Summary
Ikke-omrørt bundfældning polymerisation tilvejebringer en hurtig, reproducerbar prototyping tilgang til syntesen af stimuli-følsomme poly (N -isopropylacrylamide) mikrogeler af snæver størrelsesfordeling. I denne protokol syntese, er lysspredning karakterisering og enkelt partikel fluorescens sporing af disse mikrogeler i en bred felt mikroskopi setup demonstreret.
Abstract
Stimuli-følsomme poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrogeler har forskellige potentielle praktiske anvendelser og anvendelser i grundforskning. I dette arbejde, bruger vi enkelt partikel sporing af fluorescens-mærkede PNIPAM mikrogeler som et udstillingsvindue for tuning mikrogel størrelse ved en hurtig ikke-rørt nedbør polymerisering procedure. Denne fremgangsmåde er velegnet til prototyper af nye reaktions- kompositioner og vilkår eller til applikationer, der ikke kræver store mængder produkt. Mikrogel syntese, partikelstørrelse og struktur bestemmelse ved dynamisk og statisk lysspredning er beskrevet i protokollen. Det er vist, at tilsætningen af funktionelle comonomerer kan have en stor indflydelse på partiklen nukleering og struktur. Enkelt partikel sporing af wide-field fluorescensmikroskopi giver mulighed for en undersøgelse af udbredelsen af mærkede tracer mikrogeler i en koncentreret matrix af ikke-mærkede mikrogeler, et system, der ikke let undersøgt afandre metoder såsom dynamisk lysspredning.
Introduction
Stimuli-følsomme poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) mikrogeler 1,2 har tiltrukket kontinuerlig interesse i de seneste to årtier på grund af deres potentiale i forskellige smarte applikationer. Steder har udvist anvendelse indbefatter omskiftelige emulsionsstabilisatorer 3-8, mikrolinser 9 cellekultur substrater for nem cellehøst 10,11 og smart bærere til forbindelser med lav molekylvægt og andre biomedicinske anvendelser 12. Fra et grundforskning synspunkt disse partikler har vist sig at være nyttig for at undersøge emner som kolloide interaktioner 13-15 og polymer-solvent interaktioner 16-18.
Vellykket anvendelse af PNIPAM mikrogeler og deres derivater i en given applikation kræver typisk viden om den gennemsnitlige partikelstørrelse og bredden af partikelstørrelsesfordelingen. For den korrekte fortolkning af de eksperimentelle resultater involverer PNIPAM microgeler, partiklen struktur, som kan påvirkes af funktionelle comonomerer, skal være kendt. Dynamisk og statisk lysspredning (DLS og SLS, henholdsvis) er unikt egnet til at erhverve disse oplysninger, fordi disse metoder er hurtige og relativt let at bruge; og de sonde egenskaberne partikel ikke-invasivt i deres native miljø (dispersion). DLS og SLS indsamler også data fra store antal partikler undgå bias som følge af små stikprøvestørrelser, typiske til mikroskopi metoder. Derfor er det første formål med dette arbejde er at indføre god praksis for lysspredning for praktikere nye til kolloid karakterisering.
Typisk udfældning udføres polymerisationen i laboratorieskala og finde de rigtige reaktionsbetingelser for særlige partikelegenskaber kan være besværlig og kræver mange gentagelser af syntesen. I modsætning til store batch syntese, ikke-omrørt bundfældning polymerisation 19,20 er arAPID procedure, hvor partier af forskellig reaktant præparat kan polymeriseres samtidigt ydende partikler af snæver størrelsesfordeling. Samtidig polymerisering minimerer eksperimentel variation og store output betyder, at rette reaktionsbetingelser kan findes hurtigt for opskalering reaktionen. Derfor vores andet mål er at demonstrere anvendeligheden af ikke-omrørt bundfældning polymerisation i prototyper og i applikationer, der ikke kræver en stor mængde af produktet.
Forskellige aspekter af syntese og karakterisering mødes i eksempel på anvendelse af fluorescerende mærkede PNIPAM mikrogeler i kolloid interaktion forskning. Her bruger vi meget præcis enkelt partikel sporing til at undersøge udbredelsen af mærkede tracer mikrogeler i spredning af umærkede matrix mikrogeler over et bredt matrix koncentrationsområde og løse buret effekt i koncentreret kolloid dispersion. Wide-field fluorescensmikroskopi er velegnet for dette formål, da det kan karakterisere bestemt adfærd af nogle få tracer molekyler blandt et stort antal potentielt forskellige matrix arter. Dette er i modsætning til teknikker, såsom DLS, SLS og rheologi, der måler ensemblet gennemsnitlige egenskaber af systemer og kan derfor ikke løse adfærd lille antal probe-partikler i et stort system. Endvidere i dette specifikke eksempel konventionelle lysspredningsegenskaber metoder ikke kan også udnyttes på grund af høj partikelkoncentration, der fører til et stærkt multipel spredning ugyldiggør enhver standard analyse. Anvendelse af automatiserede databehandling og statistiske metoder gør det muligt analyse af det samlede system adfærd også for enkelt partikel sporing, når gennemsnit over store stikprøvestørrelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mikrogel Synthesis
BEMÆRK: N -isopropylacrylamide (NIPAM) blev omkrystalliseret fra n-hexan. Andre reagenser blev anvendt som modtaget.
- Konventionel Batch Syntese af poly (NIPAM) matrix Mikrogeler
- Opløs 1,8 g NIPAM og 24 mg N, N '-bisacrylamide (BIS) i 245 ml filtreret (0,2 um regenereret cellulose (RC) membranfilter) dobbelt destilleret vand i en 500 ml trehalset rundbundet kolbe udstyret med en tilbagesvaler, en omrører og en gummiskillevæg.
- Indsæt et termometer og en 120 mm nål til kvælstoftilførslen gennem skillevæggen.
- Opvarm opløsningen til 60 ° C under omrøring. Deoxygenere opløsningen ved skylning med nitrogen i 40 min.
- Samtidig forberede en initiator opløsning af 155 mg kaliumpersulfat (KPS) i 5 ml filtreret dobbeltdestilleret vand og bobler opløsningen med nitrogen for at fjerne oxygen.
- Overfør de fuldstændige 5 ml KPS solution i en nitrogen-vasket sprøjte udstyret med en 120 mm nål.
- Løft nitrogen nålen over væskeniveauet i tre-halset kolbe og tilsæt KPS opløsningen hurtigt gennem gummimembranen i reaktoren.
- Lad polymerisationen forløbe i 1 time under nitrogen flow og langsom omrøring ved 60 ° C.
- Brug en Buchner-tragt og filterpapir for at filtrere den varme reaktionsopløsning for at kassere store aggregater. Lad dispersionen afkøle.
- Centrifuger og redispergere dispersionen tre gange i 40 minutter ved 257.000 xg og endelig redispergere sedimentet i en minimal levedygtig mængde dobbeltdestilleret vand. Dette er typisk 2-4 ml.
- Lyofilisere dispersionen til opbevaring.
- Ikke-omrørt Syntese af fluorescensmærkede Poly (NIPAM) Mikrogeler
- Afvejes 257,7 mg NIPAM, 3,5 mg BIS, og 1,5 mg methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamin B (farvestof) i glasbeholder og tilsæt 10 ml filtreret dobbelt Distilled vand.
- Ultralydsbehandles farvestof-monomeropløsningen i 15 minutter for at opløse farvestoffet i vand.
- Forbered den samme opløsning uden farvestoffet i en separat glasbeholder.
- Fremstilling af forskellige fortyndinger af monomeropløsningen med farvestoffet ved hjælp monomeropløsningen uden farvestoffet at opnå en koncentration serie med forskellige farvestofkoncentrationer. I dette arbejde, bruger farvestof i koncentrationsområdet 0,02-0,1 mmol / l.
- Opløs 8,4 mg KPS i 10 ml filtreret dobbelt destilleret vand for at få initiatoren opløsning.
- Overfør 0,5 ml af koncentrationen serien og 0,5 ml KPS opløsningen til reagensglas med diameter på 10 mm til opnåelse af de endelige reaktionsopløsninger og forsegle dem med gummisepta.
- Forvarm et oliebad i en dobbeltvægget glasbeholder forbundet til en opvarmning cirkulationspumpen til 63 ° C.
- Deoxygenize reaktionsopløsningerne ved skylning med nitrogen gennem 120 mm nåle i 20 min.
- Sæt rørene i AFloating platform og fordybe platformen i den forvarmede oliebad. Indstil temperaturen til 60 ° C. I første omgang højere temperatur i badet er nødvendig, da rumtemperaturen løsninger afkøle badet. For høj præcision partikelstørrelse tuning temperaturstyringen under den indledende reaktion skal være strenge, typisk ± 0,1 ° C.
- Lad reaktionen fortsætte i en passende tid. Typisk 1 time er nok.
- Overfør reaktionsrørene hurtigt til en ovn ved 60 ° C og sætte en dråbe af den varme dispersion til 10 ml filtreret dobbelt destilleret vand forvarmet løbet PNIPAM volumen faseovergangstemperatur (VPTT, 32 -34 ° C) 1, for DLS karakterisering i sammenklappet tilstand.
- Lad resten af dispersionerne afkøles til stuetemperatur og overføre dem til centrifugerør.
- Centrifugeres opløsningen tre gange i 40 minutter ved 257.000 xg og fortynd mikrogelerne endelig i 2 ml filtreret dobbelt destilleret vand for anvendelse som sporstof partikler.
2. lysspredning karakterisering
- Hydrodynamiske radius Bestemmelse i sammenklappet tilstand af dynamisk lysspredning
- Vask kuvetter og glasvarer med acetone damp.
- Heat 10 ml filtreret (fx 200 nm eller mindre RC filter) dobbelt destilleret vand over PNIPAM VPTT.
- Overfør en dråbe af varme dispersion til den filtrerede vand med en forvarmet nål (0,9 x 40 mm) og sprøjte (1 ml).
- Temperere DLS goniometer indeks match bad til 50 ° C og overføre prøven til instrumentet uden at lade det køle ned.
- Find den største spredningsvinkel hvor den spredte intensitet er tilstrækkelig til at erhverve en correlogram ved at udføre testmålinger.
- Indsæt analysekuvette (10 mm glas rørdiameter med 1 ml partikel dispersion). Flyt detektoren arm til små spredningsvinkel (her 30 °).
- Tjek strålen profil for multipel spredning: ingen glød omkring den primære stråle, ingen multipel spredning osv Kontroller, at optællingen serien er velegnet til at måle ved den laveste spredningsvinklen (ca. mellem 30 og 600 kHz øverste højre hjørne af softwaren vinduet..)
- Flyt goniometer arm til højeste spredningsvinklen (vælg 120 ° her). Kontroller, at optællingen er stadig høj nok til målingen (mellem 30 og 600 kHz). Hvis intensiteten er for lav, flytte armen til lavere spredningsvinkel.
- Check strålen visuelt gennem toluen bad glas ved den laveste spredningsvinklen, hvis glød omkring den indfaldende stråle observeres multipel spredning finder sted. I dette tilfælde reducerer laser intensitet eller bruge en højere fortynding.
- Anskaf 20 correlograms mellem minimum og maksimum spredningsvinkel (f.eks 30 ° - 140 °) med minimum erhvervelse tid på 60 sek. Øg købet tid til svag intensitet store spredningsvinklerHvis det er nødvendigt.
- Dataanalyse 37
- Beregn spredning vektor størrelser for spredningsvinklen ifølge
, Hvor n er brydningsindekset af dispersionen, 
bølgelængde af laseren i vakuum og 
spredningsvinklen. - I tilfældet målingen software giver intensiteten korrelationsfunktionen
, Omdanne den til elektrisk felt korrelationsfunktion 
ifølge 
. Parameter 
er et uinteressant instrumental parameter relateret til graden af rumlige kohærens af det spredte lys over detektoren område. - Udfør cumulant analyse på correlograms, dvs passer andenordens polynomium med logaritmen af hver elektrisk felt korrelationsfunktion
ved lineær mindste kvadrater. vises som skæringspunktet for den pasform og dens nøjagtige værdi er uden betydning i forhold til dataanalyse. Begrænse pasformen til en meningsfuld tidsforsinkelse τ værdi, f.eks således at korrelationen amplitude er 10 - 20% af den maksimale amplitude. Koefficienten af første rang sigt er middelværdien henfald sats korrelationsfunktionen, 
. - Finde de mest sandsynlige værdi for middelværdien diffusionskoefficient
af partiklerne ved lineær mindste kvadraters tilpasning på 
. Hvis mod 
synes ikke lineær og gå gennem oprindelsen inden fejlen, partikelstørrelsesfordelingen er bred og hydrodynamiske radius vil blive dårligt defineret. - Beregn den gennemsnitlige hydrodynamiske radius fra Stokes-Einstein forhold
, hvor 
er Boltzmanns koefficient, 
den absolutte temperatur og 
viskositeten af dispersionen på . Udbrede standardafvigelsen for til 
. - Partikel Struktur Bestemmelse af statisk lysspredning
- Vask kuvetter og glasvarer med acetone damp. Brug 20 mm diameter eller større kuvetter for at minimere den cylindriske linse virkning.
- Filter (200 nm RC filter eller mindre) ca. 20 ml dobbeltdestilleret vand til en glasbeholder og overføre en dråbe oprenset dispersion til hætteglasset. Vask filteret med 10 ml vand før du bruger det for prøveforberedelse for at fjerne urenheder tilbage fra fremstillingsprocessen.
- Tjek prøve mod enhver omgivende lyskilde. Hvis der observeres blå nuance, prøven kan forventes at blive alt for koncentreret. Fortynd derefter.
- Forbered prøve baggrund vand ved skylning kuvetten flere gange med filtreret vand og derefter fylde op til passende prøvevolumen, afhængigt af kuvetten og laseren position i instrumentet. Laseren skal passere gennem prøven uden at blive brudt fra menisken.
- Kalibrer instrument under anvendelse af en toluen prøve.
- Mål vand spredning (baggrund) i hele det tilgængelige vinkelinterval.
- Mål spredningsintensiteten fra prøven i hele det tilgængelige vinkelområde fortrinsvis ved flere bølgelængder. Spredningsmønstret normaliseret til den forreste spredningsintensitet er kendt som formfaktor.
- Hvis partikel struktur er kendt Brug den relevante model udtryk til at beregne den globale pasform på datasæt målt på forskellige bølgelængder.
- For ukendt partikelstruktur brug legaliseret direkte (såsom FitIt! 33) eller en mere generel indirekte invers Fouriertransformation 21,22 rutine i forbindelse med udfoldning af parret afstand fordelingsfunktion (kun for sfæriske partikler) 23,24 til omtrentlig klassifikation af partikel type.
- I tilfælde af montering eller inversion rutine tilvejebringer et estimat af partiklen radius fordelingsfunktion, beregne polydispersitetindeks (standardafvigelse af fordelingen divideret med dets middelværdi).
3. Particle Tracking af Wide-field Fluorescence Microscopy
BEMÆRK: Tracer og matrix partikler af 465 ± 7 nm og 405 ± 7 nm hydrodynamiske radier ved 20 ° C, henholdsvis blev anvendt til partikel sporing.
- Prøvefremstilling
- Forbered koncentreret matrix mikrogel dispersion ved gendispergering kendt mængde lyofiliseret umærket mikrogel til kendt mængde dobbeltdestilleret vand. Tilføj et lille volumen af mærkede sporstof partikler.
- Bekræfte passende Røbestofkoncentrationen mikrogel i mikroskopet. Den optimale koncentration er et kompromis mellem samtidige opkøb af maksimale antal spor, og samtidig have koncentrationen sporstof så lav, at sandsynligheden for, at tracer partikel spor krydser under købet er ubetydelig.
- Fremstilling af koncentrerede dispersioner ved afdampningvand i en ovn. Bestem vægtkoncentration ved at sammenligne vægten af dispersionen til den oprindelige vægt af prøven før fordampning.
- Dataopsamling og analyse
- Brug en passende objektiv linse af den ønskede forstørrelse og blænde for excitation af sporstoffer og samtidig fluorescens kollektion fra prøven. I dette arbejde, at bruge en 100X / 1,3 NA nedsænkning olie objektiv.
- Placer fugt kammer på et xyz-piezo bord, som passer ind i en kommerciel mikroskop.
- At forhindre prøven fra tørring, placere et plasma renset dækglas ind i fugt kammer og pipetten 10 pi af poly (NIPAM) dispersion af den ønskede koncentration på slip.
- Afhængigt af excitations- og emissionsspektre af det fluorescerende farvestof, bruges et laser til excitation og justere lasereffekten korrekt. Intensiteten skal være tilstrækkelig lav til at undgå hurtig fotoblegning af farvestofferne, men påSamtidig stærk nok til nøjagtig positionering enkelt partikel (se nedenfor). I dette arbejde, at bruge en 561 nm diode-pumpet solid-state laser og holde laser power konstant på 16 mW (ca. 0,5 kW cm -2 ved prøven) for alle målingerne.
- For at opnå homogen belysning prøve, bruge den kritiske belysning setup beskrevet her. Til dette par laseren ind i en multimode fiber (NA 0,22 ± 0,02, 0,6 mm kerne diameter), ryste fiberen ved hjælp af en vortexer for at tidsmæssigt gennemsnit ud laser prikker, og projektet fiberen ender ind i prøven flyet.
- Kalibrere z afstand fra bagsiden refleksion af dækglasset og fokusere flere mikrometer ind i prøven ved at flytte målet lidt op og løse z-positionen under anvendelse af en z-kompensator. Derved undgås eventuelle interface-effekter med dækglasset.
- Juster detektoren parametre, såsom eksponeringstid, at styrken af fluorescenssignalet. I dette tilfælde skal du bruge en EMCCD kameramed eksponeringstid på 0,1 sek, elektron multiplicere mode og gevinst på 50.
- Erhverve flere film med et passende antal rammer at opnå tilstrækkelig tidsforsinkelse at beregne middelværdien på forskydningen af mikrogelerne i forskellige regioner i prøven. I dette arbejde, bruge erhvervelse frame antal 500 eller 1.000 frames.
- Analyser af data ved at placere partiklerne i hver ramme ved hjælp af Gauss fitting 25 og bruge en passende partikel sporing algoritme 26 for at få den gennemsnitlige på forskydningen. 27 Beregn betyde værdier og standardafvigelse ved at midle over alle spor i alle de film. Beregn den lange forsinkelse tid diffusionskoefficienter ved lineær regression fra
, hvor 
er middelværdien på forskydningen, D middelværdien diffusionskoefficient og τ latenstiden. - EstiMate anomalien parameter γ fra den anomale diffusionsligningen
ved at omdanne dataene til logaritmisk skala, hvilket gav 
. Den anomali parameter 
er givet ved derivatet af plottet. Den derivat kan estimeres ved finite forskelle i datapunkterne, eller montering af datapunkter med polynomiel funktioner og differentiere analytisk. Bestem tilstrækkelig grad af de polynomium funktioner ved at plotte fit residualer og residual norm for stigende polynomium orden. - Gentag den samme procedure for forskellige koncentrationer af mikrogel matricer.
- Beregn spredning vektor størrelser for spredningsvinklen ifølge
, Hvor n er brydningsindekset af dispersionen, 
bølgelængde af laseren i vakuum og 
spredningsvinklen. 
, Omdanne den til elektrisk felt korrelationsfunktion 
ifølge 
. Parameter 
er et uinteressant instrumental parameter relateret til graden af rumlige kohærens af det spredte lys over detektoren område. 
ved lineær mindste kvadrater. 
. 
af partiklerne ved lineær mindste kvadraters tilpasning på 
. Hvis
synes ikke lineær og gå gennem oprindelsen inden fejlen, partikelstørrelsesfordelingen er bred og hydrodynamiske radius vil blive dårligt defineret. 
, hvor 
er Boltzmanns koefficient, 
den absolutte temperatur og 
viskositeten af dispersionen på 
. 
, hvor 
er middelværdien på forskydningen, D middelværdien diffusionskoefficient og τ latenstiden. 
ved at omdanne dataene til logaritmisk skala, hvilket gav 
. Den anomali parameter 
er givet ved derivatet af plottet. Den derivat kan estimeres ved finite forskelle i datapunkterne, eller montering af datapunkter med polynomiel funktioner og differentiere analytisk. Bestem tilstrækkelig grad af de polynomium funktioner ved at plotte fit residualer og residual norm for stigende polynomium orden. Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Antallet af PNIPAM mikrogel partikler i batchen, og dermed den endelige partikel volumen, bestemmes tidligt i reaktionen under nukleering fase 20 Hydrofobisk comonomer farvestof methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamin B påvirker nukleering ved at reducere partikelantal densitet i batchen. Faldet i partikelkoncentrationen i to forskellige initiale koncentrationer NIPAM kan ses som stigning i den gennemsnitlige endelige partikel volumen i sammenklappet tilstand med stigende farvestofkoncentration, vist i figur 1. Stigningen i volumen kan tilskrives den hydrofobe comonomer farvestof, som fremmer mikrogel kerner aggregering på tidlige reaktionstider, reducere koncentrationen partikel og øge den endelige partikel volumen.
Resultater fra et vellykket DLS measurements er vist i figur 2. For seks mindste slutvolumen partikel batches lineær afhængighed af den gennemsnitlige henfaldskonstanten Γ 2 på Q2 og nul y-intercept inden fejlen viser, at partikelstørrelsesfordelinger for disse partier er relativt smalle og en brønd kan fås -defined estimat for middelværdien diffusionskoefficient fra hældningen af den lineære tilpasning. Figur 3 viser et mere kompliceret resultat fra de to største volumen batches, hvor Γ 2 afviger fra den lineære opførsel i det mellemliggende q interval. Den ikke-linearitet stammer fra formfaktor (kantet spredning mønster) minimum, som falder sammen med disse q-værdier. 28 kan observeres pågældende fænomen for partikler med dimensioner svarende til bølgelængden af den indfaldende laserstråling og endda en moderat partikelstørrelsesfordeling bredde. Bestemmelse af diffusionskoefficient i denne q figur 3, Γ 2 afspejler den gennemsnitlige adfærd igen ved høj q, hvor alle partikelstørrelsesfraktioner bidrage mere jævnt til det samlede spredte intensitet. En enkel måde at opnå et rimeligt estimat for den gennemsnitlige diffusionskoefficienten er at udelukke de mellemliggende Γ 2 værdier fra den lineære pasform. Hvis formfaktoren af partiklerne er kendt, kan en mere omfattende montering fremgangsmåden anvendes 28.
Bestemmelse af hydrodynamiske volumen i sammenklappet tilstand uden at lade prøverne køle ned under PNIPAM VPTT sikrer, at den ikke-gelerede sol fraktion ikke har løsrevet fra partiklerne. Derfor mængden i den sammenklappede tilstand afspejler masse og antallet af partiklerne under polymerisationen, hvilket er vigtigt, hvis FundamEntal egenskaber af nedbør polymerisation bliver undersøgt 20. Volumen i den sammenklappede tilstand giver også en god mængde for at sammenligne forskellige reaktionsparametre, fordi den er uafhængig af de kvældningsegenskaber og den del af ikke-geleret polymer i partiklerne reguleres af mængden af tværbinder i monomerblandingen. Mindre størrelse og højere spredning kontrast i sammenklappet tilstand også lette DLS karakterisering.
Statisk lysspredning data målt ved to bølgelængder på 642 nm og 404 nm for matrixen og tracer partikler er vist i figur 4 Visuel inspektion af kantede scattering mønstre afslører, at partiklerne er veldefineret:. Flere fremtrædende svingninger typiske for sfæriske partikler i hele q indikerer smalle polydispersitet, i dette tilfælde 7% og 6% for tracer og matrix mikrogeler henholdsvis. glat behavior ved lav q indikerer, at prøverne er tilstrækkeligt fortyndet, og ingen signifikant partikelaggregering er til stede. Stigningen i spredte intensitet ved ekstrem q kan tilskrives spredning i henhold til back reflekterede stråle fra den indre kuvetten væg. Inversion af formfaktorer af matrix-partikler bekræfter typiske mikrogel struktur 29 med tæt kerne og radialt rådnende tæthed profil som følge af cross-linker copolymerisationsprodukter kinetik 30 (se indsat). Den stiplede linje viser formfaktor af henvisningen hårde kugle med samme middelværdi inertiradius som matrix-partikler. Den eksperimentelle formfaktor henfalder hurtigere med q end den hårde sfære form faktor, hvilket er typisk for partikler med fuzzy overflade. I modsætning hertil sporstof partikler udviser ukonventionelle mikrogel struktur. Dette kan også ses af henvisningen hårde sfære form faktor, som viser, at den eksperimentelle formfaktor oprindeligt ikkehenfalde hurtigere end referencen. Dette resultat viser, at de inkorporerer farvestof molekyler til mikrogeler kan påvirke deres struktur, der skal tages hensyn til i fortolkning af resultaterne.
Den høje ensartethed af de syntetiserede partikler er af stor interesse for studier af deres diffusion ved volumenfraktioner omkring glasovergangstemperaturen for nøjagtigt bestemme udviklingen adfærd i dette regime 13, og sammenligne det med hårde partikler 31. Derfor blev en lille brøkdel af mærkede mikrogeler blandet med ikke-mærket mikrogel af sammenlignelig størrelse. Excitations- og emissionsspektre af mikrogel-inkorporeret farvestofmolekyler sammen med excitationsbølgelængde og filter konfiguration, der anvendes i emissionen sti er vist i figur 5. Absorbans og emission maxima af methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamin B er tæt på excitationsbølgelængde og fluorescens samling rækkevidde,henholdsvis muliggør høje indsamlings- effektivitet i partikel sporing setup. Tidsudvikling middelkvadratet på forskydningen for tracer mikrogeler i forskellige ikke-mærkede mikrogel matrix koncentrationer er vist i figur 6 og figur 7 i lineær og logaritmisk skala, hhv. Ved lave mikrogel matrix koncentrationer diffus sporstof partikler hurtigt. Selv om de kun er synlige for et begrænset antal rammer før flytning ud af fokusplanet, et rimeligt god vurdering af deres spændingsværdi forskydninger er mulig. Den lineære stigning i den gennemsnitlige på forskydningen med tid indikerer normal diffusion adfærd for alle forsinkelse tider er målt. Men for mikrogel koncentrationer tæt på den kolloide glasovergangstemperaturen, dvs. 29-36 mg / ml, er den tidsmæssige udvikling i de gennemsnitlige kvadratiske forskydninger bliver ikke-lineær (se figur 7). Adfærden ligner en af kolloide mikrometer størrelse PMMA partikler som described af Weeks og Weitz 31 og kan relateres til buret virkning. Som vist skematisk i figur 10, kan et mærket mikrogel i en tæt matrix diffunderer snarere frit inden i buret. Af denne grund, middelkvadratet på forskydningen stiger lineært i de første få millisekunder. Men da partikler indfanges i transiente bure dannet af deres naboer, en kollektiv omlejring af de omgivende mikrogeler er nødvendig for mikrogeler at bevæge sig yderligere. Dette bur virkning udtrykker sig i en temmelig overfladisk hældning i anden række i figur 7, og kan også bekræftes ved at inspicere sporene partikel i figur 9. Ved korte ventetider partiklerne vipper i deres bure, hvorfra de undslipper lige at få fanget igen. Ved lange forsinkelser, er den lineære diffusion adfærd genvundet. Cage effekter kan analyseres ved hjælp af afvigende diffusionsmodeller hvor den tidsmæssige udvikling i (todimensionalt opdaget) betyder firkantet displacement udtrykkes af en strøm ret til tiden: 
eller i logaritmisk form 
med anomali parameter 
32. Ved normal diffusion, den anomali parameter er lig med 1, subdiffusion er repræsenteret ved værdier under 1. Figur 8 viser den tidsmæssige udvikling i anomali parameter direkte bestemt ud fra hældningen i log-log-plot Figur 7. For de lavere koncentrationer af mikrogeler i vores undersøgelse, at anomali parameter dybest set svarer til 1. for forsinkelse gange 
i området fra flere sekunder, faktoren afviger fra 1 mod lavere værdier. Denne adfærd er et artefakt skyldes, at den aksiale (Z) observation område i bred-field mikroskopi er begrænset til kun et par mikrometer. Den smalle z-rækkevidde forspænder analyse for hurtig diffusion med lange tidsintervaller for hurtigt spredende sporstoffer ved lave koncentrationer matrix. Når øge mikrogel koncentration, finder vi, at den mindste af anomali parameter bliver meget mere udtalt og overgangen til normal diffusion ( 
) Vises senere. Dette er en klar indikation af buret effekt vises for tætte mikrogeler systemer, når nærmer deres glas overgang regime.
Figur 1:. Enkelt partikel volumen i kollapsede tilstand med koncentration indledende farvestof i partiet to forskellige initiale koncentrationer NIPAM blev brugt, 57,5 mmol dm -3 (sorte cirkler) og 28,8 mmol dm -3 (grå rektangler). 1 mol-% af krydsbinder blev anvendt. Indledende KPS koncentrationen var den samme i alle batches på 1,56 mmol dm -3. Fejl barer betegne standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Decay sats med kvadratet på spredning vektor størrelsesorden for de fire mindste volumen mikrogel partier Lineær afhængighed af. 
på Q2 og gennem nulpunktet indikerer snæver partikelstørrelsesfordeling og indikerer, at veldefinerede estimat af middelværdien diffusionskoefficienten kan beregnes ud fra hældningen af den lineære tilpasning. NIPAM koncentrationerne var 57,5 mmol dm -3 (røde kvadrater og appelsin omvendte trekanter) og 28,8 mmol dm -3 (resten af symbolerne). Farvestofkoncentrationer var 0,044 mmol dm -3 (røde firkanter), 0,022 mmol dm -3 (orange omvendte trekanter), 0,088 mmol dm -3 (grønne trekanter), 0,066 mmol dm -3 (cyan romber), 0,044 mmol dm -3 (mørke blå trekanter), og 0,022 mmol dm -3 (lyserøde cirkler). klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3:. Henfaldshastighed med kvadratet på spredning vektor størrelsesorden for de to største volumen batches Ikke-lineær opførsel af Γ 2 med q 2 i den centrale q interval er forårsaget af ændringerne i intensiteten vægtning af signal ved forskellige størrelsesfraktioner i nærheden af den mindste formfaktor. NIPAM koncentration i begge partier var 57,5 mmol dm-3, Farvestoffet koncentrationerne 0,088 mmol dm -3 (sorte cirkler) og 0,066 mmol dm -3 (røde trekanter). Falmede symboler blev udelukket fra det lineære fit. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Form faktorer af det mærkede sporstof og umærkede matrix partikler For både partikler formfaktor blev målt ved to bølgelængder, 642 nm (lyse blå og røde datapunkter) og 404 nm (grøn og mørkeblå datapunkter).. Solid linjer er globale passer til 642 nm og 404 nm datasæt. Stiplede linjer viser formfaktorer af hårde sfære reference- partikler med samme gyrationsradius som matrix og sporstof partikler (orange og grøn stiplede linjer, henholdsvis.) Inlays viser normaliseret partikeldensity profiler fra kernen til overfladen beregnet, f.eks FitIt! Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5:. Excitation og emissionsspektre af fluorescensmærkede mikrogel partikler Blå linie betegner excitation og røde linje emissionsspektret. Solid lodrette linje er excitationsbølgelængden. Skraverede område angiver fluorescens samling bølgelængdeområde. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Mean firkantet displacement med tidsforsinkelse for sporstof partikler. Unlabeled matrix mikrogel koncentrationerne var 15,56 mg / ml (venstre), 22.05 mg / ml, 28.28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30.32 mg / ml, 31,13 mg / ml og 35,35 mg / ml. Points og fejllinjer betegne eksperimentelle værdier og standardafvigelse, hhv. Solid linjer er lineære passer til datapunkterne. Indsat viser et bredt felt fluorescens mikrograf af tracer mikrogeler på 35,35 mg / ml matrix koncentration. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7:. Mean på forskydningen med tidsforsinkelse for sporstof partikler i logaritmisk skala Unlabeled matrix mikrogel koncentrationer 15,56 mg / ml (venstre), 22.05 mg / ml, 28.28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31.13 mg / ml og 35,3 5 mg / ml. Points og fejllinjer betegne eksperimentelle værdier og standardafvigelse, hhv. Solid linjer er polynomiel passer til datapunkter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8:. Anomaly parametre med latenstid for sporstof partikler Unlabeled matrix mikrogel koncentrationer 15.56 mg / ml (venstre), 22.05 mg / ml, 28.28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml og 35,35 mg / ml. Points repræsenterer derivater anslået af finite forskelle og solide linjer analytisk beregnede derivater fra polynomiel passer i figur 7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9:.. Partikel spor for 12 tracer mikrogeler i dispersion med 35,35 mg / ml matrix koncentration Gruppering af spor til markante klatter resultater fra sporstof er partikler fanget i forbigående bure dannet af deres umærkede naboer Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 10:. Skematisk illustration af sporstof mikrogel diffusion i koncentreret umærket matrix mikrogel dispersion Red bane betegner hurtig diffusion af sporstoffer inden for de transiente bure (blå stiplet linie) er dannet af de tilstødende partikler. Blå bane betegner lang forsinkelse timig diffusion aktiveret af den kollektive omlægning af de forbigående bure. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11:. Lange forsinkelse tid diffusionskoefficienter med umærket matrix mikrogel koncentration Ved koncentration lav matrix diffusion af tracer mikrogeler er ikke påvirket af matrix-partikler. Med stigende matrix mikrogel koncentrationen lang tid diffusion sinker størrelsesordener fordi diffusion kræver kollektiv omlægning af de forbigående bure, hvor sporstoffer er fanget. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tilsætning af små mængder af funktionel comonomer kan have en betydelig effekt på partikelstørrelse og struktur PNIPAM afledte mikrogeler. Samtidig lille skala reagensglas polymerisation er en god metode til at tage højde for sådanne ændringer, og hjælper til hurtigt at finde de rigtige reaktant sammensætninger til target partikelstørrelse for opskalering af reaktionen efter behov. Massen af partiklerne er ca. eksponentielt afhængig af polymerisationstemperaturen når termisk nedbrydning initiator, såsom KPS, anvendes 20, og derfor er det nødvendigt at etablere en stabil og nøjagtig temperaturstyring inde i reaktoren for god reproducerbarhed. partikel volumener endelige fra konventionel batch reaktion og ikke-omrørte reaktionsblanding er typisk i god overensstemmelse hvis man minimerer batch syntese relaterede forstyrrelser, såsom for voldsom omrøring af reaktionsblandingen to EVda ud temperaturgradienter i den store reaktor eller overdreven mængde initiator opløsning, således at ændringerne reaktion temperatur under indledningen periode.
Dynamisk lysspredning er en veletableret og hurtig metode til bestemmelse diffusion adfærd af store antal partikler i situ. Det er imidlertid afgørende at erhverve data på flere spredningsvinkler. DLS målinger ved en vilkårlig vinkel, hvilket faldt sammen med en formfaktor minimum eller i tilfælde af brede størrelsesfordeling, vil føre til en tilsyneladende diffusionskoefficient væsentligt afviger fra middelværdien diffusionskoefficient af prøven. Sådanne tilfælde kan genkendes fra ikke-lineær opførsel i Γ 2 vs. q 2 plot. For at løse brede eller multimodale partikelstørrelsesfordelinger, kan man forsøge at anvende en invers Laplace transformation algoritme som CONTIN 34. DLS er dog ikke velegnet til dette formål på grund af dårligt aircondition NATure af inversion problem.
For både dynamisk og statisk lysspredning prøverne skal være tilstrækkeligt fortyndet til undgå multipel spredning, der afkræfter den rutinemæssige dataanalyse. For formfaktor bestemmelse ved SLS også brydningsindeksforskellen af partiklerne og opløsningsmiddel skal være lav for at undgå Mie-spredning, som forhindrer ligetil formfaktor analyse. Denne betingelse er opfyldt, når 
, hvor 
er radius middelpartikelstørrelse og 
forskellen mellem brydningsindeks opløsningsmiddel og partikler. For mikrogeler udstrakt hævede med opløsningsmiddel dette kriterium er opfyldt, men generelt partiklerne skal være kontrast matchet med tilstrækkelig høj brydningsindeks opløsningsmiddel. Mie spredning kan genkendes fra udtværing af tHan danner faktor minima, en effekt, som mindsker når brydningsindekset forskellen mindskes.
Lysspredning metoder giver ensemble gennemsnit oplysninger, hvorimod kan bruges bredt felt partikel sporing for at undersøge udbredelsen opførsel af enkelte partikler i virkelige rum. I modsætning til partikel sporing baseret på lysspredning, den høje følsomhed af fluorescens muliggør sporing af små partikler og, i det ekstreme tilfælde, selv individuelle molekyler. Derudover kan forholdet mellem mærkede og ikke-mærkede partikler indrettet til at måle præcist også i stærkt koncentrerede opløsninger. Partikel sporing giver derfor en model gratis måde at afgøre diffusionskoefficienten og diffusion tilstand af kolloider i situ selv giver mulighed for en sammenligning mellem den adfærd af enkelte partikler. Lokalisering nøjagtighed af enkelte sporstoffer er typisk bedre end diffraktionsgrænsen men afhænger af signal-til-støj-forholdet af fluorescens signal af enkelte partikler på opsætningen bredt felt. Således mærkning med farvestoffer, der udviser en høj kvanteudbytte, god fotostabilitet og et absorptionsmaksimum tæt på excitationsbølgelængden er en forudsætning for gode resultater. Tracer koncentrationen skal holdes lavt for at minimere passage af de baner af forskellige partikler forstyrrer tracking algoritme. For koncentrerede dispersioner, kan tætheden af fluorescerende sporstoffer justeres ved at blande mærkede og ikke-mærkede partikler. Nyere arbejde på punktspredningsfunktionen engineering muliggør 3D partikel sporing 35,36, som kan anvendes til at undersøge anisotropisk diffusion i forskellige retninger i rummet.
Sammenfattende præcis DLS karakterisering og reagensglas polymerisering lille målestok giver robust ramme for høj præcision tuning af mikrogel endelige partikel volumen. Lysspredning og fluorescens partikel sporing teknikker giver supplerende oplysninger om ensemblet ogenkelt partikel diffusion opførsel over stor spredning koncentrationsområde. Kombinationen af syntesen af veldefinerede bløde partikler med mulighed for at spore dem i opløsninger af forskellig koncentration vil være af væsentlig betydning for efterforskningen af dynamikken i bløde partikel systemer og en sammenligning med velundersøgte hårde kolloide systemer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetone | VWR Chemicals | KRAF13455 | |
| Bisacrylamid | AppliChem | A3636 | |
| n-Hexane | Merck | 104374 | |
| N-Isopropylacrylamide | Fisher Scientific | AC412785000 | recrystallized from n-hexane |
| Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences | 23591 | |
| Potassium peroxodisulfate | Merck | 105091 | |
| Silicone oil 47 V 350 | VWR Chemicals | 83851 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| F12 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9116612 | |
| Microscope | Olympus | IX83 | |
| XY(Z) Piezo System | Physik Instrumente | P-545.3R7 | |
| 100X Oil immersion objective | Olympus | UPLSAPO | |
| QuadLine Beamsplitter | AHF Analysentechnik | F68-556T | |
| Cobolt Jive 150 laser | Cobolt | 0561-04-01-0150-300 | |
| Multimode Fiber | Thorlabs | UM22-600 | |
| iXON Ultra 897 EMCCD camera | Andor | DU-897U-CS0-BV | |
| Laser goniometer | SLS Systemtechnik | Mark III | |
| CF40 Cryo-compact circulator | Julabo | 9400340 | |
| Laser goniometer system | ALV GmbH | ALV / CGS-8F | |
| Multi-tau corretator | ALV GmbH | ALV-7004 | |
| Light scattering electronics | ALV GmbH | ALV / LSE 5004 | |
| Photon counting module | PerkinElmer | SPCM-CD2969 | 2 units in pseudo cross-correlation mode |
| 633 nm HeNe Laser | JDS Uniphase | 1145P | |
| F32 Refrigerated/heating circulator | Julabo | 9312632 |
References
- Pelton, R.
- Pich, A., Richtering, W. Microgels by Precipitation Polymerization: Synthesis, Characterization and Functionalization. Adv. Polym. Sci. 234, 1-37 (2010).
- Richtering, W. Responsive Emulsions Stabilized by Stimuli-Sensitive Microgels: Emulsions with Special Non-Pickering Properties. Langmuir. 28 (50), 17218-17229 (2012).
- Wiese, S., Spiess, A. C., Richtering, W. Microgel-Stabilized Smart Emulsions for Biocatalysis. Angew. Chem. Int. Edit. 52 (2), 576-579 (2012).
- Schmitt, V., Ravaine, V. Surface compaction versus stretching in Pickering emulsions stabilised by microgels. Curr. Opin. Colloid In. 18 (6), 532-541 (2013).
- Wellert, S., Richter, M., Hellweg, T., von Klitzing,, R,, Hertle, Y. Responsive Microgels at Surfaces and Interfaces. Z. Phys. Chem. 229 (7-8), 1-26 (2015).
- Li, Z., Harbottle, D., Pensini, E., Ngai, T., Richtering, W., Xu, Z. Fundamental Study of Emulsions Stabilized by Soft and Rigid Particles. Langmuir. 31 (23), 6282-6288 (2015).
- Deshmukh, O. S., van den Ende, D., Stuart, M. C., Mugele, F., Duits, M. H. G. Hard and soft colloids at fluid interfaces: Adsorption, interactions, assembly & rheology. Adv. Colloid Interfac. 222, 215-227 (2015).
- Serpe, M. J., Kim, J., Lyon, L. A.
- Schmidt, S., Zeiser, M., Hellweg, T., Duschl, C., Fery, A., Möhwald, H. Adhesion and Mechanical Properties of PNIPAM Microgel Films and Their Potential Use as Switchable Cell Culture Substrates. Adv. Func. Mater. 20 (19), 3235-3243 (2010).
- Xia, Y., He, X., et al. Thermoresponsive Microgel Films for Harvesting Cells and Cell Sheets. Biomacromolecules. 14 (10), 3615-3625 (2013).
- Guan, Y., Zhang, Y. PNIPAM microgels for biomedical applications: from dispersed particles to 3D assemblies. Soft Matter. 7 (14), 6375 (2011).
- Yunker, P. J., Chen, K., Gratale, M. D., Lohr, M. A., Still, T., Yodh, A. G. Physics in ordered and disordered colloidal matter composed of poly(N-isopropylacrylamide) microgel particles. Rep. Prog. Phys. 77 (5), 056601-056629 (2014).
- Lohr, M. A., Still, T., et al. Vibrational and structural signatures of the crossover between dense glassy and sparse gel-like attractive colloidal packings. Phys. Rev. E. 90 (6), 062305 (2014).
- Dreyfus, R., Xu, Y., Still, T., Hough, L. A., Yodh, A. G., Torquato, S. Diagnosing hyperuniformity in two-dimensional, disordered, jammed packings of soft spheres. Phys. Rev. E. 91 (1), 012302-012312 (2015).
- Kojima, H., Tanaka, F. Reentrant volume phase transition of cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) gels in mixed solvents of water/methanol. Soft Matter. 8 (10), 3010-3011 (2012).
- Hofmann, C. H., Plamper, F. A., Scherzinger, C., Hietala, S., Richtering, W. Cononsolvency Revisited: Solvent Entrapment by N-Isopropylacrylamide and N, N-Diethylacrylamide Microgels in Different Water/Methanol Mixtures. Macromolecules. 46 (2), 523-532 (2013).
- Bischofberger, I., Calzolari, D. C. E., Trappe, V. Co-nonsolvency of PNiPAM at the transition between solvation mechanisms. Soft Matter. 10 (41), 8288-8295 (2014).
- Virtanen, O. L. J., Richtering, W. Kinetics and particle size control in non-stirred precipitation polymerization of N-isopropylacrylamide. Colloid Polym. Sci. 292 (8), 1743-1756 (2014).
- Virtanen, O. L. J., Ala-Mutka, H. M., Richtering, W. Can the Reaction Mechanism of Radical Solution Polymerization Explain the Microgel Final Particle Volume in Precipitation Polymerization of N-Isopropylacrylamide? Macromol. Chem. Phys. 216 (13), 1431-1440 (2015).
- Glatter, O. A new method for the evaluation of small-angle scattering data. J. Appl. Crystallogr. 10 (5), 415-421 (1977).
- Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr. 25 (4), 495-503 (1992).
- Glatter, O. Convolution Square Root of Band-Limited Symmetrical Functions and Its Application to Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 14, 101-108 (1981).
- Glatter, O., Hainisch, B. Improvements in Real-Space Deconvolution of Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 17, 435-441 (1984).
- Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative Comparison of Algorithms for Tracking Single Fluorescent Particles. Biophys. J. 81 (4), 2378-2388 (2001).
- Wöll, D., Kölbl, C., Stempfle, B., Karrenbauer, A. A novel method for automatic single molecule tracking of blinking molecules at low intensities. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (17), 6196-6205 (2013).
- Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Bioph. Biom. 26, 373-399 (1997).
- Pusey, P. N., van Megen, W. Detection of small polydispersities by photon correlation spectroscopy. J. Chem. Phys. 80 (8), 3513 (1984).
- Stieger, M., Pedersen, J. S., Richtering, W., Lindner, P. Small-angle neutron scattering study of structural changes in temperature sensitive microgel colloids. J. Chem. Phys. 120 (13), 6197-6206 (2004).
- Wu, X., Pelton, R. H., Hamielec, A. E., Woods, D. R., McPhee, W. The kinetics of poly(N-isopropylacrylamide) microgel latex formation. Colloid Polym. Sci. 272, 467-477 (1994).
- Weeks, E. R., Weitz, D. A. Subdiffusion and the cage effect studied near the colloidal glass transition. Chem. Phys. 284 (1-2), 361-367 (2002).
- Ernst, D., Köhler, J., Weiss, M. Probing the type of anomalous diffusion with single-particle tracking. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (17), 7686-7691 (2014).
- Virtanen, O. L. J. FitIt! (Version 1.1.4). , Available from: https://www.github.com/ovirtanen/fitit (2015).
- Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method For Inverting Data Represented By A Linear Algebraic or Integral Equations. Comput. Phys. Commun. 27 (3), 213-227 (1982).
- Holtzer, L., Meckel, T., Schmidt, T. Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells. Appl. Phys. Lett. 90 (5), 053902-053904 (2007).
- Diezmann, A. V., Lee, M. Y., Lew, M. D., Moerner, W. E. Correcting field-dependent aberrations with nanoscale accuracy in three-dimensional single-molecule localization microscopy. Optica. 2 (11), 985-989 (2015).
- Neutrons, X-rays and Light: Scattering Methods Applied to Soft Condensed Matter. Lindner, P., Zemb, T. , North Holland Delta Series. Amsterdam. (2002).
