The Influence of leverreseksjon på Intrahepatisk tumorvekst
Summary
A high incidence of tumor recurrence after resection of liver metastases remains an unsolved problem. The illustrated mouse model may be useful to investigate the reasons for such recurrences. It combines a liver resection model with intrahepatic tumor cell injection for the first time.
Abstract
Den høye forekomsten av svulst tilbakefall etter reseksjon av metastatiske leverlesjoner er fortsatt et uløst problem. Små tumorcelle innskudd, som ikke oppdages ved rutinemessig klinisk bildebehandling, kan stimuleres av lever regenerering faktorer etter leverreseksjon. Det er ikke helt klart, men hvilke faktorer som er avgjørende for svulst tilbakefall.
Den presenterte mus modell kan være nyttig for å utforske de mekanismer som spiller en rolle i utviklingen av tilbakevendende maligne lesjoner etter leverreseksjon. Modellen kombinerer enkle å utføre og reproduserbare teknikker av definerte mengder levervev fjerning og tumor induksjon (ved injeksjon) i mus. Dyrene ble behandlet med enten en enkelt laparotomi, en 30% leverreseksjon, eller en 70% lever reseksjon. Alle dyrene mottok deretter en tumorcelle-injeksjon inn i den gjenværende levervevet. Etter to ukers observasjon, ble leveren og svulster evaluert med hensyn til størrelse og vekt ogundersøkt av immunhistokjemi.
Etter en 70% leverreseksjon, ble tumorvolumet og vekten betydelig økt sammenlignet med en laparotomi alene (p <0,05). I tillegg immunhistokjemi (Ki67) viste en økt tumor proliferasjonsrate i reseksjon gruppen (p <0,05).
Disse resultatene demonstrerer påvirkning av lever restitusjon mekanismer for intrahepatisk tumorvekst. Kombinert med metoder som histologisk opparbeiding eller RNA-analyse, kan den beskrevne musemodell tjene som grunnlag for en nærmere undersøkelse av ulike faktorer involvert i tumorvekst og metastatisk tilbakefall av sykdommen i leveren. Et betydelig antall variabler som lengden av postoperativ observasjon, cellelinje som brukes for injeksjon eller timingen av injeksjonen og leverreseksjon tilbyr flere vinkler når utforske et bestemt spørsmål i sammenheng med post-hepatectomy metastaser. Begrensningene for denne prosedyren er authorization å utføre prosedyren på dyr, tilgang til en passende dyreforsøk anlegg og kjøp av visse typer utstyr.
Introduction
Tykktarmskreft (CRC) står for nesten 9% av alle ondartede svulster. Det er den tredje vanligste kreftformen, både i USA og på verdensbasis. Global dødelighet fra CRC varierer fra 300.000 til over 500.000 per år 1. Tjue prosent av pasientene lider av levermetastaser etter oppdagelsen av deres tykktarms svulst. Resektable metastaser er normalt behandlet av en delvis leverreseksjon 2,3. Forbedret kirurgiske teknikker, nye multimodale strategier og nye definisjoner av resektable metastaser gjengi terapi av en delvis leverreseksjon mulig for et økende antall pasienter 4.
Tilbakefall av sekundære lever malignitet, derimot, er en utfordrende klinisk følgende hendelser i moderne gastrointestinal kirurgi. Pasienter med CRC som gjennomgikk reseksjon av levermetastaser har en 30-50% sjanse for å utvikle en ny svulst i deres rest lever fem. Det er derfor et behov for videre forskning påmekanismene som er involvert i tilbakefall av levermetastaser.
En lever reseksjon av omtrent 70% normalt kompenseres innen få uker etter den gjenværende levervev. Denne regenerering omfatter flere mekanismer, inkludert cytokiner som interleukin-6 (IL-6), tumornekrosefaktor alfa (TNF-α), hepatocytt-vekstfaktor (HGF), transformerende vekstfaktor beta (TGF-β), vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF ), matrix metalloproteaser (MMP-2 og MMP-9) og CXC-Kjemokiner 6-11. Disse stoffene støtter lever regenerering og kan også være ansvarlig for de høye tilbakefall av primære og sekundære lever maligniteter ved å fremkalle vekst av små tumorcelle innskudd i de resterende leveren som ikke oppdages ved rutinemessig klinisk imaging. Denne årsakssammenheng har ikke vært påvist så langt.
Den følgende hypotese ble etablert. Etter delvis leverreseksjon, spredning faktorer som er ansvarlig for liver hypertrofi kan også indusere vekst av tidligere ukjente tumorceller i leveren. En mus modell er designet som kombinert teknikker for leverreseksjon og tumor induksjon. Tretti atymiske nakne-foxn1nu / nu-mus ble delt i tre grupper på ti dyr i hver. Hver av dem ble behandlet med enten en laparotomi alene (gruppe A), en 30% leverseksjon (gruppe B), eller en 70% leverseksjon (gruppe C). Dyr i alle grupper mottok deretter en tumorcelle-injeksjon inn i en definert gjenværende del av leveren, for å simulere hvilende tumorceller. Dyr ble observert i to uker og deretter evalueres for tumorvekst og lever hypertrofi.
Målet var å skape en modell som kan brukes for å søke etter de molekylære og patogenetiske faktorer som kan spille en rolle i post-hepatectomy tumordannelse. Denne metoden kan være nyttig i vurderingen: opprinnelsen til endokrine faktorer involvert i leveren regenerasjon; de ansvarlige mekanismer for intrahepatisk tumeller vekst etter leverreseksjon; og leveren reseksjon volumet nødvendig for intrahepatisk tumorvekst induksjon. Følgende metode har kun blitt utført på dyr fordi de lover å bidra til forståelsen av grunnleggende biologiske prinsipper og til utvikling av kunnskap som kan forventes å dra mennesker ved bedre behandlingstilbud. På grunn av de involverte i disse forholdene mekanismene, måtte det bli undersøkt in vivo, som in vitro metoder ikke kan tilveiebringe en realistisk gjengivelse av den menneskelige patologi.
Disse undersøkelsene kan føre til oppdagelsen av relevante mål for forebyggende behandling for å redusere tumor tilbakefall.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere eksperimenter som utfører operasjonen i gnagere har vært i stand til å identifisere visse variabler som kan tjene som kilder for skjevhet. For å få pålitelige og gyldige resultater, bør du vurdere følgende forholdsregler.
Rutinemessig pre-op faste kan føre til lever steatose 12, som kan hemme leveren regenerering 13,14. Det anbefales derfor ikke. Den høyeste mitotisk aktivitet av hepatocytter varierer i løpet av dagen 15. Hvis det er muli…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Spesielle bekreftelser gå til Dr. Benjamin Motsch for hans hjelp i tekniske spørsmål. Forfatterne ønsker også å erkjenne Dr. Marcus FÖRSCHNER og Birk Müller for sin multimediestøtte, Erica Magelky for henne redaksjonell kompetanse og Lisa Hornung, Dr. Roland Jurgons og professor Stephan von Horsten (alle fra Franz-Penzoldt-Center, University of Erlangen) for deres profesjonalitet i dyr håndtering og omsorg. Vi takker professor Michael Neumaier ved Institutt for klinisk kjemi, Medisinsk fakultet Heim ved Universitetet i Heidelberg, Tyskland for å gi MC38 tumorceller.
Dette arbeidet ble utført i oppfyllelse av kravene for å få graden "Dr. med." ved Friedrich-Alexander-universitetet Erlangen-Nürnberg (FAU).
Materials
| Equipment | |||
| Operation Microscope | Zeiss | OPMI-1 FC S21 | |
| Induction Cage (Plexiglas Box) | UNO BV, Netherlands | 180000132 | |
| Flowmeter + Connection Kit | UNO BV, Netherlands | 180000008 | |
| UNO Vaporizer Sigma Delta | UNO BV, Netherlands | 180000002 | |
| Key Filler for Anesthetic | UNO BV, Netherlands | 180000010 | |
| Activated Charcoal Filter Adsorber | UNO BV, Netherlands | 180000140 | |
| Gas Exhaust Unit | UNO BV, Netherlands | 180000118 | |
| Face Mask for mouse | UNO BV, Netherlands | 180000065 | |
| Vaporizer Stand | UNO BV, Netherlands | 180000006 | |
| Heat lamp | Physitemp Instruments | HL-1 | |
| Styrofoam Pad | RAYHER | 30074000 | |
| Third Hand Tool | TOOLCRAFT | ZD-10F | |
| Precision Scales | Kern | EW 220-3NM | |
| Scales | Kern | EMB 500-1 | |
| Sliding Caliper | MIB | MIB 82026100 | |
| Microdissection forceps | Braun/Aesculap | BD195R | |
| Microdissection scissors | Braun/Aesculap | FD100R | |
| Microdissection needle holder | Braun/Aesculap | BM563R | |
| Retractor | Fine Science Tools (F.S.T.) | No. 17001-0 | Type: Bowmann |
| Clamp | Braun/Aesculap | BJ002R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Expendable Items | |||
| (NOTE: Quantities are per animal and procedure) | |||
| Foliodrape sterile cover (45x75cm) | Hartmann | 2775001 | |
| Sterile Cotton Swabs (2x) | Hartmann | 4700151 | Peha |
| Sterile fluid (0,9%NaCl) | Braun | 3570310 | PZN=04454809 |
| Disinfectant (Softasept – 250ml) | Braun | 3887138 | PZN=0762008808505018 |
| 2 x 1ml syringe (Injekt-F ) | Braun | 9166017V | |
| 26G canula (Sterican) – for Carprofen injection | Braun | 4665457 | |
| 30G canula (Sterican) – for Tumor injection | Braun | 4656300 | |
| Caprofen (=Rimadyl) | Pfizer | QM01AE91 | |
| Metamizole (=Novaminsulfon) | Ratiopharm | 16543.00.00 | |
| 4-0 Vicryl suture | Ethicon | J835G | |
| 5-0 Prolene suture | Ethicon | 8618G | |
| SafeLock Flex-Tube 1.5mL | Eppendorf | 22363778 | |
| 4×4 Gauze Sponge | Kendall/Covidien | UPC: 728795135355 | ASIN: B005BFQTWM |
| Large paperclip | ACCO | A7072510G | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Female athymic nude-foxn1nu/nu | Harlan Laboratories B.V. | Code 069 | |
References
- Haggar, F. A., Boushey, R. P. Colorectal cancer epidemiology: incidence, mortality, survival, and risk factors. Clin. Colon Rectal Surg. 22, 191-197 (2009).
- Fong, Y., et al. Liver resection for colorectal metastases. J. Clin. Oncol. 15, 938-946 (1997).
- Kato, T., et al. Therapeutic results for hepatic metastasis of colorectal cancer with special reference to effectiveness of hepatectomy: analysis of prognostic factors for 763 cases recorded at 18 institutions. Dis. Colon Rectum. 46, S22-S31 (2003).
- Poston, G. J., et al. OncoSurge: a strategy for improving resectability with curative intent in metastatic colorectal cancer. J. Clin. Oncol. 23, 7125-7134 (2005).
- Neumann, U. P., Seehofer, D., Neuhaus, P. The surgical treatment of hepatic metastases in colorectal carcinoma. Dtsch Arztebl Int. 107, 335-342 (2010).
- Alwayn, I. P., et al. A critical role for matrix metalloproteinases in liver regeneration. J. Surg. Res. 145, 192-198 (2008).
- Fausto, N., Campbell, J. S., Riehle, K. J. Liver regeneration. Hepatology. 43, S45-S53 (2006).
- Fujiyoshi, M., Ozaki, M. Molecular mechanisms of liver regeneration and protection for treatment of liver dysfunction and diseases. J. Hepatobiliary. Pancreat. Surg. 18, 13-22 (2011).
- Jin, X., et al. Paradoxical effects of short- and long-term interleukin-6 exposure on liver injury and repair. Hepatology. 43, 474-484 (2006).
- Nakamura, T., Sakai, K., Nakamura, T., Matsumoto, K. Hepatocyte growth factor twenty years on: Much more than a growth factor. J. Gastroenterol. Hepatol. 26, 188-202 (2011).
- Van Sweringen, H. L., et al. CXC chemokine signaling in the liver: impact on repair and regeneration. Hepatology. 54, 1445-1453 (2011).
- Heijboer, A. C., et al. Sixteen hours of fasting differentially affects hepatic and muscle insulin sensitivity in mice. J. Lipid Res. 46, 582-588 (2005).
- Yang, S. Q., Lin, H. Z., Mandal, A. K., Huang, J., Diehl, A. M. Disrupted signaling and inhibited regeneration in obese mice with fatty livers: implications for nonalcoholic fatty liver disease pathophysiology. Hepatology. 34, 694-706 (2001).
- Selzner, M., Clavien, P. A. Failure of regeneration of the steatotic rat liver: disruption at two different levels in the regeneration pathway. Hepatology. 31, 35-42 (2000).
- Matsuo, T., et al. Control mechanism of the circadian clock for timing of cell division in vivo. Science. 302, 255-259 (2003).
- Iakova, P., Awad, S. S., Timchenko, N. A. Aging reduces proliferative capacities of liver by switching pathways of C/EBPalpha growth arrest. Cell. 113, 495-506 (2003).
- Pritchett-Corning, K. R., Luo, Y., Mulder, G. B., White, W. J. Principles of rodent surgery for the new surgeon. J Vis Exp. , (2011).
- Skoulis, N. P., James, R. C., Harbison, R. D., Roberts, S. M. Depression of hepatic glutathione by opioid analgesic drugs in mice. Toxicol. Appl. Pharmacol. 99, 139-147 (1989).
- Berson, A., et al. Mechanisms for experimental buprenorphine hepatotoxicity: major role of mitochondrial dysfunction versus metabolic activation. J. Hepatol. 34, 261-269 (2001).
- Baker, D. G. Natural pathogens of laboratory mice, rats, and rabbits and their effects on research. Clin. Microbiol. Rev. 11, 231-266 (1998).
- FELASA working group on revision of guidelines for health monitoring of rodents and rabbits. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
- Nikfarjam, M., Malcontenti-Wilson, C., Fanartzis, M., Daruwalla, J., Christophi, C. A model of partial hepatectomy in mice. J. Invest. Surg. 17, 291-294 (2004).
- Hori, T., et al. Simple and reproducible hepatectomy in the mouse using the clip technique. World J. Gastroenterol. 18, 2767-2774 (2012).
- Mitchell, C., Willenbring, H. A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice. Nat. Protoc. 3, 1167-1170 (2008).
- Sowa, J. P., et al. Extent of liver resection modulates the activation of transcription factors and the production of cytokines involved in liver regeneration. World J. Gastroenterol. 14, 7093-7100 (2008).
- Bonninghoff, R., et al. Effect of different liver resection methods on liver damage and regeneration factors VEGF and FGF-2 in mice. Can. J. Surg. 55, 389-393 (2012).
