد المتبقية. ويشمل هذا تجديد آليات متعددة، بما في ذلك السيتوكينات مثل انترلوكين 6 (IL-6)، عامل نخر الورم ألفا (TNF-α)، عامل النمو الكبدية (HGF)، وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)، عامل النمو البطاني الوعائي (VEGF )، metalloproteases المصفوفة (MMP-2 و MMP-9) وCXC-كيموكينات 6-11. هذه المواد تدعم تجديد الكبد ويمكن أن تكون مسؤولة أيضا عن معدلات تكرار عالية من الأورام الخبيثة في الكبد الأولية والثانوية عن طريق حفز نمو الودائع الخلايا السرطانية صغيرة في الكبد المتبقية التي لم يتم الكشف عنها بواسطة التصوير السريري الروتيني. لم تثبت هذه العلاقة السببية حتى الآن.
تأسست الفرضية التالية. بعد استئصال الكبد الجزئي، وعوامل الانتشار التي هي المسؤولة عن العيشقد ص تضخم أيضا تحفز نمو الخلايا السرطانية المكتشفة سابقا في الكبد. تم تصميم نموذج الفأر الذي يجمع بين تقنيات استئصال الكبد وتحريض الورم. تم تقسيم ثلاثين عارية foxn1nu / الفئران نو athymic إلى ثلاث مجموعات من عشرة حيوانات لكل منهما. كان يعامل كل منهم إما مع البطن وحدها (المجموعة الأولى)، 30٪ استئصال الكبد (المجموعة الثانية) أو استئصال الكبد 70٪ (المجموعة الثالثة). تلقى الحيوانات في جميع الفئات في وقت لاحق حقن الخلايا السرطانية في جزء المتبقي محددة من الكبد، لمحاكاة الخلايا السرطانية النائمة. الحيوانات حيث لاحظت لمدة أسبوعين ومن ثم تقييمها لنمو الورم وتضخم الكبد.
كان الهدف هو خلق نموذج التي يمكن استخدامها للبحث عن العوامل الجزيئية وإمراضي التي قد تلعب دورا في تشكيل الورم في مرحلة ما بعد استئصال الكبد. قد تكون هذه الطريقة مفيدة في تقييم: أصل من العوامل الغدد الصماء تشارك في تجديد الكبد. الآليات المسؤولة عن توم داخل الكبدأو النمو بعد استئصال الكبد. والكبد حجم استئصال اللازم لداخل الكبد تحريض نمو الورم. وقد تم تنفيذ الأسلوب التالي فقط على الحيوانات لأنها نعد لتساهم في فهم المبادئ البيولوجية الأساسية وتطوير المعرفة التي من المتوقع أن يستفيد البشر من خيارات العلاج أفضل. ويرجع ذلك إلى الآليات التي تشارك في هذه الأمور، كان لا بد من دراستها في الجسم الحي، كما هو الحال في المختبر أساليب قد لا توفر تمثيل واقعي للأمراض البشرية.
قد تؤدي هذه التحقيقات إلى اكتشاف الأهداف ذات الصلة لخيارات العلاج الوقائي لخفض تكرار الورم.
Protocol
Representative Results
Discussion
وكانت التجارب السابقة إجراء العمليات الجراحية في القوارض قادرة على تحديد بعض المتغيرات التي يمكن أن تكون مصادر للتحيز. من أجل الحصول على نتائج موثوقة وصحيحة، والنظر في الاحتياطات التالية.
روتين ما قبل المرجع الصيام يمكن أن تؤدي …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
شكر وتقدير خاص إلى الدكتور بنيامين Motsch لمساعدته في المسائل الفنية. فإن الكتاب أود أيضا أن نعترف الدكتور ماركوس Forschner وبيرك مولر لدعم الوسائط المتعددة الخاصة، إيريكا Magelky للحصول على الخبرة التحريرية لها وليزا HORNUNG الدكتور رولاند Jurgons والبروفيسور ستيفان فون Hörsten (كل من فرانز بنزولت سنتر، جامعة الاحتفالات) على مهنيتهم في التعامل مع الحيوان والرعاية. نشكر الأستاذ مايكل Neumaier في معهد الكيمياء السريرية، كلية الطب مانهايم من جامعة هايدلبرغ، ألمانيا لتوفير خلايا MC38 الورم.
تم تنفيذ هذا العمل في استيفاء متطلبات الحصول على درجة "دكتور ميد". في فريدريك الكسندر-جامعة إيرلانغن نورنبرغ (وحدة التحليل المالي).
Materials
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items | |||
| (NOTE: Quantities are per animal and procedure) | |||
| Foliodrape sterile cover (45x75cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0,9%NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept – 250ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26G canula (Sterican) – for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30G canula (Sterican) – for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (=Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5mL | Eppendorf | 22363778 | |
| 4×4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 | |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
