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Chemistry

Synthèse contrôlée et le suivi Fluorescence de très uniforme Poly ( Published: September 8, 2016 doi: 10.3791/54419
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physical Chemistry, RWTH Aachen University

Summary

Polymérisation par précipitation non agité fournit une approche de prototypage rapide, reproductible à la synthèse de stimuli-sensibles poly (N -isopropylacrylamide) microgels de distribution de taille étroite. Dans cette synthèse de protocole, la caractérisation de la diffusion de la lumière et unique suivi de fluorescence des particules de ces microgels dans une configuration de microscopie à champ large sont démontrées.

Abstract

Stimuli sensible poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels ont diverses applications pratiques prospectives et utilise dans la recherche fondamentale. Dans ce travail, nous utilisons seule particule suivi microgels de PNIPAM des marquées par fluorescence comme une vitrine pour la taille tuning microgel par un procédé de polymérisation de précipitation rapide non agité. Cette approche est bien adaptée pour le prototypage de nouvelles compositions de réaction et les conditions ou pour des applications qui ne nécessitent pas de grandes quantités de produit. synthèse de Microgel, la taille des particules et la détermination de la structure par diffusion de lumière dynamique et statique sont détaillés dans le protocole. Il est montré que l'addition de comonomères fonctionnels peuvent avoir une grande influence sur la nucléation des particules et la structure. suivi de particules unique par grand champ microscopie par fluorescence permet une enquête sur la diffusion de microgels traceurs marqués dans une matrice concentrée de microgels non marqués, un système pas facilement étudiée pard'autres méthodes telles que la diffusion de lumière dynamique.

Introduction

Stimuli sensible poly (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels 1,2 ont suscité un intérêt continu au cours des deux dernières décennies , en raison de leur potentiel dans diverses applications intelligentes. Les cas d'utilisation comprennent des stabilisants commutables démontrées en émulsion 3-8, 9 microlentilles, des substrats de culture cellulaire pour faciliter la récolte des cellules 10,11 et les transporteurs à puce pour des composés à faible poids moléculaire et d' autres utilisations biomédicales 12. D'un point de la recherche fondamentale de vue ces particules se sont avérées être utiles pour enquêter sur des sujets tels que les interactions colloïdales 13-15 et les interactions polymère-solvant 16-18.

L'utilisation réussie des microgels de PNIPAM et de leurs dérivés dans une application donnée nécessite généralement la connaissance de la taille moyenne des particules et la largeur de la distribution des tailles des particules. Pour l'interprétation correcte des résultats expérimentaux impliquant PNIPAM microdes gels, de la structure des particules, qui peut être affectée par des comonomères fonctionnels, doit être connue. diffusion de la lumière dynamique et statique (DLS et SLS, respectivement) sont particulièrement adaptés pour l'acquisition de ces informations parce que ces méthodes sont rapides et relativement facile à utiliser; et ils sondent les propriétés des particules non effractive dans leur environnement natif (dispersion). DLS et SLS recueillent également des données de grand nombre de particules en évitant les biais résultant de petite taille des échantillons, typiques pour les méthodes de microscopie. Par conséquent, le premier objectif de ce travail est de présenter les bonnes pratiques en ce qui concerne la diffusion de la lumière pour les praticiens de nouvelles à la caractérisation colloïdale.

En règle générale, la polymérisation par précipitation est effectuée à l'échelle du laboratoire et de trouver les conditions de réaction bonnes pour les propriétés spécifiques de particules peuvent être laborieux et nécessitent de nombreuses répétitions de la synthèse. Contrairement à la synthèse à grande discontinu, la polymérisation non agitée précipitation est de 19,20 arProcédure de apid dans lequel les lots de composition de réactifs différents peuvent être simultanément polymérisée particules plastification de distribution de taille étroite. polymérisation simultanée minimise la variation expérimentale et signifie grande sortie que les conditions de réaction de droite peuvent être trouvés rapide pour upscaling la réaction. Par conséquent, notre deuxième objectif est de démontrer l'utilité de la polymérisation non agitée précipitation dans le prototypage et dans les applications qui ne nécessitent pas une grande quantité de produit.

Différents aspects de la synthèse et la caractérisation sont réunis dans l'exemple d'application marqués par fluorescence microgels de PNIPAM dans la recherche sur l'interaction colloïdale. Ici, nous utilisons un suivi unique de particules de haute précision pour étudier la diffusion des microgels traceurs marqués dans la dispersion de microgels de matrice non marqués sur une large plage de concentration de la matrice et de résoudre l'effet de cage en dispersion colloïdale concentrée. Grand champ microscopie à fluorescence est bien adapté for cet effet, comme on peut caractériser le comportement spécifique de quelques molécules de traceur parmi un grand nombre d'espèces potentiellement différentes de la matrice. Ceci est en contraste avec des techniques telles que DLS, SLS et la rhéologie, qui mesurent les propriétés moyennes d'ensemble des systèmes et donc ne peut pas résoudre le comportement du petit nombre de particules de sonde dans un grand système. En outre, dans cet exemple spécifique des méthodes de diffusion de lumière classiques ne peuvent pas être utilisés aussi en raison de la concentration de particules élevée, ce qui conduit à une forte diffusion multiple viciant toute analyse standard. Utilisation du traitement automatisé des données et des méthodes statistiques permettant l'analyse du comportement global du système aussi pour le suivi des particules individuelles, en moyenne sur les grandes tailles d'échantillon.

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Protocol

1. Microgel Synthèse

REMARQUE: N -isopropylacrylamide (NIPAM) , on a fait recristalliser à partir de n-hexane. D'autres réactifs ont été utilisés tels que reçus.

  1. Conventionnel Batch Synthèse de poly (NIPAM) microgels Matrix
    1. Dissoudre 1,8 g de NIPAM et 24 mg de N, N '-bisacrylamide (BRI) dans 245 ml filtré (0,2 um de cellulose régénérée (RC) filtre à membrane) d'eau bidistillée dans un 500 ml à trois cols à fond rond équipé d'un condenseur à reflux, un agitateur et d'un septum en caoutchouc.
    2. Insérer un thermomètre et d'une aiguille de 120 mm pour l'apport d'azote à travers le septum.
    3. Chauffer la solution à 60 ° C, tout en agitant. Désoxygéner la solution en purgeant avec de l'azote pendant 40 min.
    4. En même temps préparer une solution d'initiateur de 155 mg de persulfate de potassium (KPS) dans 5 ml eau filtrée double distillée et bulle la solution avec de l'azote pour éliminer l'oxygène.
    5. Transférez les complets 5 ml KPS solution dans une seringue d'azote lavé équipé d'une aiguille de 120 mm.
    6. Soulever l'aiguille d'azote au-dessus du niveau de la solution dans le ballon à trois cols et à ajouter la solution de KPS rapidement à travers la cloison en caoutchouc dans le réacteur.
    7. Laissez la polymérisation procéder pendant 1 h sous flux d'azote et sous agitation lente à 60 ° C.
    8. Utilisez un entonnoir et le papier filtre Buchner pour filtrer la solution de réaction à chaud pour éliminer les grands agrégats. Laissez la dispersion refroidir.
    9. Centrifugeuse et redisperser la dispersion trois fois pour 40 minutes à 257.000 xg et enfin redisperser le sédiment dans une quantité minimale viable de l'eau distillée deux fois. Typiquement, cela est de 2-4 ml.
    10. Lyophiliser la dispersion pour le stockage.
  2. Synthèse non agitée de poly (NIPAM) microgels marqué par fluorescence
    1. Peser 257,7 mg NIPAM, 3,5 mg BIS, et 1,5 mg méthacryloxyéthyle thiocarbamoyle rhodamine B (colorant) dans un récipient en verre et ajouter 10 ml d'une double distillation filtréeeau ed.
    2. Ultrasonicate la solution de colorant monomère pendant 15 minutes pour dissoudre le colorant dans l'eau.
    3. Préparer de la même solution sans colorant dans un récipient en verre séparé.
    4. Préparer différentes dilutions de la solution de monomère avec le colorant en utilisant la solution de monomère sans que le colorant pour obtenir une série de concentrations avec diverses concentrations de colorant. Dans ce travail, utilisez un colorant dans la plage de concentration de 0,02-0,1 mmol / L.
    5. Dissoudre 8,4 mg KPS dans 10 ml eau filtrée distillée deux fois afin d'obtenir la solution d'initiateur.
    6. Transférer 0,5 ml de la série de concentrations et de 0,5 ml de la solution de KPS tubes à essai de 10 mm de diamètre pour obtenir des solutions de réaction final et les sceller avec des septums en caoutchouc.
    7. Préchauffer un bain d'huile dans un récipient à double paroi de verre reliée à un circulateur de chauffage à 63 ° C.
    8. Deoxygenize les solutions de réaction en purgeant avec de l'azote à travers les aiguilles 120 mm pendant 20 minutes.
    9. Insérer les tubes dans afloating plate-forme et immerger la plate-forme dans le bain d'huile préchauffé. Réglez la température à 60 ° C. température initiale plus élevée dans le bain est nécessaire que les solutions à température ambiante refroidir le bain. Pour une grande précision la taille des particules de réglage de la régulation de la température au cours de la première réaction doit être rigoureuse, typiquement ± 0,1 ° C.
    10. Laissez la réaction se déroule pendant un temps approprié. Généralement 1 heure suffit.
    11. Transférer les tubes de réaction rapide à l'étuve à 60 ° C et à mettre une goutte de la dispersion à chaud 10 ml d' eau filtrée bidistillée préchauffé par rapport au volume PNIPAM température de transition de phase (VPTT, 32 -34 ° C) 1, pour DLS caractérisation du état affaissé.
    12. Que le reste des dispersions refroidir à la température ambiante et de les transférer dans des tubes de centrifugeuse.
    13. Centrifuger la solution trois fois pour 40 minutes à 257.000 xg et diluer les microgels enfin dans 2 ml eau filtrée distillée deux fol'utilisation de r en tant que particules de traceur.

2. Light Scattering Caractérisation

  1. Hydrodynamiques Radius Détermination dans l'État Collapsed par Dynamic Light Scattering
    1. Laver les cuvettes et verrerie avec la vapeur d'acétone.
    2. Chauffer 10 ml de filtration (par exemple, 200 nm ou un filtre plus petit RC) de l' eau distillée deux fois plus de PNIPAM VPTT.
    3. Transférer une goutte de dispersion chaude à l'eau filtrée à l'aide d'une aiguille préalablement chauffée (0,9 x 40 mm) et une seringue (1 ml).
    4. Tempérez le DLS goniomètre bain de match de l'indice à 50 ° C et transférer l'échantillon à l'instrument sans le laisser refroidir.
    5. Trouver le plus grand angle de diffusion où l'intensité diffusée est suffisante pour acquérir un corrélogramme en effectuant des mesures de test.
      1. Insérer cuvette d'échantillon (10 mm de tube en verre de diamètre avec 1 ml d'une dispersion de particules). Déplacez le bras du détecteur à petit angle de diffusion (ici 30 °).
      2. Vérifiez le profil de faisceau for diffusion multiple: aucune lueur autour du faisceau primaire, pas la diffusion multiple, etc. Vérifiez que la plage de comptage est adapté à la mesure à l'angle le plus faible de diffusion (environ entre 30 et 600 kHz; coin supérieur droit de la fenêtre du logiciel..)
      3. Déplacez le bras de goniomètre au plus grand angle de diffusion (choisir 120 ° ici). Assurez-vous que le taux de comptage est encore assez élevé pour la mesure (entre 30 et 600 kHz). Si l'intensité est trop faible, déplacer le bras pour abaisser l'angle de diffusion.
    6. Vérifiez le faisceau visuellement à travers le verre de bain de toluène à l'angle de diffusion le plus bas, si lueur autour du faisceau incident est observé la diffusion multiple a lieu. Dans ce cas, réduire l'intensité du laser ou d'utiliser une plus grande dilution.
    7. Acquérir 20 corrélogrammes entre le minimum et le maximum de l' angle de diffusion (par exemple 30 ° - 140 °) avec un temps d'acquisition minimum de 60 secondes. Augmenter le temps d'acquisition pour faible intensité de grands angles de diffusionsi nécessaire.
  2. Analyse des données 37
    1. Calculer la dispersion des grandeurs de vecteurs pour l'angle de diffusion selon la eq 2 Où n est l'indice de réfraction de la dispersion, eq 3 la longueur d'onde du laser dans le vide, et eq 4 l'angle de diffusion.
    2. Dans le cas où le logiciel de mesure fournit la fonction de corrélation d'intensité eq 5 , Le transformer en fonction électrique de corrélation de champ eq 6 selon eq 7 . Paramètre eq 8 est un paramètre instrumental sans intérêt en rapport avec le degré de cohérence spatiale de la lumière diffusée over la zone de détection.
    3. Effectuer une analyse des cumulants sur corrélogrammes, à savoir, adapter polynôme du second ordre au logarithme de chaque fonction de corrélation de champ électrique eq 9 par moindres carrés linéaires. eq 8 apparaît comme l'interception de l'ajustement et sa valeur exacte est sans importance en ce qui concerne l'analyse des données. Restreindre l'ajustement à une valeur de τ de temps de latence significatif, par exemple, de sorte que l'amplitude de corrélation est de 10 - 20% de l'amplitude maximale. Le coefficient du premier terme d'ordre est le taux décroissance moyenne de la fonction de corrélation, eq 10 .
    4. Trouvez la valeur la plus probable pour le coefficient de diffusion moyen eq 11 des particules par moindres carrés linéaires tenir sur eq 12 . Sieq 10 contre eq 13 ne semble pas linéaire et passer par l'origine au sein de l'erreur, la distribution de taille des particules est large et rayon hydrodynamique sera mal défini.
    5. Calculer le rayon hydrodynamique moyen de la relation de Stokes-Einstein eq 14 où eq 15 est le coefficient de Boltzmann, eq 16 la température absolue et eq 17 la viscosité de la dispersion à eq 16 . Propager l'écart-type eq 11 à eq 18 .
    6. Particle Structure Détermination par Static Light Scattering
      1. Laver les cuvettes et verrerie avec la vapeur d'acétone. Utiliser 20 mm de diamètre ou plus grandes cuves pour minimiser l'effet de lentille cylindrique.
      2. Filtre (filtre RC 200 nm ou moins) à environ 20 ml d'eau bi-distillée dans un flacon en verre et transférer une goutte de dispersion purifiée dans le flacon. Laver le filtre avec 10 ml d'eau avant de l'utiliser pour la préparation des échantillons pour éliminer les impuretés restantes du processus de fabrication.
      3. Vérifiez échantillon contre toute source de lumière ambiante. Si la teinte bleue est observée, l'échantillon est susceptible d'être trop concentré. Diluer en conséquence.
      4. Préparer fond échantillon d'eau par rinçage de la cuvette plusieurs fois avec de l'eau filtrée, puis compléter au volume d'échantillon approprié, en fonction de la cuvette et la position du laser dans l'instrument. Le laser doit passer à travers l'échantillon sans être réfractée du ménisque.
      5. Calibrer le instrument à l'aide d'un échantillon de toluène.
      6. Mesurer la diffusion de l'eau (fond) dans toute la plage angulaire disponible.
      7. Mesurer l'intensité de diffusion de l'échantillon tout au long de la plage angulaire disponible de préférence à plusieurs longueurs d'onde. Le motif de diffusion normalisée à l'intensité de la diffusion vers l'avant est connu comme le facteur de forme.
      8. Si la structure des particules est connue, utiliser l'expression de modèle approprié pour calculer ajustement global sur les ensembles de données mesurées à différentes longueurs d'onde.
      9. De inconnue utilisation de la structure des particules régularisée directe ( par exemple, FitIt! 33) ou inverse indirecte plus générale transformée de Fourier 21,22 routine en conjonction avec une déconvolution de la fonction de distribution paire de distance (uniquement pour des particules sphériques) 23,24 pour une classification approximative des particules type.
      10. Dans le cas où la routine d'ajustement ou une inversion fournit une estimation de la fonction de distribution du rayon des particules, le calcul de la polydispersitéindice (écart-type de la distribution divisé par la moyenne).

    3. Suivi de particules par Wide-field Fluorescence Microscopy

    NOTE: Tracer et de la matrice des particules de 465 ± 7 nm et 405 ± 7 nm rayons hydrodynamiques à 20 ° C, respectivement, ont été utilisés pour le suivi des particules.

    1. La préparation des échantillons
      1. Préparer la dispersion matrice de microgel concentrée par redispersion quantité connue de microgel non marqué lyophilisé pour quantité connue d'eau distillée deux fois. Ajouter un petit volume de particules de traceur marqué.
      2. Confirmer la concentration de traceur microgel approprié dans le microscope. La concentration optimale est un compromis entre les acquisitions simultanées du nombre maximal de pistes, tout en ayant la concentration suffisamment faible traceur de telle sorte que la probabilité que les pistes traceur de particules se croisent lors de l'acquisition est négligeable.
      3. Préparer des dispersions concentrées par évaporationl'eau dans un four. Déterminer la concentration en poids en comparant le poids de la dispersion au poids initial de l'échantillon avant l'évaporation.
    2. Acquisition et analyse des données
      1. Utilisez un objectif approprié de l'agrandissement souhaité et l'ouverture pour l'excitation des traceurs et de collecte de fluorescence simultanée de l'échantillon. Dans ce travail, utiliser un NA immersion dans l'huile objectif 100X / 1.3.
      2. Placer la chambre de l'humidité sur une table piézo-xyz, qui se loge dans un microscope commercial.
      3. Pour empêcher l'échantillon de séchage, placez un plasma nettoyé lamelle dans la chambre de l'humidité et de la pipette 10 pl de poly (NIPAM) dispersion de la concentration souhaitée sur le bordereau.
      4. En fonction de l'excitation et des spectres d'émission du colorant fluorescent, en utilisant un laser d'excitation et adapté pour régler la puissance du laser de manière appropriée. L'intensité doit être suffisamment faible pour éviter photoblanchiment rapide des colorants, maisen même temps assez fort pour le positionnement unique de particules précise (voir ci-dessous). Dans ce travail, utiliser un 561 nm pompé par diode laser à l' état ​​solide et maintenir constante la puissance du laser à 16 mW (environ 0,5 kW cm -2 à l'échantillon) pour toutes les mesures.
      5. Pour obtenir un éclairage échantillon homogène, utiliser la configuration d'éclairage critique décrit ici. Pour cela, coupler le laser dans une fibre multimode (NA 0,22 ± 0,02, diamètre de noyau de 0,6 mm), secouer la fibre en utilisant un vortex afin de temporellement moyenne sur mouchetures laser et projet de fin de la fibre dans le plan de l'échantillon.
      6. Calibrer le z distance de la réflexion arrière de la lamelle et concentrer plusieurs micromètres dans l'échantillon en déplaçant l'objectif légèrement et fixer la position z en utilisant un z-Compensateur. Ceci permet d'éviter les effets d'interface avec la lamelle.
      7. Ajuster les paramètres du détecteur, comme le temps d'exposition, à l'intensité du signal de fluorescence. Dans ce cas, utiliser une caméra EMCCDavec le temps d'exposition de 0,1 s, le mode électronique et le gain de 50 multiplier.
      8. Acquérir plusieurs films avec le nombre approprié de trames pour obtenir un temps de latence suffisant pour calculer le déplacement quadratique moyen des microgels dans les différentes régions de l'échantillon. Dans ce travail, utiliser des numéros de trame d'acquisition de 500 ou 1000 images.
      9. Analyser les données en positionnant les particules dans chaque trame en utilisant raccord gaussien 25 et utiliser un algorithme de suivi de particules approprié 26 pour obtenir le déplacement quadratique moyen. 27 Calculer les valeurs moyennes et écart - type par la moyenne sur toutes les pistes dans tous les films. Calculer les longs coefficients de diffusion de temps de latence par régression linéaire à partir eq 19 , où eq 20 est le déplacement quadratique moyen, D le coefficient de diffusion moyenne et T pour le temps de latence.
      10. EstiMate le paramètre d'anomalie γ de l'équation de diffusion anormale eq 21 en transformant les données à échelle logarithmique, ce qui donne eq 22 . Le paramètre d'anomalie eq 23 est donnée par la dérivée de la parcelle. Le dérivé peut être évaluée par les différences finies de points de données ou de mise en place des points de données par des fonctions polynomiales et différencier de manière analytique. Déterminer le degré suffisant des fonctions d'ajustement de polynômes en traçant les résidus d'ajustement et la norme résiduelle pour augmenter polynôme.
      11. Répétez la même procédure pour les différentes concentrations des matrices de microgel.

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Representative Results

Le nombre de particules de microgel PNIPAM dans le lot, et par conséquent le volume de la particule finale, on détermine au début de la réaction pendant la phase de germination 20 Hydrophobe co-monomère colorant méthacryloxyéthyl thiocarbamoyle rhodamine B influe sur la nucléation en réduisant la densité du nombre de particules dans le lot. La diminution de la concentration en particules pour deux concentrations NIPAM initiales différentes peuvent être considérés comme augmentation du volume de la particule finale moyenne dans l'état affaissé avec l' augmentation de la concentration de colorant, représenté sur la figure 1. L'augmentation de volume peut être attribuée à la teinture co - monomère hydrophobe, ce qui favorise l'agrégation des noyaux de microgel au début des temps de réaction, ce qui réduit la concentration en particules et en augmentant le volume de la particule finale.

Les résultats de succès un DLS DE MESUREts sont présentés dans la figure 2. Pour les six plus petits lots de volume de particule finale dépendance linéaire du taux de décroissance moyenne Γ 2 sur q 2 et zéro ordonnée à l' origine au sein de l'erreur indiquent que les distributions de taille des particules pour ces lots sont relativement étroites et un puits estimation -defined pour le coefficient moyen de diffusion peut être obtenue à partir de la pente de la régression linéaire. la figure 3 montre un résultat plus complexe des deux plus grands lots de volumes, où Γ 2 dévie du comportement linéaire dans la plage q intermédiaire. La non-linéarité provient du minimum facteur de forme (modèle de diffusion angulaire) qui coïncide avec ces valeurs de q. 28 Le phénomène en question peut être observée pour les particules avec des dimensions comparables à la longueur d' onde du rayonnement laser incident et même une distribution de taille des particules modérée largeur. Détermination du coefficient de diffusion dans ce q figure 3, Γ 2 reflète le comportement moyen à nouveau à haute q, où toutes les fractions granulométriques contribuent de façon plus égale à l'intensité totale diffusée. Un moyen simple d'obtenir une estimation raisonnable pour le coefficient de diffusion moyen est d'exclure les intermédiaires Γ 2 valeurs de l'ajustement linéaire. Si le facteur de forme des particules sont connus, un procédé de montage plus complexe peut être utilisé 28.

La détermination du volume hydrodynamique dans l'état affaissé sans laisser les échantillons refroidir au-dessous du PNIPAM VPTT assure que la fraction de sol non gélifié n'a pas détaché des particules. Par conséquent, le volume dans l'état affaissé reflète la masse et le nombre des particules au cours de la polymérisation, ce qui est important si le Fundampropriétés entales de la polymérisation de précipitation sont étudiées 20. Volume dans l'état affaissé fournit également une bonne quantité pour comparer les différents paramètres de la réaction, car il est indépendant des propriétés de gonflement et de la fraction de polymère non gélifié dans les particules régulées par la quantité d'agent de réticulation dans le mélange de monomères. Une plus petite taille et plus le contraste de diffusion dans l'état affaissé facilitent également la caractérisation DLS.

Des données statiques de diffusion de la lumière mesurée à deux longueurs d'onde de 642 nm et 404 nm pour les particules de matrice et des traceurs sont représentés sur la figure 4 Contrôle visuel des motifs de diffusion angulaire révèle que les particules sont bien définies. Oscillations distinguées multiples typiques pour des particules sphériques dans toute q indique polydispersité étroite, dans ce cas , 7% et 6% pour les traceurs et la matrice microgels, respectivement. b lisseehavior à basse q indique que les échantillons sont suffisamment dilués et aucune agrégation significative des particules est présent. L'augmentation de l'intensité diffusée à l' extrême q peut être attribuée à la dispersion due à l'arrière faisceau réfléchi de la paroi de la cuve intérieure. Inversion des facteurs de forme des particules de matrice confirmer structure microgel typique 29 avec un noyau dense et en décomposition profil radialement de densité résultant de cross-linker copolymérisation cinétique 30 (voir encadré). La ligne pointillée montre le facteur de forme de la sphère dure de référence avec le même rayon moyen de giration que les particules de matrice. Le facteur de forme expérimentale désintègre plus vite avec q que le disque facteur de forme de sphère, ce qui est typique pour les particules de surface floue. En revanche, les particules de traceur présentent la structure de microgel non conventionnelle. Cela peut aussi être vu à partir de la référence dure facteur de forme de sphère, qui montre que le facteur de forme expérimentale ne initialementdécomposer plus rapidement que la référence. Ce résultat montre que les molécules de colorant en incorporant à microgels peuvent affecter leur structure, qui doit être pris en compte dans l'interprétation des résultats.

L'uniformité élevée des particules synthétisées est d' un grand intérêt pour les études de leur diffusion au volume de fractions autour de la température de transition vitreuse afin de déterminer avec précision le comportement de l' évolution dans ce régime 13, et le comparer à des particules dures 31. Par conséquent, une faible fraction de microgels marquées ont été mélangés avec un microgel non marqué d'une taille comparable. Excitation et d' émission des spectres de molécules de colorant microgel incorporé ainsi que la longueur d' onde d'excitation et la configuration du filtre utilisé dans la voie d'émission sont présentés sur la figure 5. Absorbance et des maxima d' émission de méthacryloxyéthyle thiocarbamoyle rhodamine B sont proches d' onde d' excitation et de la gamme de perception de la fluorescence,respectivement, ce qui permet une haute efficacité de collecte dans la configuration du suivi des particules. L'évolution temporelle du déplacement quadratique moyen pour microgels traçantes dans diverses concentrations de matrice microgel non marqué sont présentés dans la figure 6 et la figure 7 en linéaire et échelle logarithmique, respectivement. À des concentrations de la matrice de microgel bas les particules de traceur diffusent rapidement. Même si elles ne sont visibles que pour un nombre limité de trames avant de passer hors du plan de mise au point, une assez bonne estimation de leurs déplacements carrés moyens est possible. L'augmentation linéaire du déplacement quadratique moyen avec le temps indique le comportement de diffusion normale pour tous les temps de latence mesurées. Cependant, pour des concentrations de microgel à proximité de la transition vitreuse colloïdale, à savoir de 29 à 36 mg / ml, l'évolution temporelle des déplacements quadratique moyenne devient non-linéaire (voir Figure 7). Le comportement ressemble à celui des particules de PMMA de taille micrométrique colloïdales comme described par Weeks et Weitz 31 et peut être lié à l'effet de cage. Comme cela est représenté schématiquement sur ​​la figure 10, un microgel marqué dans une matrice dense peut diffuser assez librement dans la cage. Pour cette raison, le déplacement quadratique moyenne augmente linéairement dans les premières millisecondes. Cependant, étant donné que les particules sont piégées dans des cages transitoires formées par leurs voisins, un réarrangement collectif des microgels environnantes est nécessaire pour microgels de se déplacer plus loin. Cet effet de cage elle - même exprime dans une pente assez faible dans la deuxième plage de la figure 7, et peut être également confirmée par l' inspection des traces de particules dans la figure 9. À court temps de latence les particules trémousser dans leurs cages, à partir de laquelle ils échappent juste pour obtenir piégé à nouveau. Au temps de latence long, le comportement de diffusion linéaire est récupéré. effets Cage peuvent être analysées à l'aide des modèles de diffusion anormales où l'évolution temporelle de la (deux dimensions détecté) moyenne d carréisplacement est exprimée par une loi de puissance dans le temps: eq 24 ou sous sa forme logarithmique eq 25 avec le paramètre d'anomalie eq 26 32. Pour la diffusion normale, le paramètre d'anomalie est égal à 1, subdiffusion est représenté par des valeurs inférieures à 1. La figure 8 présente l'évolution temporelle du paramètre d'anomalie directement déterminée à partir de la pente dans le log-log-plot Figure 7. Pour les plus faibles concentrations de microgels dans notre étude, le paramètre d'anomalie est égale essentiellement à 1. pour les temps de latence eq 27 dans l'intervalle de quelques secondes, le facteur dévie de 1 vers des valeurs plus basses. Ce comportement est un artefact dû à ce que le axial (z-) Plage d'observation en microscopie à champ large est limitée à seulement quelques micromètres. La z- étroitegamme biaise l'analyse pour la diffusion rapide à intervalles de temps longs pour diffuser rapidement des traceurs à des concentrations faibles de la matrice. Quand on augmente la concentration de microgel, on constate que le minimum du paramètre d'anomalie est beaucoup plus prononcé et le passage à la diffusion normale ( eq 28 ) Apparaît plus tard. Ceci est une indication claire de l'effet de cage apparaissant pour les systèmes de microgels denses à l'approche de leur régime de transition vitreuse.

Figure 1
Figure 1:. Volume de particules unique dans l' état ​​effondré avec la concentration de colorant initial dans le lot Deux concentrations NIPAM initiales différentes ont été utilisées, 57,5 mmol dm -3 (cercles noirs) et 28,8 mmol dm -3 (rectangles gris). 1% en moles d'agent de réticulation a été utilisé. concentration KPS initiale était le même dans toutes les chauves-sourisChes à 1,56 mmol dm -3. Les barres d'erreur indiquent l'écart - type. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 2
Figure 2: Taux Decay avec le carré de l'amplitude du vecteur de diffusion pour les quatre plus petits lots de volume de microgel dépendance linéaire de. eq 29 q 2 sur zéro et l' ordonnée indique une distribution étroite des tailles de particules et indique que l' estimation bien définie du coefficient de diffusion moyenne peut être calculée à partir de la pente de la régression linéaire. Concentrations NIPAM étaient 57,5 mmol dm -3 (carrés rouges et oranges inversé triangles) et 28,8 mmol dm -3 (reste des symboles). concentrations Dye étaient 0,044 mmol dm -3 (carrés rouges), 0,022 mmol dm -3 (triangles inversés orange), 0,088 mmol dm -3 (triangles verts), 0,066 mmol dm -3 (losanges cyan), 0,044 mmol dm -3 (triangles bleu foncé), et 0,022 mmol dm -3 (cercles roses). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3:. Taux Decay avec le carré de l'amplitude du vecteur de diffusion pour les deux plus grands lots de volume comportement non-linéaire de Γ 2 avec q 2 dans la gamme de q centrale est causée par les changements dans la pondération de l' intensité du signal en différentes fractions de taille au voisinage du minimum de facteur de forme. concentration NIPAM dans les lots les deux étaient 57,5 ​​mmol dm-3, Les concentrations de colorant sont 0,088 mmol dm -3 (cercles noirs) et 0,066 mmol dm -3 (triangles rouges). Symboles Faded ont été exclus de l'ajustement linéaire. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4: facteurs Forme du traceur marqué et les particules de matrice non marquées Pour les deux particules le facteur de forme a été mesurée à deux longueurs d' onde, 642 nm (points de données bleu et rouge clair) et 404 nm (vert et points de données bleu foncé).. Les lignes pleines sont des crises mondiales à la 642 nm et 404 nm ensembles de données. Les lignes pointillées montrent des facteurs de forme de disques particules de référence de la sphère avec le même rayon de giration que des particules de matrice et traceurs (orange et vert lignes pointillées, respectivement.) Insets montrer particules normaliséeprofils de densité du noyau à la surface calculée, par exemple, FitIt! S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5:. Excitation et spectres d' émission de fluorescence marquée des particules de microgel ligne bleue représente le spectre d'émission d' excitation et de la ligne rouge. ligne verticale solide est la longueur d'onde d'excitation. La zone ombrée représente la collection de fluorescence gamme de longueur d'onde. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: disp quadratique moyennelacement avec le temps de latence pour les particules de traceur. Les concentrations de microgel de matrice non marqué était 15,56 mg / ml ( à gauche), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml et 35,35 mg / ml. Points et les barres d'erreur représentent les valeurs expérimentales et écart-type, respectivement. Les lignes pleines sont des ajustements linéaires aux points de données. Encart montre un grand champ fluorescence micrographie de microgels traçantes à 35,35 mg / concentration de matrice ml. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7:. Moyenne quadratique avec le temps de latence pour les particules de traceur en échelle logarithmique des concentrations de microgel de matrice Unlabeled étaient 15,56 mg / ml ( à gauche), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml et 35,3 5 mg / ml. Points et les barres d'erreur représentent les valeurs expérimentales et écart-type, respectivement. Les lignes continues sont fits polynômes aux points de données. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 8
Figure 8:. Les paramètres d' anomalie avec un temps de retard pour des particules traceuses des concentrations de microgel de matrice non marqué était de 15,56 mg / ml ( à gauche), 22,05 mg / ml, 28,28 mg / ml, 28,67 mg / ml, 30,32 mg / ml, 31,13 mg / ml et 35,35 mg / ml. Les points représentent les dérivés estimés par les différences finies et des lignes solides calculées analytiquement dérivés des crises polynôme à la figure 7. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

e_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Figure 9
Figure 9:.. Les traces de particules pour 12 microgels traçantes en dispersion avec 35,35 mg / concentration de matrice ml Clustering de pistes aux résultats distinctifs de blobs de particules du traceur étant piégés dans des cages transitoires formées par leurs voisins non marqués S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande cette figure.

Figure 10
Figure 10:. Illustration schématique de traceur microgel diffusion en dispersion matrice microgel non marquée concentrée trajectoire rouge désigne la diffusion rapide des traceurs dans les cages transitoires (ligne pointillée bleue) formée par les particules voisines. Bleu trajectoire désigne longue ti lagme diffusion permis par le réarrangement collectif des cages transitoires. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 11
Figure 11:. Longs coefficients de diffusion du temps de latence avec une concentration de microgel matrice non marqué à une concentration en matrice à faible diffusion des microgels de traceur n'a pas été affectée par les particules de matrice. Avec une concentration croissante matrice de microgel la diffusion à long temps ralentit ordres de grandeur , car la diffusion nécessite un réarrangement collectif des cages transitoires, où les traceurs sont pris au piège. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

L'addition de petites quantités de co-monomère fonctionnel peut avoir un effet significatif sur la taille des particules et la structure des dérivés PNIPAM microgels. Simultanée à petite échelle polymérisation en tube à essai est une bonne méthode pour tenir compte de ces changements, et aide à trouver rapidement les compositions réactives à droite pour la taille de particule cible pour upscaling la réaction selon les besoins. La masse des particules est approximativement de manière exponentielle dépendant de la température de polymérisation lors de la décomposition thermique d' initiateur, tel que KPS 20 est utilisé, et par conséquent on a besoin d'établir un contrôle de température stable et précise à l' intérieur du réacteur pour une bonne reproductibilité. volumes de particules finales de réaction discontinue classique et réaction non agité sont généralement en bon accord si l'on minimise les perturbations de synthèse des lots connexes, tels que l'agitation trop violente du mélange de réaction à even dehors des gradients de température dans le réacteur de grande dimension, ou en utilisant quantité excessive de solution d'initiateur de façon que les variations de la température de réaction pendant la période d'initiation.

Diffusion de la lumière dynamique est une méthode bien établie et rapide pour déterminer le comportement de diffusion d' un grand nombre de particules in situ. Il est cependant essentiel d'acquérir des données à de multiples angles de diffusion. DLS mesures à l'un angle arbitraire, coïncidant avec un facteur de forme minimum ou dans le cas de la distribution granulométrique large, conduisent à un coefficient apparent de diffusion diffère de manière significative à partir du coefficient de diffusion moyenne de l'échantillon. De tels cas peuvent être reconnus d' un comportement non-linéaire dans Γ 2 vs 2 q parcelle. Pour résoudre les distributions larges ou multimodaux la taille des particules, on peut tenter d'utiliser un algorithme de transformation de Laplace inverse, comme CONTIN 34. DLS est cependant pas parfaitement adapté à cette fin en raison de nat mal conditionnéure du problème d'inversion.

Pour la fois la lumière dynamique et statique dispersant les échantillons doivent être dilués suffisamment pour éviter la diffusion multiple, ce qui annule l'analyse des données de routine. Pour la détermination du facteur de forme par SLS aussi la différence d'indice de réfraction des particules et solvant doit être faible afin d'éviter la diffusion de Mie, ce qui empêche simple analyse de facteur de forme. Cette condition est remplie lorsque eq 30 , où eq 31 est le rayon moyen des particules, et eq 32 la différence entre les indices de réfraction du solvant et des particules. Pour microgels largement gonflés de solvant ce critère est rempli, mais en général, les particules doivent être contraste appariés avec un solvant d'indice de réfraction suffisamment élevé. la diffusion de Mie peut être reconnue à partir du maculage de til facteur de forme minima, un effet, ce qui diminue lorsque la différence d'indice de réfraction diminue.

les méthodes de diffusion de la lumière fournissent ensemble des informations en moyenne, alors que le suivi des particules à grand champ peut être utilisé pour étudier le comportement de diffusion de particules individuelles dans l'espace réel. Contrairement à un suivi de particules en fonction de diffusion de la lumière, la sensibilité élevée de la fluorescence permet un suivi de petites particules et, dans le cas extrême, même des molécules simples. En outre, la proportion de particules marquées et non marquées peuvent être adaptées pour mesurer avec précision aussi dans des solutions hautement concentrées. Suivi de particules fournit donc un moyen de modèle libre de déterminer le mode de colloïdes in situ , même permettant une comparaison entre les comportements des particules individuelles coefficient et la diffusion de la diffusion. la précision de la localisation des marqueurs individuels est souvent préférable que la limite de diffraction mais dépend du rapport signal-bruit si le rapport entre la fluorescencegnal de particules simples sur la configuration grand champ. Ainsi, le marquage avec des colorants qui présentent un rendement quantique élevé, une bonne photostabilité et un maximum d'absorption proche de la longueur d'onde d'excitation est une condition préalable à de bons résultats. concentration du traceur doit être maintenu bas afin de minimiser croisement des trajectoires des différentes particules perturbant l'algorithme de suivi. Pour les dispersions concentrées, la densité des marqueurs fluorescents peut être ajustée par mélange de particules marquées et non marquées. Des travaux récents sur le point propagation ingénierie 3D fonction permet le suivi des particules 35,36, qui peut être utilisée pour étudier la diffusion anisotrope dans différentes directions de l' espace.

En résumé, la caractérisation de DLS précis et polymérisation en tube à essai à petite échelle fournissent cadre solide pour le réglage de haute précision du volume de particule finale de microgel. techniques de diffusion de la lumière et de suivi de fluorescence des particules fournissent des informations complémentaires sur l'ensemble etle comportement de diffusion de particules unique sur une large gamme de concentration de dispersion. La combinaison de la synthèse des particules molles bien définies avec la possibilité de les suivre dans les solutions de concentration différente sera d'une grande importance pour l'étude de la dynamique des systèmes de particules souples et une comparaison avec les systèmes colloïdaux durs bien étudiés.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals KRAF13455
Bisacrylamid AppliChem A3636
n-Hexane Merck 104374
N-Isopropylacrylamide Fisher Scientific AC412785000 recrystallized from n-hexane
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B Polysciences 23591
Potassium peroxodisulfate Merck 105091
Silicone oil 47 V 350 VWR Chemicals 83851
Toluene Sigma Aldrich 244511
F12 Refrigerated/heating circulator Julabo 9116612
Microscope Olympus IX83
XY(Z) Piezo System Physik Instrumente P-545.3R7
100X Oil immersion objective Olympus UPLSAPO
QuadLine Beamsplitter AHF Analysentechnik F68-556T
Cobolt Jive 150 laser Cobolt 0561-04-01-0150-300
Multimode Fiber Thorlabs UM22-600
iXON Ultra 897 EMCCD camera Andor DU-897U-CS0-BV
Laser goniometer SLS Systemtechnik Mark III
CF40 Cryo-compact circulator Julabo 9400340
Laser goniometer system  ALV GmbH ALV / CGS-8F
Multi-tau corretator ALV GmbH ALV-7004
Light scattering electronics ALV GmbH ALV / LSE 5004
Photon counting module PerkinElmer SPCM-CD2969 2 units in pseudo cross-correlation mode
633 nm HeNe Laser JDS Uniphase 1145P
F32 Refrigerated/heating circulator Julabo 9312632

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Chimie N ° 115 le poly (N-isopropylacrylamide) la polymérisation par précipitation marquage par fluorescence des microgels la diffusion de la lumière le suivi des particules la microscopie par fluorescence
Synthèse contrôlée et le suivi Fluorescence de très uniforme Poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) microgels
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Virtanen, O. L. J., Purohit, A.,… More

Virtanen, O. L. J., Purohit, A., Brugnoni, M., Wöll, D., Richtering, W. Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels. J. Vis. Exp. (115), e54419, doi:10.3791/54419 (2016).

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