Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.
अपरा एक अतिरिक्त भ्रूण वंश, ट्रोफेक्टोडर्म से निकला है। पेरी-आरोपण murine ब्लास्टोसिस्ट में, भित्ति ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं प्राथमिक trophoblast विशाल कोशिकाओं (TGCs) में अंतर है, जबकि ध्रुवीय ट्रोफेक्टोडर्म आंतरिक कोशिका द्रव्यमान overlying बाद में माध्यमिक TGCs में फर्क पैदा करने के लिए जारी है। TGCs विकासशील नाल में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं और एक सफल गर्भावस्था के लिए आवश्यक हैं। बाद आरोपण के विकास के दौरान विशिष्ट जीन के नियमन की जांच TGCs विकास में अंतर्दृष्टि दे सकते हैं। हमल (E7-7.5) के 7-7.5 दिनों में भ्रूण से ectoplacental कोन (ईपीसी), ध्रुवीय ट्रोफेक्टोडर्म से प्राप्त कोशिकाओं, माध्यमिक TGCs 1 में अंतर है। TGCs बगल में अध्ययन किया जा सकता है, E7 में भ्रूण की cryostat वर्गों पर हालांकि TGCs की संख्या को इस स्तर पर बहुत कम है। माध्यमिक TGCs का विश्लेषण करने के वैकल्पिक साधन E7 भ्रूण से अलग-अलग निर्यात संवर्धन परिषदों के अल्पकालिक संस्कृतियों का उपयोग करने के लिए हैएस। हम एक तकनीक का प्रस्ताव दोनों विवो में और सीटू संकरण (आरएनए मछली) में फ्लोरोसेंट का उपयोग कर नवजात टेप कल्पना करने के लिए एकल कोशिका के स्तर पर इन विट्रो में ब्याज की जीन के स्थिति की जांच करने के लिए। इस तकनीक जीन अभिव्यक्ति का एक सीधा readout प्रदान करता है और TGCs के गुणसूत्र स्थिति है, जो बड़ी endoreplicating कोशिकाओं रहे हैं के आकलन के लिए सक्षम बनाता है। दरअसल, TGCs के टर्मिनल भेदभाव की एक प्रमुख विशेषता यह है कि वे सेल चक्र से बाहर निकलें और endoreplication.This दृष्टिकोण के कई दौर से गुजरना autosomes और / या सेक्स क्रोमोसोम से व्यक्त किसी भी जीन की अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए आवेदन किया जा सकता है और विकास में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकता है तंत्र के साथ ही अपरा रोगों।
स्तनधारी trophoblast विशाल कोशिकाओं (TGCs) मातृ एवं भ्रूण के ऊतकों के बीच एक बाधा के रूप में। वे गर्भाशय में आरोपण और conceptus के आक्रमण मध्यस्थता और प्लेसेंटा के गठन के लिए विकास में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। वे कई वृद्धि कारक (साइटोकिन्स) और प्रोलैक्टिन / अपरा Lactogen परिवार और स्टेरॉयड, भ्रूण के विकास और अस्तित्व के लिए आवश्यक के हार्मोन का उत्पादन। TGCs, बड़े mononucleated और polyploid एक कोशिका चक्र, endocycle, कि एस और जी के चरण बारी के होते हैं साथ कोशिकाओं रहे हैं। दरअसल, TGCs कोशिकाओं, किसी भी डिवीजन 2 के बिना डीएनए संश्लेषण के कई दौर से गुजरना करने में सक्षम endoreplicating रहे हैं। आदेश ट्रांसक्रिप्शनल अन्य भ्रूण और extraembryonic प्रकार की कोशिकाओं की तुलना में vivo में जीन की स्थिति, TGCs में जांच करने के लिए, नवजात आरएनए मछली विशिष्ट बाद आरोपण चरणों में cryostat वर्गों 3 पर विवो में प्रदर्शन किया जा सकता है। TGCs उनके व्यापार के कारण वर्गों पर आसानी से पहचानने योग्य होते हैंआर बड़े आकार और उनकी transcriptional जीन गतिविधि दर्ज की जा सकती है, लेकिन जल्दी बाद आरोपण चरणों में उनकी संख्या कम है। E7 भ्रूण वर्गों पर TGCs की कमी, ट्रोफेक्टोडर्म विकास के दौरान जीन अभिव्यक्ति के नियमन का अध्ययन करने के क्रम में विभेदित TGCs प्राप्त करने के लिए भ्रूण trophectodermal ऊतकों की अल्पकालिक संस्कृतियों प्रदर्शन करने के लिए हमें का नेतृत्व किया। इसके अलावा, आदेश में संभव के रूप में शारीरिक रूप रहने के लिए, स्थापित सेल लाइनों यानी ट्रोफेक्टोडर्म कोशिकाओं (टीएस) स्टेम हमेशा विकास तंत्र पीढ़ी की जांच करने के माध्यमिक TGCs असामान्य जीन के कारण TGCs में दोष के साथ जुड़े रोग गर्भधारण अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान उपयुक्त नहीं हैं चूहों में विनियमन।
Ectoplacental कोन (ईपीसी) का ट्रोफोब्लास्ट कोशिकाओं माध्यमिक TGCs 4 के पूर्ववर्ती हैं। माध्यमिक TGCs को सुसंस्कृत निर्यात संवर्धन परिषदों के सहज भेदभाव पहले से सूचित कर दिया गया है 5। हालांकि, प्राथमिक TGCs, माध्यमिक टी जी सी एडवेंचर्स पर अध्ययन करने के लिए इसके विपरीत मेंtiation presumablydue ईपीसी explants किसी भी मातृ या भ्रूण के ऊतकों का नि: शुल्क अलग-थलग करने की कठिनाइयों को सीमित बनी हुई है। हम इन तरीकों अनुकूलित, आदेश E7, एक विकासात्मक बाद आरोपण मंच है जहां TGCs बहुत कुछ कर रहे हैं, लेकिन ईपीसी व्यापारियों से उत्पन्न किया जा सकता है पर अलग-अलग भ्रूण से प्राप्त होता माध्यमिक TGCs पर आरएनए मछली प्रदर्शन करने में। परमाणु प्राथमिक टेप का विश्लेषण करने के लिए आरएनए मछली माध्यमिक TGCs पर एकल कोशिका के स्तर के स्तर पर कभी नहीं किया गया है। यह प्रतिलेखन के सटीक विश्लेषण की अनुमति देता है और बाद आरोपण चरणों 3 पर TGCs के epigenetic अस्थिरता को दिखाने के लिए इस्तेमाल किया गया था।
स्तनधारियों में एपिजेनेटिक्स का एक क्लासिक उदाहरण, एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता (XCI) सुना प्रयोगशाला 6 में अध्ययन किया है। इस प्रक्रिया में महिला में 2 एक्स क्रोमोसोम के एक निष्क्रिय है। गैर-कोडिंग Xist प्रतिलेख कोट एक्स गुणसूत्र जिसमें से यह महिला कोशिकाओं में व्यक्त किया है और सबसे जीन का मुंह बंद करने से चलाता है। आरएनए मछली का उपयोग कर,एक्स से जुड़े जीन की नवजात टेप कर सकते हैं के रूप में जांच की जा सकता निष्क्रिय एक्स गुणसूत्र (ग्यारहवीं) पर Xist शाही सेना के संचय। हम यहाँ आरोपण के बाद भ्रूण की वर्गों पर और ईपीसी के अल्पकालिक संस्कृतियों पर आरएनए मछली प्रदर्शन करने के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन। इस प्रोटोकॉल उन है कि महिला भ्रूण स्टेम कोशिकाओं और preimplantation भ्रूण 7-11 फर्क में XCI अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया से अनुकूलित। हम इन विट्रो TGCs के साथ ही इन विवो में महिला भ्रूण में XCI का उदाहरण देते हैं।
नवजात आरएनए मछली विभिन्न विकासात्मक चरणों में भ्रूण के ऊतकों में transcriptional गतिविधि के एकल कोशिका विश्लेषण के लिए एक आसान और संवेदनशील विधि का प्रतिनिधित्व करता है। इस दृष्टिकोण की शक्ति रूपात्मक मापदंड के अनुसार किसी विशेष स्तर पर अलग भ्रूण प्रजातियों की पहचान करने की क्षमता है। हालांकि यह भी जरूरी है कि कम से कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मौजूद है। इस तरह के किसी भी पृष्ठभूमि अलग भ्रूण क्षेत्रों और प्रकार की कोशिकाओं को चुनौती देने की पहचान प्रदान करता है। कम से कम पृष्ठभूमि सुनिश्चित करने के लिए, वहाँ इस प्रोटोकॉल में दो महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। पहले cryosection की गुणवत्ता है और दूसरी आरएनए मछली है, जो जीन अभिव्यक्ति के स्तर पर और जांच की गुणवत्ता पर निर्भर करता है की दक्षता (शोर अनुपात करने के लिए संकेत) है। बाद के लिए, जांच इसलिए हमेशा संवर्धित कोशिकाओं पर coverslips (भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं या दैहिक कोशिकाओं) वर्गों पर उपयोग करने से पहले पर परीक्षण कर रहे हैं।
इस प्रोटोकॉल में, हम वें प्रदानई तकनीक नमूना तैयार करने के दो अलग अलग प्रकार (cryostat वर्गों और भ्रूण explants की प्राथमिक संस्कृतियों) से TGCs पर आरएनए मछली विश्लेषण करने की आवश्यकता है। इस तरह के एकल कक्ष विश्लेषण विभिन्न बाद आरोपण चरणों में जीन अभिव्यक्ति में गतिशील परिवर्तन का आकलन किया जा करने के लिए सक्षम बनाता है।
हम तरीकों माध्यमिक TGCs उत्पन्न करने के लिए (E7-7.5 बाद आरोपण चरणों में) का वर्णन हमारी प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया एक अतिरिक्त भ्रूण वंश जो बाद आरोपण चरणों में TGCs का गठन किया है एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता पैटर्न का अध्ययन करने के लिए। मूषक में अतिरिक्त भ्रूण विकास TGCs के भेदभाव पर निर्भर करता है। दरअसल, TGCs अपरा और इस प्रकार भ्रूण के विकास के लिए आवश्यक हैं। टी जी सी भेदभाव में दोष भ्रूण मारक (समीक्षा के लिए संदर्भ में 15 देखें) के कारण। TGCs के Transcriptional गतिविधि आरएनए मछली का उपयोग कर हमें माउस विकास 3 के दौरान इस तरह के सेल प्रकार के एक असामान्य एक्स गुणसूत्र निष्क्रियता स्थिति प्रदर्शित करने के लिए अनुमति दी।
<p claएस एस = "jove_content"> तरीकों यहाँ प्रस्तुत प्राप्त करने और माध्यमिक TGCs अध्ययन करने के लिए, महत्वपूर्ण अतिरिक्त भ्रूण ऊतकों वे का हिस्सा हैं के विकास में आणविक मार्ग का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है दोनों सामान्य और उत्परिवर्ती चूहों में। इन तरीकों अन्य स्तनधारियों में टी जी सी विकास की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। हमारे विश्लेषण हमें इन विवो TGCs में और इन विट्रो TGCs ईपीसी explant से निकाली गई विभिन्न जीन के गतिविधि का आकलन करने के लिए अनुमति जंगली प्रकार माउस भ्रूण का उपयोग शामिल किया गया। इस विधि ट्रांसजेनिक चूहों और / या संस्कृति के माध्यम में अवरोध अणुओं के अलावा द्वारा विश्लेषण के लिए बढ़ाया जा सकता है। हम सफलतापूर्वक इस तरह के प्राथमिक TGCs जो माउस के विकास, E3.0 blastocyts के पहले चरण में दिखाई देते हैं, जो 4-5 दिन के दौरान जो परिणाम विकसित की है, के लिए व्यक्तिगत रूप से संवर्धित किया जा सकता है, TGCs का एक और प्रकार पर आरएनए मछली के इस विधि का इस्तेमाल किया है आईसीएम बड़े प्राथमिक TGCs 16,17 से घिरा रहा है। अलग करने के लिए नवजात टेपजीन के रूप में अच्छी तरह से Xist के रूप में कल्पना की और एक ही आरएनए मछली दृष्टिकोण 3 का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।संयुक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस और आरएनए मछली भी इन विट्रो सुसंस्कृत TGCs 3 के रूप में रूप में अच्छी तरह cryostat वर्गों पर प्रदर्शन किया जा सकता है। यह दर्शाता है कि विधि काफी मजबूत है, के रूप में प्राथमिक टेप अत्यधिक क्षरण करने के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं और वहाँ RNase मुक्त यौगिकों के एक परम आवश्यकता है। यदि / आरएनए मछली प्रतिलेखन के स्तर, सेलुलर स्थानीयकरण और प्रोटीन अभिव्यक्ति, एक साथ एक दिया सेल में के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, आयल एम्बेडेड ऊतक के कुछ वर्गों में पहले मानव ट्यूमर में नवजात आरएनए का पता लगाने के लिए है जबकि, ऊतक आकृति विज्ञान 18 को बनाए रखने के लिए हमारे हाथ में इस्तेमाल किया गया है, cryostat वर्गों दोनों नवजात शाही सेना और epitopes immunofluorescence दौरान एंटीबॉडी द्वारा पता लगाने के लिए आवश्यक संरक्षण के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।
आरएनए मछली के लिए इसके अलावा, निम्न immunofluorescence, गुणसूत्र डीएनए मछली भी fluorochromes, आरएनए मछली 3 के लिए इस्तेमाल किया उन लोगों के लिए समान के साथ लेबल जांच का उपयोग माध्यमिक TGCs पर प्रदर्शन किया जा सकता है। फ्लोरोसेंट जांच या तो plasmids / fosmids या बेक्स, के रूप में यहां इस्तेमाल किया फ्लोरोसेंट dUTPs के साथ लेबल, और Chaumeil एट अल।, 8 में वर्णित किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, fluorescently लेबल ओलईगोन्युक्लियोटाईड्स 19 का इस्तेमाल किया जा सकता है। चूंकि डीएनए मछली कतरा-विशिष्टता की आवश्यकता नहीं है, oligonucleotide जांच लक्ष्य क्षेत्र में दो पूरक किस्में दोनों में से किसी को निशाना बनाया जा सकता है। शाखित डीएनए जांच, जहां संकेत प्रवर्धन विशिष्ट और एम्पलीफायर जांच के दो अनुक्रमिक दौर से हासिल की है भी मछली संकेतों 20 का संकेत करने वाली शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, इस तरह के riboprobes रूप में शाही सेना जांच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, हालांकि हमारे डीएनए आधारित जांच में संकेत गुणवत्ता, विशिष्टता और उपयोग में आसानी के बीच बेहतर तालमेल की गारंटी।
अंत में, 3 डी छवि अधिग्रहणपर इन बड़े कोशिकाओं में आवश्यक स्थानिक जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक है, और इस तरह के DeltaVision (GEH) के रूप में इस तरह के Apotome माइक्रोस्कोप के रूप में प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी, या deconvolution साथ epifluorescence माइक्रोस्कोप की एक किस्म का उपयोग किया जा सकता है, या अन्य उपयुक्त माइक्रोस्कोप इमेजिंग ऊतक वर्गों, और बड़े के लिए (> 20 माइक्रोन) TGCs। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक प्रति डीएनए लोकी के लिए, कबरा नवजात आरएनए मछली या डीएनए मछली द्वारा पता लगाया संकेत आसानी से confocal माइक्रोस्कोपी से नहीं पाया जा सकता है।
अंत में, तरीकों हम यहाँ वर्णन उपयोगी दोनों एक विकासात्मक संदर्भ में TGS का विस्तृत विश्लेषण के लिए, लेकिन यह भी अन्य बीमारी की स्थिति में होना चाहिए। कई जीनों कि कृन्तकों में टी जी सी के विकास और समारोह में शामिल कर रहे हैं इस तरह के प्रतिलेखन कारक, proteases और सेल आसंजन अणुओं के रूप में 21 मूषक और मनुष्यों के बीच संरक्षित कर रहे हैं। माउस TGCs का अध्ययन जीन है कि अपरा विकास एक को विनियमित करने के लिए एक सेल मॉडल हैंडी इसलिए मानव अपरा रोगों में अंतर्दृष्टि दे। इसके अलावा, इस तथ्य के कारण है कि इन कोशिकाओं endoreplicating कर रहे हैं और कुछ के बाद से कैंसर की कोशिकाओं को endocycle कार्यक्रमों संलग्न हैं, जीन प्रवर्धन प्रक्रियाओं के अलावा, विधियों का वर्णन हम भी एकल कोशिका कैंसर की कोशिकाओं में अस्थिरता जीनोम को अग्रणी तंत्र का पता लगाने के लिए आवश्यक जांच में मददगार होना चाहिए ।
The authors have nothing to disclose.
हम चित्र के साथ मदद के लिए सोफी Gournet धन्यवाद, पांडुलिपि, पशु आवास सुविधा और यूनिट के इमेजिंग मंच पढ़ने के लिए जूली Chaumeil। इस काम के तहत कार्यक्रम «INVESTISSEMENTS डी Avenir» समर्थन प्राप्त संदर्भों ANR-10-LABX-0044 और ANR-10-IDEX-0001-02 पीएसएल, EpiGeneSys FP7 कोई साथ फ्रेंच सरकार द्वारा शुरू की और ANR द्वारा लागू किया गया है। एह करने के लिए उत्कृष्टता के 257,082 नेटवर्क, एक ईआरसी उन्नत अन्वेषक कोई पुरस्कार। 250367 और यूरोपीय संघ के FP7 SYBOSS कोई अनुदान। 242129 एह लेखकों प्रकाश के साथ मदद के लिए संस्थान क्यूरी, फ्रांस-Bioimaging (ANR-10-InSb-04) के सदस्य की आनुवंशिकी और विकास जीवविज्ञान विभाग (UMR3215 / U934) की सेल और ऊतक इमेजिंग मंच स्वीकार करना चाहते हैं माइक्रोस्कोपी।
Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
Coverslips 18×18 | VWR | 631-1331 | |
Coverslips 22×22 | VWR | 631-0125 | |
12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20°C |
Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
Cryostat | Leica | CM3050 |