Summary

Gecontroleerde Synthese en Fluorescentie Tracking of Highly Uniform Poly (<em> N</em> -isopropylacrylamide) Microgels

Published: September 08, 2016
doi:

Summary

Niet-geroerde precipitatie polymerisatie geeft een snelle, reproduceerbare prototyping aanpak van de synthese van stimuli-gevoelige poly (N -isopropylacrylamide) microgels smalle grootteverdeling. In dit protocol synthese, lichtverstrooiing karakterisering en enkel deeltje fluorescentie volgen van deze microgels in een wide-field microscopie setup worden gedemonstreerd.

Abstract

Stimuli-gevoelige poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels hebben verschillende potentiële praktische toepassingen en toepassingen in fundamenteel onderzoek. In dit werk, gebruiken we enkel deeltje het volgen van fluorescent gelabelde PNIPAM microgels als een showcase voor tuning microgel grootte door een snelle niet-geroerd neerslag polymerisatie procedure. Deze benadering is geschikt voor prototypen nieuwe reactiesamenstellingen voorwaarden of voor toepassingen die geen grote hoeveelheden product vereisen. Microgeldeeltje synthese, deeltjesgrootte en de structuur bepaling door dynamische en statische lichtverstrooiing worden beschreven in het protocol. Er wordt aangetoond dat de toevoeging van functionele comonomeren grote invloed op de deeltjes- nucleatie en structuur hebben. Afzonderlijke deeltjes volgen van wide-field fluorescentie microscopie maakt een onderzoek van de verspreiding van gemerkte tracer microgels in een geconcentreerde matrix ongelabelde microgels, een systeem gemakkelijk onderzocht doorandere werkwijzen zoals dynamische lichtverstrooiing.

Introduction

Stimuli-gevoelige poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels 1,2 zijn continue rente over de afgelopen twee decennia aangetrokken omwille van hun potentieel in diverse slimme toepassingen. Aantoonbare use cases bevatten schakelbare emulsiestabilisatoren 3-8, microlenzen 9, celkweek substraten voor gemakkelijke cel oogsten 10,11, en ​​slimme dragers voor verbindingen met laag molecuulgewicht en andere biomedische gebruikt 12. Vanuit een fundamenteel onderzoek oogpunt van deze deeltjes zijn bewezen nuttig zijn voor het onderzoeken van onderwerpen, zoals colloïdale interacties 13-15 en polymeer-oplosmiddel interacties 16-18.

Succesvolle gebruik van PNIPAM microgels en derivaten daarvan in een bepaalde toepassing vereist gewoonlijk kennis van de gemiddelde deeltjesgrootte en breedte van de deeltjesgrootteverdeling. Voor de juiste interpretatie van de experimentele resultaten met betrekking tot PNIPAM microgels, de deeltjesstructuur, die kan worden beïnvloed door functionele comonomeren, moet gekend worden. Dynamische en statische lichtverstrooiing (DLS en SLS respectievelijk) zijn uitermate geschikt voor het verkrijgen van deze informatie, omdat deze werkwijzen zijn snel en relatief eenvoudig te gebruiken; en ze sonde het deeltje eigenschappen niet-invasief in hun eigen omgeving (dispersie). DLS en SLS ook gegevens verzamelen van de enorme aantal deeltjes vermijden van de vertekening die voortvloeien uit kleine steekproeven, typisch voor microscopie methoden. Daarom is het eerste doel van dit werk is om goede praktijken in te voeren ten aanzien van lichtverstrooiing voor beoefenaars nieuwe colloïdale karakterisering.

Typisch wordt precipitatie polymerisatie in laboratoriumschaal uitgevoerd en vinden van de juiste reactieomstandigheden voor specifieke deeltjeseigenschappen kan moeizaam en vereist vele herhalingen van de synthese. In tegenstelling tot grote batch synthese, niet-geroerde precipitatie polymerisatie 19,20 is arAPID procedure waarbij batches van verschillende reactantsamenstelling kunnen worden gepolymeriseerd gelijktijdig meegevende deeltjes smalle grootteverdeling. Gelijktijdige polymerisatie minimaliseert experimentele variatie en grote output betekent dat de juiste reactie-omstandigheden snel kan worden gevonden voor opschaling van de reactie. Vandaar ons tweede doel is om het gebruik van niet-geroerde precipitatie polymerisatie aantonen prototyping en toepassingen die een grote hoeveelheid product vereisen.

Verschillende aspecten van de synthese en karakterisering komen samen in het voorbeeld van toepassing van fluorescent gemerkte PNIPAM microgels in colloïdale interactie onderzoek. Hier gebruiken we zeer nauwkeurige enkel deeltje volgen van de verspreiding van gemerkte tracer microgels in dispersie van ongelabelde matrix microgels over een breed matrix concentratiegebied te onderzoeken en op te lossen de kooi effect in geconcentreerde colloïdale dispersie. Wide-field fluorescentie microscopie is goed geschikt for dit doel kan het specifieke gedrag van enkele tracer moleculen karakteriseren van een groot aantal potentieel verschillende soorten matrix. Dit is in tegenstelling tot technieken zoals DLS, SLS en reologie, die het geheel gemiddelde eigenschappen van verschillende metingen en daarom kan het gedrag van kleine aantal probe deeltjes niet worden gevonden in een groot systeem. Verder in dit specifieke voorbeeld lichtverstrooiing conventionele werkwijzen kunnen niet worden ook gebruikt door de hoge concentratie van deeltjes, wat leidt tot een sterke meervoudige verstrooiing ongeldig maakt standaardanalyse. Het gebruik van geautomatiseerde verwerking van gegevens en statistische methoden mogelijk te maken analyse van de totale gedrag van het systeem ook voor enkel deeltje tracking, gemiddeld over grote steekproeven.

Protocol

1. Microgel Synthesis OPMERKING: N -isopropylacrylamide (NIPAM) werd herkristalliseerd uit n-hexaan. Andere reagentia werden gebruikt zoals ontvangen. Conventionele Batch Synthese van poly (NIPAM) Matrix Microgels Los op 1,8 g NIPAM en 24 mg N, N'-bisacrylamide (BIS) in 245 ml gefiltreerd (0,2 urn geregenereerde cellulose (RC) membraanfilter) dubbel gedestilleerd water in een 500 ml driehals rondbodemkolf voorzien van een terugvloeikoeler, een roerde…

Representative Results

Het aantal PNIPAM microgeldeeltjes in de batch, en dus het eindvolume deeltje, wordt het begin van de reactie bepaald gedurende de kiemvorming fase 20 hydrofobe comonomeer kleurstof methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B beïnvloedt de kiemvorming door vermindering van het aantal deeltjes dichtheid in de batch. De daling deeltjesconcentratie voor twee verschillende initiële NIPAM concentraties kunnen worden bes…

Discussion

Toevoeging van kleine hoeveelheden functionele comonomeer kan een significant effect op de deeltjesgrootte en de structuur van de PNIPAM verkregen microgels bezitten. Gelijktijdig kleinschalige reageerbuis polymerisatie is een goede methode om rekening te houden met deze veranderingen, en helpt bij het snel vinden van de juiste reactant composities voor doel deeltjesgrootte voor het opschalen van de reactie als dat nodig is. De massa van…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

The Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) is acknowledged for financial support within the Sonderforschungsbereich SFB 985 “Functional Microgels and Microgel Systems”.

Materials

Acetone VWR Chemicals KRAF13455
Bisacrylamid AppliChem A3636
n-Hexane Merck 104374
N-Isopropylacrylamide Fisher Scientific AC412785000 recrystallized from n-hexane
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B Polysciences 23591
Potassium peroxodisulfate Merck 105091
Silicone oil 47 V 350 VWR Chemicals 83851
Toluene Sigma Aldrich 244511
F12 Refrigerated/heating circulator Julabo 9116612
Microscope Olympus IX83
XY(Z) Piezo System Physik Instrumente P-545.3R7
100x Oil immersion objective Olympus UPLSAPO
QuadLine Beamsplitter AHF Analysentechnik F68-556T
 Cobolt Jive 150 laser Cobolt 0561-04-01-0150-300
Multimode Fiber Thorlabs UM22-600
iXON Ultra 897 EMCCD camera Andor DU-897U-CS0-BV
Laser goniometer SLS Systemtechnik Mark III
CF40 Cryo-compact circulator Julabo 9400340
Laser goniometer system  ALV GmbH ALV / CGS-8F
Multi-tau corretator ALV GmbH ALV-7004
Light scattering electronics ALV GmbH ALV / LSE 5004
Photon counting module PerkinElmer SPCM-CD2969 2 units in pseudo cross-correlation mode
633 nm HeNe Laser JDS Uniphase 1145P
F32 Refrigerated/heating circulator Julabo 9312632

References

  1. Pelton, R. Temperature-sensitive aqueous microgels. Adv. Colloid Interfac. 85, 1-33 (2000).
  2. Pich, A., Richtering, W. Microgels by Precipitation Polymerization: Synthesis, Characterization and Functionalization. Adv. Polym. Sci. 234, 1-37 (2010).
  3. Richtering, W. Responsive Emulsions Stabilized by Stimuli-Sensitive Microgels: Emulsions with Special Non-Pickering Properties. Langmuir. 28 (50), 17218-17229 (2012).
  4. Wiese, S., Spiess, A. C., Richtering, W. Microgel-Stabilized Smart Emulsions for Biocatalysis. Angew. Chem. Int. Edit. 52 (2), 576-579 (2012).
  5. Schmitt, V., Ravaine, V. Surface compaction versus stretching in Pickering emulsions stabilised by microgels. Curr. Opin. Colloid In. 18 (6), 532-541 (2013).
  6. Wellert, S., Richter, M., Hellweg, T., von Klitzing, ., R, Y., Hertle, Responsive Microgels at Surfaces and Interfaces. Z. Phys. Chem. 229 (7-8), 1-26 (2015).
  7. Li, Z., Harbottle, D., Pensini, E., Ngai, T., Richtering, W., Xu, Z. Fundamental Study of Emulsions Stabilized by Soft and Rigid Particles. Langmuir. 31 (23), 6282-6288 (2015).
  8. Deshmukh, O. S., van den Ende, D., Stuart, M. C., Mugele, F., Duits, M. H. G. Hard and soft colloids at fluid interfaces: Adsorption, interactions, assembly & rheology. Adv. Colloid Interfac. 222, 215-227 (2015).
  9. Serpe, M. J., Kim, J., Lyon, L. A. Colloidal Hydrogel Microlenses. Adv. Mater. 16 (2), 184-187 (2004).
  10. Schmidt, S., Zeiser, M., Hellweg, T., Duschl, C., Fery, A., Möhwald, H. Adhesion and Mechanical Properties of PNIPAM Microgel Films and Their Potential Use as Switchable Cell Culture Substrates. Adv. Func. Mater. 20 (19), 3235-3243 (2010).
  11. Xia, Y., He, X., et al. Thermoresponsive Microgel Films for Harvesting Cells and Cell Sheets. Biomacromolecules. 14 (10), 3615-3625 (2013).
  12. Guan, Y., Zhang, Y. PNIPAM microgels for biomedical applications: from dispersed particles to 3D assemblies. Soft Matter. 7 (14), 6375 (2011).
  13. Yunker, P. J., Chen, K., Gratale, M. D., Lohr, M. A., Still, T., Yodh, A. G. Physics in ordered and disordered colloidal matter composed of poly(N-isopropylacrylamide) microgel particles. Rep. Prog. Phys. 77 (5), 056601-056629 (2014).
  14. Lohr, M. A., Still, T., et al. Vibrational and structural signatures of the crossover between dense glassy and sparse gel-like attractive colloidal packings. Phys. Rev. E. 90 (6), 062305 (2014).
  15. Dreyfus, R., Xu, Y., Still, T., Hough, L. A., Yodh, A. G., Torquato, S. Diagnosing hyperuniformity in two-dimensional, disordered, jammed packings of soft spheres. Phys. Rev. E. 91 (1), 012302-012312 (2015).
  16. Kojima, H., Tanaka, F. Reentrant volume phase transition of cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) gels in mixed solvents of water/methanol. Soft Matter. 8 (10), 3010-3011 (2012).
  17. Hofmann, C. H., Plamper, F. A., Scherzinger, C., Hietala, S., Richtering, W. Cononsolvency Revisited: Solvent Entrapment by N-Isopropylacrylamide and N, N-Diethylacrylamide Microgels in Different Water/Methanol Mixtures. Macromolecules. 46 (2), 523-532 (2013).
  18. Bischofberger, I., Calzolari, D. C. E., Trappe, V. Co-nonsolvency of PNiPAM at the transition between solvation mechanisms. Soft Matter. 10 (41), 8288-8295 (2014).
  19. Virtanen, O. L. J., Richtering, W. Kinetics and particle size control in non-stirred precipitation polymerization of N-isopropylacrylamide. Colloid Polym. Sci. 292 (8), 1743-1756 (2014).
  20. Virtanen, O. L. J., Ala-Mutka, H. M., Richtering, W. Can the Reaction Mechanism of Radical Solution Polymerization Explain the Microgel Final Particle Volume in Precipitation Polymerization of N-Isopropylacrylamide?. Macromol. Chem. Phys. 216 (13), 1431-1440 (2015).
  21. Glatter, O. A new method for the evaluation of small-angle scattering data. J. Appl. Crystallogr. 10 (5), 415-421 (1977).
  22. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr. 25 (4), 495-503 (1992).
  23. Glatter, O. Convolution Square Root of Band-Limited Symmetrical Functions and Its Application to Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 14, 101-108 (1981).
  24. Glatter, O., Hainisch, B. Improvements in Real-Space Deconvolution of Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 17, 435-441 (1984).
  25. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative Comparison of Algorithms for Tracking Single Fluorescent Particles. Biophys. J. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  26. Wöll, D., Kölbl, C., Stempfle, B., Karrenbauer, A. A novel method for automatic single molecule tracking of blinking molecules at low intensities. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (17), 6196-6205 (2013).
  27. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Bioph. Biom. 26, 373-399 (1997).
  28. Pusey, P. N., van Megen, W. Detection of small polydispersities by photon correlation spectroscopy. J. Chem. Phys. 80 (8), 3513 (1984).
  29. Stieger, M., Pedersen, J. S., Richtering, W., Lindner, P. Small-angle neutron scattering study of structural changes in temperature sensitive microgel colloids. J. Chem. Phys. 120 (13), 6197-6206 (2004).
  30. Wu, X., Pelton, R. H., Hamielec, A. E., Woods, D. R., McPhee, W. The kinetics of poly(N-isopropylacrylamide) microgel latex formation. Colloid Polym. Sci. 272, 467-477 (1994).
  31. Weeks, E. R., Weitz, D. A. Subdiffusion and the cage effect studied near the colloidal glass transition. Chem. Phys. 284 (1-2), 361-367 (2002).
  32. Ernst, D., Köhler, J., Weiss, M. Probing the type of anomalous diffusion with single-particle tracking. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (17), 7686-7691 (2014).
  33. . FitIt! (Version 1.1.4) Available from: https://www.github.com/ovirtanen/fitit (2015)
  34. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method For Inverting Data Represented By A Linear Algebraic or Integral Equations. Comput. Phys. Commun. 27 (3), 213-227 (1982).
  35. Holtzer, L., Meckel, T., Schmidt, T. Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells. Appl. Phys. Lett. 90 (5), 053902-053904 (2007).
  36. Diezmann, A. V., Lee, M. Y., Lew, M. D., Moerner, W. E. Correcting field-dependent aberrations with nanoscale accuracy in three-dimensional single-molecule localization microscopy. Optica. 2 (11), 985-989 (2015).
  37. Lindner, P., Zemb, T. . Neutrons, X-rays and Light: Scattering Methods Applied to Soft Condensed Matter. , (2002).

Play Video

Cite This Article
Virtanen, O. L. J., Purohit, A., Brugnoni, M., Wöll, D., Richtering, W. Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels. J. Vis. Exp. (115), e54419, doi:10.3791/54419 (2016).

View Video