Abstract
De placenta afgeleid van een extra-embryonale afstammingslijn, de trophectoderm. In de peri-implantatie muizen blastocyst, muurschildering trophectoderm cellen differentiëren in primaire trophoblast giant cellen (TGCs), terwijl de polaire trophectoderm bovenop de binnenste celmassa blijft woekeren later differentiëren tot secundaire TGCs. TGCs spelen een sleutelrol in de placenta en zijn essentieel voor een succesvolle zwangerschap. Onderzoek van transcriptionele regulatie van specifieke genen tijdens post-implantatie ontwikkeling kan inzichten in TGCs ontwikkeling. Cellen van de ectoplacental conus (EPC) van embryo's in 7-7.5 dagen dracht (E7-7.5), afgeleid van het polaire trophectoderm, differentiëren tot secundaire TGCs 1. TGCs kunnen worden bestudeerd in situ op vriescoupes van embryo's in E7 hoewel het aantal TGCs zeer laag in dit stadium. Een alternatief middel van het analyseren van secundaire TGCs is om op korte termijn culturen van individuele EPC's te gebruiken van E7 embryos. Wij stellen een techniek om de transcriptionele status van genen van belang zowel in vivo en in vitro bij de enkele-celniveau via fluorescentie in situ hybridisatie (FISH RNA) op beginnende transcripten visualiseren onderzoeken. Deze techniek biedt een directe uitlezing van genexpressie en maakt de beoordeling van de chromosomale status van TGCs die groot endoreplicating cellen. Inderdaad, een belangrijk kenmerk van terminale differentiatie van TGCs is dat ze de celcyclus verlaten en ondergaat meerdere ronden van endoreplication.This benadering kan worden toegepast om expressie van elk gen tot expressie gebracht uit autosomen en / of geslachtschromosomen detecteren en kan belangrijke informatie verschaffen aan ontwikkelings- mechanismen en placenta ziekten.
Introduction
Zoogdiercellen trophoblast giant cellen (TGCs) vormen een barrière tussen moeder en embryonale weefsels. Zij bemiddelen implantatie en invasie van de conceptie in de baarmoeder en spelen cruciale rol in de ontwikkeling voor de vorming van de placenta. Ze produceren een aantal groeifactoren (cytokinen) en hormonen van de familie en steroïden prolactine / placenta lactogeen, noodzakelijk voor de embryonale groei en overleving. TGCs zijn groot, mononucleaire en polyploïde cellen met een celcyclus, de endocycle, die bestaat uit afwisselende S- en G fasen. Inderdaad, TGCs worden endoreplicating cellen, in staat om meerdere rondes van DNA-synthese te ondergaan zonder enige divisie 2. Om de transcriptionele status van genen in vivo, in vergelijking met andere TGCs embryonale en extra-embryonale celtypen te onderzoeken, kunnen ontluikende RNA FISH in vivo worden uitgevoerd op vriescoupes 3 op specifieke post-implantatie fase. TGCs zijn gemakkelijk te herkennen op de afdelingen als gevolg van their grote omvang en hun transcriptie activiteit van genen kan worden opgenomen maar hun aantal in de vroege post-implantatie fase is laag. Gebrek aan TGCs op E7 embryonale secties, leidde ons naar de korte termijn culturen van embryonale trophectodermal weefsels uit te voeren om gedifferentieerde TGCs met het oog op de regulering van de genexpressie tijdens trophectoderm ontwikkeling te bestuderen verkrijgen. Bovendien, om zo fysiologische mogelijk blijven gevestigde cellijnen dwz trophectoderm stamcellen (TS) zijn niet altijd geschikt om te onderzoeken ontwikkelingsmechanismen genereren van secundaire TGCs een waardevol hulpmiddel pathologische zwangerschappen geassocieerd met defecten in TGCs gevolg van abnormale gen bestuderen regulering in muizen.
Trofoblast cellen van de ectoplacental kegel (EPC) zijn voorlopers van secundaire TGCs 4. Spontane differentiatie van gekweekte EPC secundaire TGCs eerder gemeld 5. In tegenstelling tot primaire TGCs, studies op secundaire TGC Gesplitstetiatie zijn beperkt gebleven, presumablydue om de problemen van het isoleren van EPC explantaten vrij van de moeder of de embryonale weefsels. Passen wij deze werkwijzen om RNA FISH voeren op secundaire TGCs afgeleid uit de individuele embryo E7, een ontwikkelings post-implantatie fase waarin TGCs zeer weinig maar kan worden gegenereerd uit EPC precursors. RNA FISH nucleaire primaire transcripten te analyseren is nog nooit gedaan op het niveau van de enkele cel niveau op secundaire TGCs. Dit maakt nauwkeurige analyse van transcriptie en werd gebruikt om de epigenetische instabiliteit van TGCs op post-implantatie fase 3 tonen.
Een klassiek voorbeeld van de epigenetica bij zoogdieren, wordt het X-chromosoom inactivatie (XCI) studeerde in de Heard lab 6. In dit proces een van de 2 X-chromosomen in vrouwelijke geïnactiveerd. De niet-coderende Xist transcript bedekt de X-chromosoom waarvan het tot expressie wordt gebracht in vrouwelijke cellen en triggers silencing van de meeste genen. Met behulp van RNA FISH,ontluikende transcripten van X-gebonden genen worden onderzocht evenals de accumulatie van Xist RNA op het inactieve X-chromosoom (Xi). We beschrijven hier een procedure voor RNA FISH voeren op secties van post-implantatie embryo's en op korte termijn culturen van EPC. Dit protocol aangepast van die die werden gebruikt om XCI bestuderen differentiatie vrouwelijke embryonale stamcellen en pre-implantatie embryo's 7-11. Wij voorbeelden van XCI bij vrouwelijke embryo's in vivo en in vitro TGCs.
Protocol
Dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedgekeurde institutionele Animal Care en gebruik commissie van het Institut Curie (CEEA-IC) protocollen (C 75-05-18). Het werk is ook uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van het Franse ministerie van Hoger Onderwijs en Onderzoek voor het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (overeenkomstnummer 5549CA-I).
1. Bereiding van cryostaatsecties
- Verzamel embryo van natuurlijk eisprong F1 C57BL / 6 x DBA / 2J muizen zoals beschreven in Shea et al., 12. Op dag 7 van de dracht (E7), offeren 8-12 weken oude muis door cervicale dislocatie. Verzamel de volledige conceptie ie decidua 12.
- Isoleer E7 conceptuses zoals beschreven in Shea et al., 12. Plaats ze in een 60 mm petrischaal met PBS.
- Bevries de E7 muis conceptie voor cryostaat secties.
- Bereid aangepast aluminiumfolie putten 1 cm in hoogte ( 'home-made' met een glazen Pasteur pipet). Deponeren een druppel tissue freezing medium aan de onderkant van dit kleine container. Storten de conceptie in de juiste oriëntatie (dat wil zeggen, voor langsprofielen de conceptie moet gehandhaafd in de horizontale richting).
- Vul het putje met de conceptie met weefsel bevriezen medium. Opschorten met een pincet in damp boven vloeibare N2, zodat het aan invriezen langzaam - dan Dompel het blok in de vloeibare N2 voor een paar seconden totdat het wordt wit. Vervolgens breng het blok in een ijskoude flesje en bewaar bij -80 ° C (kan meerdere maanden bewaren).
- Voordat cryo-snijden, plaatst het bevroren blok dat de conceptie bij -20 ° C in de cryostaat voor 30 min. Voer cryosecties van 8 urn dik. Deposit 4 secties op een dia om een efficiënte bevestiging mogelijk te maken. Plaats secties dicht genoeg om te passen in het kader van een 18 x 18 mm 2 dekglaasje.
- Controleer de kwaliteit van desecties (intact en zonder krassen) en richting van de embryo (langsprofielen) met een stereomicroscoop en kies de secties geschikt zijn voor verdere analyse. ze zo snel mogelijk te deponeren in een Coplin pot en het uitvoeren van RNA FISH (zie 3.3.2).
2. Voorbereiding van de secundaire TGCs
- Isoleer de Conceptus (zie 1.1 en 1.2).
- Ontleden de E7 Ectoplacental Cone (EPC)
- Gebruik een stereomicroscoop en platen met steriele PBS. Ontleden de decidua met een tang. Pierce het monster open tang om de twee kanten van de decidua verscheuren.
- Dop van het embryo. Gebruik uiteinden gesloten fijne pincet (Dumont No. 5) in een schaar-achtige werking op de EPC van de embryo scheiden. Met speciale aandacht aan een perfect schoon monster te verkrijgen, gescheiden van maternale weefsels alsmede van chorion en dooierzak. Spoel de EPC explantaten in PBS.
- Met een beetje Schep individuele ontleed EPC naar een 4-well plaat met een steriele dekglaasje in medium.
- Leid TGCs van EPC's op korte termijn culturen.
- Bereid 4-well platen met dekglaasjes. Steriliseren 12 mm diameter ronde glazen dekglaasjes door onderdompeling in ethanol, gevolgd door vlam-gedroogd.
- Voeg 0,5 ml EPC medium aan elk putje (EPC medium: RPMI 1640 aangevuld met 15% FCS, 0,1 mM 2-mercaptoethanol en antibiotica).
- Storting één, ontleed-EBV in het midden van het dekglaasje in de put met kweekmedium. Gebruik fijne tang om de EPC toe te passen op het glas dekglaasje. Culturefor 3-5 dagen bij 37 ° C, 5% CO2. Individuele explantaat vormt een uitgroei dat zich verspreidt als een monolaag van afgeplatte TGCs (Figuur 2A).
3. RNA FISH
OPMERKING: De protocollen zijn gebaseerd op die beschreven voor embryonale stamcellen (SER) in Chaumeil e.a., 8 en Pollex en Heard 13..
- geavanceerde Preparantsoen Stock Solutions
- Bereid een 3M natriumacetaatbuffer pH 5,2.
- Bereid 2x hybridisatiebuffer bevattende 40% (w / v) natriumdextransulfaat, 20x BSA, 400 mM Ribonucleoside Vanadyl Complex (VRC) in 4x Saline natriumcitraat (SSC).
- Bereid fixeermiddel dat 90% (v / v) glycerol, 0,1% (w / v) p-fenyleendiamine, pH 9 in PBS.
- Vers bereide oplossingen
- Bereid fixatief, bestaande uit 3% vers bereide paraformaldehyde (PFA) in PBS. Bereid permeabilisatie oplossing die 0,5% Triton-X-100 in PBS gesupplementeerd met 2 mM VRC. Bereid wasbuffer door het mengen van 50% formamide (FA) en 2x SSC en breng de pH op 7,2-7,4.
- Bereid DNA contra-kleuroplossing bestaande uit 1 ug / ml DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindool dihydrochloride) in 2x SSC.
- Fixatie en Permeabilisatie in voorbereiding voor FISH
- Voor cellen op dekglaasjes, wassen cellen in 1x PBS gedurende 5 min. Fix cellen op dekglaasjes of embryonale secties op objectglaasjes gedurende 10 minuten in fixeermiddel (3% PFA) oplossing bij kamertemperatuur.
- Spoel de cellen drie maal met 1 x PBS. Doorlaatbaar cellen gedurende 5 min in ijskoude permeabilisatie oplossing op ijs. Was de cellen drie keer met 70% ethanol. WINKEL dekglaasjes in 4 putjes en dia in 4-slide transport box aan 70% ethanol bij -20 ° C.
OPMERKING: dekglaasjes en dia's kunnen worden opgeslagen gedurende verscheidene maanden bij -20 ° C. Platen en dozen die ze bevatten moeten worden afgedicht met parafilm ethanol verdamping te voorkomen.
- DNA Probe Labeling
- Label DNA-probes door nick-translatie met fluorescerende nucleotiden. Volg de instructies van de fabrikant (zie tabel 1) 8.
- Voor een 50 pi reactie mix, voeg 1-2 ug plasmide, bacteriële kunstmatige chromosomen (BAC) of meervoudige verplaatsing amplificatie (MDA) (voor DNA-amplificatie, zie 3.4.4) DNA tot 17,5 ui water, 2,5 ul 0,2 mMSR-, SG, Cy5-dUTP, 10 pi 10 mM van elke dNTP mix (dGTP, dATP, dCTP), 5 ui 10 mM dTTP, 5 ui 10x nick vertaling buffer en 8 pi nick translatie-enzym.
- Incubeer gedurende 16 uur bij 15 ° C in het donker. Inactiveren reactie bevroren bij -20 ° C. WINKEL probes maanden bij -20 ° C.
- MDA
LET OP: Voor BAC DNA, hoeveelheid DNA verkregen na de klassieke bereiding is laag, daarom kan men een stap van DNA-amplificatie gebruiken voordat labeling met behulp van MDA. Gebruik een commerciële kit en volg de instructies van de fabrikant (zie tabel 1). - Meng 0,5 ul BAC DNA met 9,5 pl monsterbuffer. Verhit 3 min bij 95 ° C. Onmiddellijk blussen op het ijs; achterlaten op ijs 10 min. Bereid reactie buffer / enzymmengsel: (9,5 pl + 0,5 pi enzym mix) en blijf op ijs.
- Meng 10 pl DNA mix + 10 gl reactiebuffer / enzymmengsel. Incubeer bij 30 ° C ten minste 20 uur. Inactiveer enzym door verwarmen monster 10 minuten bij 65 & #176; C. Koel monster tot 4 ° C voor bewaren bij -20 ° C.
- Controleer MDA door de spijsvertering. Voeg 1 pl MDA, 2 ui 10x buffer, 2 pl HindIII en 15 ui H2O Incubeer bij 37 ° C overnacht. Draaien langzaam op een 0,8-1% agarosegel om nauwkeurige DNA-amplificatie te bevestigen. Duidelijke DNA-fragmenten met hoog molecuulgewicht worden waargenomen op de gel.
- probe Voorbereiding
- Gebruik 0,1 of 1 ug probe per dekglaasje of dia.
LET OP: Voeg 2-5 ug Cot-1 DNA wanneer de concurrentie vereist is, bijvoorbeeld, de meeste probes zoals ze repeat sequenties die anders kruis hybridiseren kan bevatten en verhoging achtergrond.- Precipitatie, voeg 5 ug zalmsperma-DNA, 1/10 volume 3 M natriumacetaat pH 5,2 en 3 volumes ethanol. Centrifugeren op 16.000 xg en 4 ° C gedurende 25 minuten. Was pellets met 70% ethanol en spin down opnieuw voor 5 min.
- Droge pellet gedurende 2 minuten in een concentrator / speed vac. Resuspendeer in 100% vormamide in de helft van het volume dat nodig is voor hybridisatie (bijvoorbeeld 2,5 ul voor dekglaasje of 7 pi van embryonaal secties op dia). Breng 30 min bij 37 ° C onder schudden in een thermomixer. Denaturatie gedurende 7 min bij 75 ° C.
- Doof op ijs, of wanneer de concurrentie is vereist direct bij 37 ° C gedurende 30-60 min te zetten. Meng de probe-oplossing met een gelijk volume van 2x hybridisatieoplossing.
- Gebruik 0,1 of 1 ug probe per dekglaasje of dia.
- Hybridisatie en Washes
- uitdrogen; dekglaasjes in putten en dia's in een Coplin jar, door achtereenvolgende wassen in 1 x 80%, 95% 1x en 2x 100% ethanol gedurende 5 minuten elk. Droge dekglaasjes en dia volledig.
- Voor hybridisatie, gelden de 5 pi probe hybridisatie mix (zie 3.5) op een glijbaan en laat het dekglaasje, met cellen uitkijkend op de hybridisatie mix. Voor secties op dia, gelden 14 pi probe hybridisatie mix (zie 3.5) en dek af met een 18 x 18 mm 2 dekglaasje.
- Plaats de glaasjes in een vochtige kamer (vloeipapier gedrenkt in50% FA / 2x SSC) en incubeer bij 37 ° C gedurende de nacht, in het donker.
- Post-hybridisatie Wast:
- Voeg 1 ml van 50% FA / 2x SSC op de dekglaasje op de dia om het los te maken; verwijder voorzichtig het dekglaasje van de glijbaan (let op dat de cellen niet te schrapen) en plaats het cel-kant naar boven in een 4-wells plaat met 50% FA / 2x SSC. Voor secties op dia Verwijder het dekglaasje op dezelfde wijze en plaats de dia in een Coplin pot met 50% FA / 2x SSC.
- 3 wassingen uitvoeren, elk voor 7 min met voorverwarmde 50% FA / 2xSSC bij 42 ° C of 44 ° C gedurende dekglaasje of dia respectievelijk.
- Voer 3 wassingen met voorverwarmd 2x SSC gedurende 5 min elk bij 42 ° C of 44 ° C gedurende dekglaasje of dia respectievelijk.
- Tegenkleuring kernen door wassen in 2 x SSC met 1 ug / ml DAPI gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur. Spoel tweemaal met 2x SSC.
- Montage van Coverslips en dia's
- Voor kleine dekglaasje uit gekweekte TGCs, gelden 5 & #181; l montage medium op een dia. Plaats het dekglaasje cel naar beneden op de top van de druppel.
- Voor dia met secties, gelden 15 ul montage medium op de dia. Plaats een 22 x 22 mm 2 dekglaasje bovenop de druppel.
- Vermijd bubbels. Veeg overtollige montage oplossing. Seal het dekglaasje met een kleine hoeveelheid van nagellak. Indien mogelijk beeld schuift onmiddellijk of bewaar tot enkele maanden bij -20 ° C.
4. Microscopie en analyse
- Acquire 3D opeenvolgende beelden z-as in 0,3 micrometer met behulp van een fluorescentiemicroscoop (63x objectief) en de analyse van 3D-beeld stapels met behulp van de ImageJ software 14 uit te voeren.
Representative Results
TGCs kunnen worden geïdentificeerd op E7 gedeelten van DAPI kleuring door hun lokalisatie in de conceptie en hun grootte. Dit wordt geïllustreerd in figuur 1A een langsdoorsnede. RNA FISH werd uitgevoerd op een dergelijke embryonale secties om X-chromosoom inactivatie studeren in deze extra-embryonale afkomst.
Verschillende dia's of dekglaasjes kan worden verwerkt op hetzelfde moment. Door verschillende kleurstoffen RNA van verschillende genen label, kan men verschillende primaire transcripten in dezelfde kern. Ten minste 2 probes kunnen samen worden gemengd, bijvoorbeeld Xist SG (groen signaal) en ATRX gekoppeld SR (rood signaal) gekoppeld. Een voorbeeld van een vrouwelijke TGC wordt getoond in figuur 1B waarin 2 andere lijnen worden weergegeven, de embryo (E) en de viscerale endoderm (VE). Een TGC kern wordt getoond met Xist RNA die de X ChromOsome die geïnactiveerd (Xi), terwijl de andere X-chromosoom dat actief is (Xa) toont een paar lokaliseert. X-gebonden gen ATRX primaire transcripten zijn uitgedrukt uit de actieve X-chromosoom (niet ingericht door Xist) in meerdere exemplaren als gevolg van endoreplicatie. Dit illustreert monoallelische expressie bijvoorbeeld inactivering van ATRX op een X-chromosoom.
Aangezien TGCs zijn heterogeen in grootte als getoond in figuur 2B, worden alleen de grootste vierkanten opgenomen. Drie probes kunnen ook worden gebruikt zoals geïllustreerd in figuur 2C secundaire TGCs. In dit geval Xist -SG (groen), twee X-gebonden genen: G6PD -SR (rood) en HUWE1 -CY (magenta) werden geanalyseerd op hetzelfde tijdstip en dezelfde kern. Terwijl G6PD wordt monoallelically uitgedrukt zoals hier getoond (en eerder te zien in het voortgezet TGCs 3) HUWE1 wordt biallelically uitgedrukt bewijs van haar property te XCI ontsnappen. Endoreplicatie, met verschillende pinpoints dwz, ontluikende transcripten exemplaren, is ook duidelijk.
Figuur 1. Primaire transcript expressie in TGCs van E7 vrouwelijke embryonale sectie. (A) Longitudinale sectie van de E7 conceptie gekleurd met DAPI. Het embryo en de extra-embryonale weefsels worden omringd door de moeder weefsel, de decidua. De lokalisatie van de verschillende lijnen gebeurt bij DAPI kleuring met 5X doel. TGCs worden geïdentificeerd door hun grote omvang. Ch, chorion, E, embryo, EPC, ectoplacental kegel, VE, viscerale endoderm, TGC, trofoblast reus cellen. Schaal bar = 100 micrometer. (B) Hogere vergroting van de boxed-in gebied A (63x objectief) RNA FISH. ATRX primair transcript in rood en Xist RNA in het groen worden gevisualiseerd op de 3 lineages = E, VE, TGC. Scale bar = 10 micrometer. Voorbeeld van een in vivo TGC wanneer ATRX monoallelically uitgedrukt (Xa, pijlpunt) en zwijgt over de Xist beklede X-chromosoom (Xi); verschillende ATRX signalen te zien op de Xa zijn te wijten aan endoreplicatie. ATRX = BAC-kloon RP23-260I15. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Primaire transcript expressie in secundaire TGCs afgeleid van EPC. (A) De algemene opvatting van groeiende secundaire TGCs (x5 objectief). Schaal bar = 100 micrometer. (B) Asterisk geven voorbeeld van TGCs basis van hun grootte (10x objectief). Schaal bar = 60 micrometer. (C) Voorbeeld van een secundaire vrouwelijke TGC RNA FISH met gebruik van probes 3 (Xist domain in het groen, die de geïnactiveerde X-chromosoom: Xi) toont endoreplicatie van G6PD en HUWE1 primaire transcripten (meerdere lokaliseert, in rood en magenta). Terwijl G6PD monoallelically wordt uitgedrukt, HUWE1 expressie biallele in deze kern HUWE1 = BAC-kloon RP24-157H12;. G6PD = BAC-kloon RP23-13D21. Xi = pijl; Xa = pijlpunt (63x objectief). Schaal bar = 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Ontluikende RNA FISH staat voor een eenvoudige en gevoelige methode voor de single cell analyse van de transcriptie-activiteit in embryonale weefsels in verschillende ontwikkelingsstadia. De kracht van deze aanpak is de mogelijkheid om verschillende embryonale lijnen identificeren enig stadium volgens morfologische criteria. Maar dit vereist ook dat minimale achtergrondfluorescentie aanwezig is. Een dergelijke achtergrond maakt de identificatie van de verschillende regio's en embryonale celtypen uitdagend. Om een minimale achtergrond te garanderen, zijn er twee belangrijke stappen in dit protocol. De eerste is de kwaliteit van de cryosectie en de tweede is de efficiëntie (signaal-ruisverhouding) van de RNA FISH, die afhangt van het niveau van genexpressie en de kwaliteit van de probe. Voor laatstgenoemde probes zijn dus altijd getest op gekweekte cellen op dekglaasjes (embryonale stamcellen of somatische cellen) voor gebruik op trajecten.
In dit protocol, bieden we the technieken vereist om RNA FISH analyse uitvoeren op TGCs uit twee verschillende soorten monstervoorbereiding (cryostaat secties en primaire, embryonale explantaten). Dergelijke single cell analyse stelt dynamische veranderingen in genexpressie bij verschillende post-implantatie etappes worden beoordeeld.
De werkwijzen beschrijven we naar secundair TGCs genereren (bij E7-7.5 post-implantatie fase) werden in ons laboratorium aan de X-chromosoom inactivatie patronen van een extra-embryonale stam die wordt gevormd door TGCs op post-implantatie fase bestuderen. Extra-embryonale ontwikkeling bij knaagdieren afhankelijk van de differentiatie van TGCs. Inderdaad, TGCs essentieel voor placenta en dus embryonale ontwikkeling. Defecten in TGC differentiatie leiden tot embryonale sterfte (voor een overzicht zie referentie 15). Transcriptie-activiteit van TGCs gebruik van RNA FISH liet ons toe om een ongebruikelijke X-chromosoom inactivatie status van een dergelijk celtype tijdens de ontwikkeling van de muis 3 demonstreren.
in vivo TGCs en in vitro TGCs afgeleid van EPC explantaat. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot de analyse van transgene muizen en / of door toevoeging van remmer moleculen in het kweekmedium. We hebben met succes gebruik gemaakt van deze methode RNA FISH op een ander type TGCs, zoals primaire TGCs die in een eerder stadium van ontwikkeling van de muis, E3.0 blastocyts verschijnen die afzonderlijk gekweekt gedurende 4-5 dagen waarin uitgroei ontwikkeld, kan de ICM wordt omringd door grote primaire TGCs 16,17. Ontluikende transcripten voor verschillendegenen en Xist kon worden gevisualiseerd en gekwantificeerd met dezelfde RNA FISH benadering 3.
Gecombineerde immunofluorescentie en RNA FISH kunnen ook worden uitgevoerd op vriescoupes en in vitro gekweekt TGCs 3. Dit demonstreert dat de werkwijze is zeer robuust, primaire transcripten zijn zeer gevoelig voor afbraak en er is een absolute vereiste RNase vrije verbindingen. IF / RNA FISH biedt extra informatie over de transcriptie niveaus, cellulaire lokalisatie en eiwit expressie, tegelijkertijd in een bepaalde cel. Hoewel secties van in paraffine ingebed weefsel zijn eerder gebruikt om ontluikende RNA in humane tumoren te detecteren behoud weefselmorfologie 18, in onze handen, cryostaat secties zijn geschikt voor instandhouding van zowel het ontluikende RNA en de epitopen vereist voor detectie van antilichamen in immunofluorescentie .
Naast RNA FISH na immunofluorescence chromosomaal DNA FISH kunnen ook worden uitgevoerd op secundaire TGCs gebruik probes gelabeld met fluorochromen, vergelijkbaar met die voor RNA FISH 3. Fluorescerende probes kunnen ofwel plasmiden / fosmids of BAC, gelabeld met fluorescente dUTPs zoals hier gebruikt en in Chaumeil et al., 8 beschreven. Alternatief kan fluorescent gelabelde oligonucleotiden worden 19. Aangezien DNA-streng FISH-specificiteit vereist, kunnen oligonucleotideprobes ontworpen op een van de twee complementaire strengen richten in het doelgebied. Vertakt DNA probes, waarbij signaalamplificatie wordt bereikt door twee opeenvolgende ronden van specifieke probes en versterker kan ook worden gebruikt om de signaal-ruisverhouding FISH signalen 20 versterken. Als alternatief kunnen RNA-probes zoals riboprobes gebruikt worden, hoewel onze DNA-probes garandeert een betere afweging tussen signaalkwaliteit, specificiteit en gebruiksgemak.
Tot slot, 3D-beeld acquisition is essentieel om de vereiste ruimtelijke informatie in deze grote cellen te verkrijgen, en kan worden uitgevoerd met verschillende fluorescentie microscopen, zoals apotome microscoop of epifluorescentie microscopen met deconvolutie zoals DeltaVision (GEH) of andere microscopen geschikt voor beeldvorming weefselcoupes en grote (> 20 urn) TGCs. Opgemerkt wordt dat enkele kopie DNA loci, de gestippelde gedetecteerd door FISH ontluikende RNA of DNA FISH kunnen niet gemakkelijk worden gedetecteerd door confocale microscopie.
Tot slot zou de werkwijzen hier beschreven bruikbaar voor zowel de gedetailleerde analyse van TGS in een ontwikkelingscontext, maar ook in andere situaties ziekte. Vele genen die betrokken zijn bij TGC ontwikkeling en functie bij knaagdieren zijn geconserveerd tussen knaagdieren en mensen, zoals transcriptiefactoren, proteasen en celadhesiemoleculen 21. Mouse TGCs zijn een cel model voor het bestuderen van genen die de ontwikkeling van de placenta een regulerend inzichten in de menselijke placenta ziekten geven dus. Verder komt door het feit dat deze cellen endoreplicating en omdat sommige kankercellen aangrijpen endocycle's, naast genamplificatie werkwijzen omvatten de werkwijzen beschrijven we ook nuttige eencellige onderzoeken moeten mechanismen die leiden tot instabiliteit van kankercellen genome verkennen .
Acknowledgments
Wij danken Sophie gournet voor hulp met illustraties, Julie Chaumeil voor het lezen van het manuscript, de stalruimte faciliteit en de imaging platform van de Unit. Dit werk heeft steun ontvangen in het kader van het programma «Investissements d'Avenir» gelanceerd door de Franse regering en uitgevoerd door ANR met de verwijzingen ANR-10-LABX-0044 en ANR-10-IDEX-0001-02 PSL, de EpiGeneSys KP7 geen. 257.082 Network of Excellence tot EH, een ERC Advanced Investigator Award nee. 250.367 en EU FP7 SYBOSS verlenen geen. 242.129 tot EH De auteurs willen graag de Cell en Tissue Imaging Platform van de Genetica en Developmental Biology Department (UMR3215 / U934) van het Institut Curie, lid van France-Bio-imaging (ANR-10-InSb-04), erkent voor hulp met licht microscopie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ 1500 | |
| Stereomicroscope | Zeiss | Stemi SV6 | |
| Scissors Pascheff-Wolff | Moria | MC19 | |
| Dumont #5 forceps | Roth | PK78.1 | |
| 4-well tissue culture dishes | Nunc | 176740 | |
| 60 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353004 | |
| 100 mm Petri dishes Falcon | Dutsher, France | 353003 | |
| Coverslips 18 mm x 18 mm | VWR | 631-1331 | |
| Coverslips 22 mm x 22 mm | VWR | 631-0125 | |
| 12 mm glass round coverslips | Harvard apparatus | 64-0712 | |
| Slides Superfrost plus | VWR | 631-9483 | |
| 4-slide Transport box Lockmailer | Dutsher, France | 40684 | |
| Cryotubes 1.8 ml Corning | Fisher Science | 10418571 | |
| Glass Coplin staining jars | Fischer Scientific | W1561L | |
| TissueTek O.C.T compound | VWR | 4583 | |
| RPMI 1640 medium | Invitrogen | 61870 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | D1408 | 10x is used |
| Water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
| Paraformaldehyde | Panreac Quimica, Spain | 141451 | 3% in PBS |
| Triton-X-100 | Euromedex | 2000-A | 0.5% final |
| Vanadyl ribonucleoside complex (VRC) | New England Biolabs, USA | S1402S | |
| Sodium dextran sulfate | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | New England Biolabs, USA | B9001S | |
| Formamide | Sigma-Aldrich | 47671-1L-F | aliquots kept at -20 °C |
| Illustra TempliPhi Kit Construct (Kit MDA) | Dutsher, France | 25-6400-80 | |
| Nick translation kit | Abbott, USA | 07J00-001 | |
| 20x SSC buffer concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Spectrum green dUTP | Abbott, USA | 02N32-050 | |
| Spectrum red dUTP | Abbott, USA | 02N34-050 | |
| Cy-5 dUTP | Dutsher, France | PA55022 | |
| Mouse Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440016 | |
| DNA, MB grade | Invitrogen | Roche | DNA from fish sperm |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D9564 | DAPI |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| p-phenylenediamine | Sigma-Aldrich | 695106 | |
| Centrifuge 5417R | Eppendorf, Germany | molecular biology grade | |
| Eppendorf concentrator plus | Eppendorf | ||
| Eppendorf Thermomixer comfort | Eppendorf | ||
| Liquiport Liquid pump | KNF Neuberger, Trenton, USA | ||
| Shake'N'Bake Hybridization oven | Boekel Scientific, USA | ||
| Cryostat | Leica | CM3050 |
References
- Cross, J. C. Genetic insights into trophoblast differentiation and placental morphogenesis. Sem. Cell Dev. Biol. 11, 105-113 (2000).
- Zybina, E. V., Zybina, T. G. Polytene chromosomes in mammalian cells. Int. Rev. Cytol. 165, 53-119 (1996).
- Corbel, C., Diabangouaya, P., Gendrel, A. -V., Chow, J. C., Heard, E. Unusual chromatin status and organization of the inactive X chromosome in murine trophoblast giant cells. Development. 140, 861-887 (2013).
- Rossant, J., Tamura-Lis, W. Effect of culture conditions on diploid to giant-cell transformation in postimplantation mouse trophoblast. J. Embryol. Exp. Morphol. 62, 217-227 (1981).
- El-Hashash, A. H., Kimber, S. J. Trophoblast differentiation in vitro: establishment and characterization of a serum-free culture model for murine secondary trophoblast giant cells. Reproduction. 128, 53-71 (2004).
- Chow, J. C., Heard, E. X inactivation and the complexities of silencing a sex chromosome. Curr Opin Cell Biol. 3, 359-366 (2009).
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods Enzymol. 376, 405-419 (2004).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Okamoto, I., Otto, A. P., Allis, C. D., Reinberg, D., Heard, E. Epigenetic dynamics of imprinted XCI during early mouse development. Science. 303, 644-664 (2004).
- Okamoto, I., Arnaud, D., Le Baccon, P., Otte, A. P., Disteche, C. M., Avner, P., Heard, E. Evidence for de novo imprinted X-chromosome inactivation independent of meiotic inactivation in mice. Nature. 438, 369-373 (2005).
- Patrat, C., Okamoto, I., Diabangouaya, P., Vialon, V., Le Baccon, P., Chow, J., Heard, E. Dynamic changes in paternal X-chromosome activity during imprinted X-chromosome inactivation in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. 106, 5198-5203 (2009).
- Geijsen Shea, K., N, Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. J. Vis. Exp. (2), e160 (2007).
- Pollex, T., Piolot, T., Heard, E. Live-cell imaging combined with immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to study the nuclear dynamics and expression of the X-inactivation center. Methods Mol. Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9, 671-675 (2012).
- Hemberger, M. IFPA award in placentology lecture - characteristics and significance of trophoblast giant cells. Placenta. 29, Suppl A. 4-9 (2008).
- Carney, E. W., Prideaux, V., Lye, S. J., Rossant, J. Progressive expression of trophoblast-specific genes during formation of mouse trophoblast giant cells in vitro. Mol. Reprod. Dev. 34, 357-368 (1993).
- Shin, J., et al. Maternal Rnf12/RLIM is required for imprinted X-chromosome inactivation in mice. Nature. 467, 977-981 (2010).
- Capodieci, P., Donovan, M., Buchinsky, H., Jeffers, Y., Cordon-Cardo, C., Gerald, W., Edelson, J., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Gene expression profiling in single cells within tissue. Nat Methods. 9, 663-665 (2005).
- Beliveau, B. J., Joyce, E. F., Apostolopoulos, N., Yilmaz, F., Fonseka, C. Y., McCole, R. B., Chang, Y., Li, J. B., Senaratne, T. N., Williams, B. R., et al. Versatile design and synthesis platform for visualizing genomes with Oligopaint FISH probes. Proc. Natl. Acad. Sci. 109, 21301-21306 (2012).
- Kenny, D., Shen, L., Kolberg, J. A. Detection of viral infection and gene expression in clinical tissue specimens using branched DNA (bDNA) in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 50, 1219-1227 (2002).
- Cross, J. C., Baczyk, D., Hemberger, M., Hugues, M., Simmons, D. G., Yamamoto, H., Kingdom, J. C. Genes, development and evolution of the placenta. Placenta. 24, 123-130 (2003).
