Autoradiographiebild Messungen von [¹⁴ C] -Iodoantipyrine in Rattengehirn Nach Central Post-Stroke Schmerz

Summary

We present a protocol to measure [¹⁴C]-iodoantipyrine (IAP) uptake and assess the activation of neural substrates that are involved in central post-stroke pain (CPSP) in a rodent model.

Abstract

Approximately 8% of stroke patients present symptoms of central post-stroke pain (CPSP). CPSP is associated with allodynia and hypersensitivity to nociceptive stimuli. Although some studies have shown that neuropathic pain may involve the dorsolateral prefrontal cortex, rostral anterior cingulate cortex, amygdala, hippocampus, periaqueductal gray, rostral ventromedial medulla, and medial thalamus, the neural substrates and their connections that mediate CPSP remain unclear. [¹⁴C]-Iodoantipyrine (IAP) uptake can be measured to evaluate spontaneously active pain. It can be used to assess the activation of neural substrates that may be involved in CPSP in an animal model. The [¹⁴C]-IAP method in rats is less expensive to perform compared with other brain mapping techniques. The present [¹⁴C]-IAP protocol is used to measure the activation of neural substrates that are involved in CPSP that is induced by lesions of the ventral basal nucleus (VB) of the thalamus in a rodent model.

Introduction

Schlaganfall Blutung wurde in mehr als 8% der Patienten auftreten gezeigt , die unter neuropathischen Schmerzen leiden, die als zentrale nach Schlaganfall Schmerz (CPSP). ^1-3 CPSP von somatosensorischen Dysfunktion führen kann, wodurch die Induktion Überempfindlichkeits und Allodynie. ⁴ jedoch bleiben die pathophysiologischen Mechanismen der somatosensorischen Dysfunktion in CPSP unsicher. Beispielsweise führt der Verlust von Körperempfindungen von neuronalen Deafferentation im hämorrhagischen Hirnareals. Hyperalgesie kann durch die Übererregbarkeit des zentralen nozizeptiven Neuronen oder zentrale Enthemmung, ^{5, 6} , aber die neuronalen Substrate verursacht werden , die in CPSP Symptome beteiligt sind , bleiben unbekannt. Einige Studien haben vorgeschlagen , dass die dorsolateralen präfrontalen Kortex (DPFC), rostralen anterioren cingulären Cortex (ACC), der Amygdala, Hippocampus, periaqueductal grau (PAG), rostral ventromedialen Medulla und ihre Verbindungen miteinander nozizeptiven Verarbeitung vermitteln. ⁷ Zusätzlichein Schmerzen im Zusammenhang mit der Wahrnehmung beteiligt. ⁸ Daten über die pathophysiologischen Mechanismen von CPSP sind vielfältig, und die Aktivierung der neuronalen Substrate in CPSP muss eine weitere Prüfung ly wurden medialen präfrontalen Kortex (mPFC) -amygdala Schaltungen gezeigt.

^[14 C] -Iodoantipyrine (IAP) Aufnahme wird verwendet , indirekt zu beobachten , regionale Hirndurchblutung (rCBF), die eine Beziehung zwischen Gehirnaktivität und CBF übernimmt. Obwohl ^[14 C] -IAP nicht die Gehirnaktivität in Echtzeit, wie zum Beispiel mit der funktionellen Magnetresonanztomographie (fMRI) beurteilen kann, hat es mehrere Vorteile. Zum Beispiel ^[14 C] -IAP ist zur Messung von spontan auftretenden Gehirn Ereignisse während pathologischen Zuständen geeignet. ⁹ Außerdem ^[14 C] -IAP Aufnahme ohne Anästhesie gemessen wird. Es kostet auch weniger als andere Abbildungsverfahren, einschließlich fMRI und Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Die ^[14 C] -IAP Verfahren ist vorgeschlagen worden , für measurin geeignet seing spontane Schmerzen (zB CPSP) , die durch Läsionen des ventralen Nucleus basalis (VB) des Thalamus induziert wird. ⁹

Das vorliegende Protokoll beschreibt , wie die ^[14 C] -IAP Verfahren auszuführen , um die Beteiligung von neuronalen Substrate CPSP zu bewerten , die durch Läsionen der VB des Thalamus in einem Tiermodell induziert wird. Die Technik bietet eine Möglichkeit, die pathophysiologischen Mechanismen der Bestimmung, dass CPSP Symptome an den Verhaltens- und neuronale Ebenen zugrunde liegen.

Protocol

Das Protokoll in der vorliegenden Studie erhielt die Genehmigung von der Academia Sinica Institutional Animal Care and Utilization Ausschuss in Taiwan. 1. Tierpräparate Erhalten männliche Sprague-Dawley-Ratten (etwa 300-400 g). Pflegen Sie die Ratten in einem klimatisierten Raum (21 – 22 ° C, 50% Luftfeuchtigkeit) unter einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Zyklus (Licht um 8:00 Uhr auf) mit freiem Zugang zu Nahrung und Wasser. 2. Experimentelles Verf…

Representative Results

1A zeigt die experimentelle Zeitleiste. Die Ratten wurden auf den Schein und CPSP Gruppen für die Verhaltenstests (dh von Frey – Test und Plantar – Test) zugeordnet. Am ersten Tag des Experiments diente als Basislinie, und Tests in den Wochen wurden wiederholt, 1 – 5 PE-50-Katheterisierung wurde die Vena jugularis externa in Woche 4 durchgeführt Heparin (20 U / ml, 0,1 ml / Tag) während injiziert wurde Woche 4 und 5 Fünf Minuten nach der Heparin – Injektion,…

Discussion

In den Verhaltenstests zeigten die CPSP Gruppe Reduzierungen des Pfotenrückzugsschwelle bei der thermischen Schmerztest und mechanische Kraft in der Prüfung von Frey zu Beginn der Studie und Wochen . 1 – 5. Die Ergebnisse mit einer früheren Studie waren konsistent ¹⁴

Die ^[14 C] -IAP Verfahren beruht auf der Pixel – Intensität von Gehirnbildern für die quantitative Analyse von Gehirnschnitten. Um die Daten in den Gehirnbilder auszuwerten, wurde die Pixelsignalintens…

Materials

Anesthetic:
Isoflurane	Halocarbon Products Corporation	NDC 12164-002-25	4%
Surgery
homeothermic blanket system	Harvard Apparatus	Model 50–7079	body temperature were maintained at 36.5-37.5°C.
10µl micro syringe	Hamilton	80008, Model 1701SN	injected with collagenase
polyethylene-50 tubing	Becton, Dickinson and Company	427411	catheterized into external jugular vein
1 c.c syringe	Terumo Medical Products	SS-01T	injected with 14C-IAP and saline.
saline (Sodium Chloride 0.9gm)	Taiwan Biotech Co., LTD.	100-130-0201	To flush the tube
Drugs:
type 4 collagenase	Sigma	C5138-500MG	0.125 U
Gentamicin	Sigma	G1264-250MG	6 mg/kg
Heparin	Sigma	H9399	20 U/ml; 0.1 ml/day
14C-iodoantipyrine (IAP)	PerkinElmer	NEC712	125 mCi/kg in 300 ml of 0.9% saline
Potassium chloride	Merck	1.04936.1000	3 M
Behavior system:
von Frey esthesiometer	Fabrication Enterprises, Inc.	Baseline Tactile Monofilaments 12-1666	mechanical hyperalgesia was assessed by measuring the withdrawal response to a mechanical stimulus
plantar test apparatus	IITC Life Science	IITC 390G Plantar Test	Thermal hyperalgesia was assessed by measuring the hind paw withdrawal latency in response to radiant heat.
Brain slice:
Optimal Cutting Temperature compound	Sakura Fintek Inc	4583	embedded the brain
dry ice			frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55°C)
methylbutane	Sigma	M32631-1L	frozen in dry ice/methylbutane (approximately −55°C)
Cryostat	Leica Biosystems Nussloch GmbH, Germany	Leica CM1850	Coronal brain slice were sectioned on this machine.
Data analyze
exposure cassettes with a phosphor screen	Amersham Biosciences	20 cm x 25 cm	The slices were dried on glass slides and placed alongside five standard filter papers with graded radioactivity. All of the slides were exposed to the cassettes at −20°C.
γ-counter	Beckman Coulter	Beckman LS 6500 Liquid Scintillation Counter	To measure the radioactivity count of the filter papers.
Typhoon 9410 Variable Mode Imager	GMI, Inc.	WS-S9410	To read  phosphor screen which was exposed by brain slice
Statistical Parametric Mapping (SPM)	Wellcome Centre for Neuroimaging	version 8	all of the brains were averaged to create the final brain template. To determine significant differences between the images in these two groups, the images were derived by subtracting the sham group from the CPSP group.
ImageJ	http://imagej.nih.gov/ij	version 1.46	Adjacent sections were aligned both manually and using Stack- Reg, an automated pixel-based registration algorithm in ImageJ software. All of the original three-dimensionally reconstructed brains were smoothed and normalized to the reference rat brain model.
Matlab	MathWorks	version 2009b	used Pearson correlation coefficients to examine the relationships between the CPSP and sham groups. An inter-regional correlation matrix was calculated across animals from each group.
Pajek	http://Pajek.imfm.si/	version 3.06	Graphical theoretical analysis was performed on networks defined by the above correlation matrices using Pajek software.