Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Контролируемый синтез и флуоресценция отслеживание высокой однородности поли ( Published: September 8, 2016 doi: 10.3791/54419
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Institute of Physical Chemistry, RWTH Aachen University

Summary

Non-перемешивалась полимеризации осадков обеспечивает быстрое, воспроизводимое прототипирования подход к синтезу раздражителей-чувствительных поли (N -isopropylacrylamide) микрогелей узким распределением по размерам. В этом синтезе протокола, свет характеристика рассеяния и флуоресценции одного отслеживания частиц этих микрогелей в установке микроскопии широкого поля демонстрируются.

Abstract

Стимулы чувствительные поли (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) микрогели имеют различные перспективные практического применения и использования в фундаментальных исследованиях. В этой работе мы используем одну частицу отслеживания флуоресцентно меченых PNIPAM микрогелей как витрина для размера настройки микрогелевого быстрым не перемешанной методикой полимеризации осадков. Этот подход хорошо подходит для создания прототипов новых композиций реакции и условий или для приложений, которые не требуют большого количества продукта. Синтез микрогель, размер частиц и определение структуры с помощью динамического и статического рассеяния света подробно описаны в протоколе. Показано, что добавление функциональных сомономеров могут иметь большое влияние на зарождение и структуры частиц. Одно отслеживание частиц по широким полем флуоресцентной микроскопии позволяет исследованию диффузии меченых трассирующих микрогелей в концентрированном матрице немеченого микрогелей, система легко не исследоваласьДругие методы, такие как динамического рассеяния света.

Introduction

Стимулы чувствительные поли (N -isopropylacrylamide) (PNIPAM) микрогели 1,2 привлекли постоянный интерес в течение последних двух десятилетий из - за их потенциала в различных интеллектуальных приложений. Продемонстрированные случаи использования включают переключаемые стабилизаторов эмульсии 3-8, микролинз 9, культура клеток субстратов для легкого сбора клеток 10,11 и смарт - носителей для низкомолекулярных соединений и других биомедицинских использует 12. С фундаментальной точки зрения исследований эти частицы были доказаны , чтобы быть полезным для изучения предметов , таких как коллоидных взаимодействий 13-15 и полимер-растворитель взаимодействий 16-18.

Успешное использование PNIPAM микрогелей и их производных в любом приложении, как правило, требует знания о среднего размера частиц и ширины распределения частиц по размерам. Для правильной интерпретации результатов эксперимента с участием PNIPAM микрогели, структура частиц, которая может зависеть от функциональных сомономеров, должно быть известно. Динамическое и статическое рассеяние света (DLS и СЛС, соответственно) однозначно подходит для получения этой информации, потому что эти методы быстро и относительно просты в использовании; и они зондировать свойства частиц неинвазивным в их родной среде (дисперсии). DLS и СЛС также собирать данные из огромного числа частиц избежать смещения, возникающего из малых размеров выборки, характерных для методов микроскопии. Таким образом, первая цель этой работы является внедрение хорошей практики в отношении рассеяния света для специалистов-практиков новых к коллоидной характеристике.

Как правило, полимеризация осаждение проводят в лабораторном масштабе и поиск нужных условий реакции для специфических свойств частиц может быть трудоемким и требует много повторений синтеза. В отличие от большого пакетного синтеза, без осадков перемешивают полимеризации 19,20 является арПроцедура APID, в котором партий различных реагентной композиции могут быть полимеризованы одновременно прибыльные частицы узким распределением по размерам. Одновременная полимеризация минимизирует экспериментальное изменение и большой выход означает, что правильные условия реакции могут быть найдены быстро для масштабировании реакции. Следовательно, наша вторая цель состоит в том, чтобы продемонстрировать полезность полимеризации, не размешивают осаждения в прототипирования и в приложениях, которые не требуют большого количества продукта.

Различные аспекты синтеза и характеристики объединяются в примере применения флуоресцентных меченый PNIPAM микрогелей в коллоидной исследования взаимодействия. Здесь мы используем высокоточное отслеживание одной частицы, чтобы исследовать диффузию меченых трассирующих микрогелей в дисперсии немеченых матричных микрогелей в широком диапазоне концентраций матрицы и устранить эффект клетки в концентрированной коллоидной дисперсии. Широкое поле флуоресцентной микроскопии хорошо подходит FOR эта цель, как это может характеризовать специфическое поведение нескольких молекул трассеров среди большого количества потенциально различных видов матриц. Это в отличие от таких методов, как DLS, СЛС и реологии, измеряющих среднее по ансамблю свойств систем и, следовательно, не может разрешить поведение небольшого числа пробных частиц в большой системе. Кроме того, в этом конкретном примере, обычные методы рассеяния света не может быть использовано также в связи с высокой концентрацией частиц, что приводит к сильному многократного рассеяния любой стандартный утрачивает анализ. Использование автоматизированной обработки данных и статистических методов позволяют анализировать поведение системы в целом также для одного отслеживания частиц при усреднении по больших размеров выборки.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. микрогель Синтез

Примечание: N -isopropylacrylamide (NIPAM) перекристаллизовывают из н-гексана. Другие реагенты использовали в полученном виде.

  1. Обычные Пакетное Синтез поли (NIPAM) Matrix микрогелями
    1. Растворить 1,8 г NIPAM и 24 мг N, N '-bisacrylamide (BIS) в 245 мл отфильтрованных (0,2 мкм из регенерированной целлюлозы (RC) мембранный фильтр) двойной дистиллированной воды в 500 мл трехгорлую круглодонную колбу , снабженную обратным холодильником, перемешивающим устройством и резиновой перегородкой.
    2. Вставьте термометр и 120 мм иглу для ввода азота через мембрану.
    3. Раствор нагревают до 60 ° С, при перемешивании. Обескислороживание раствор продувкой азотом в течение 40 мин.
    4. Одновременно готовят раствор инициатора 155 мг персульфата калия (КПС) в 5 мл отфильтрованных дважды дистиллированной водой и пузырь раствора с азотом для удаления кислорода.
    5. Передача полных 5 мл КПС секв способность по азотного промытые шприц, снабженный 120-мм иглой.
    6. Поднимите иглу азота выше уровня раствора в колбе трехгорлой и добавляют раствор KPS быстро через резиновую перегородку в реактор.
    7. Пусть полимеризацию проводят в течение 1 ч в токе азота и медленном перемешивании при 60 ° С.
    8. Используйте воронку и бумажный фильтр Бюхнера для фильтрации горячего реакционного раствора, чтобы отбрасывать большие агрегаты. Пусть дисперсия остыть.
    9. Центрифуга и редиспергируются Дисперсия три раза в течение 40 мин при 257000 х г и, наконец, повторно диспергируют осадка в минимальном количестве жизнеспособных бидистиллированной воды. Как правило, это составляет 2-4 мл.
    10. Лиофилизации дисперсии для хранения.
  2. Non-перемешивалась Синтез флуоресцентно меченных поли (NIPAM) микрогелей
    1. Взвешивание 257,7 мг NIPAM, 3,5 мг BIS и 1,5 мг methacryloxyethyl тиокарбамоильная родамина B (краситель) в стеклянный сосуд и добавляют 10 мл фильтрованной двойной Отфильтровываюред вода.
    2. Ultrasonicate краситель-мономер раствор в течение 15 мин, чтобы растворить краситель в воде.
    3. Приготовить такой же раствор без красителя в отдельный стеклянный сосуд.
    4. Приготовьте различные разведений раствора мономера с красителем с использованием мономерного раствора, без красителя для получения концентраций, при различных концентрациях красителя. В этой работе, используют краситель в диапазоне концентраций 0,02-0,1 ммоль / л.
    5. Растворить 8,4 мг КПС в 10 мл отфильтрованных бидистиллированной воды, чтобы получить раствор инициатора.
    6. Перенести 0,5 мл концентраций, и 0,5 мл раствора КПС в пробирки с диаметром 10 мм, чтобы получить конечные реакции решения, и запечатать их с резиновыми перегородками.
    7. Предварительный нагрев масляной бани в двойными стенками стеклянный сосуд, соединенный с нагревательным циркулятора до 63 ° C.
    8. Deoxygenize реакционных растворов продувкой азотом через иглы 120 мм в течение 20 мин.
    9. Вставьте трубки в афloating платформу и погрузите платформу в предварительно нагретую масляную баню. Установите температуру до 60 ° С. Изначально более высокая температура в бане необходимо, так как температура в помещении растворы охладить ванну. Для настройки высокой точности размеров частиц контроль температуры во время первоначальной реакции должна быть строгой, как правило, ± 0,1 ° C.
    10. Пусть реакция протекать в течение соответствующего времени. Как правило, 1 час достаточно.
    11. Перенести реакционные трубы быстро в печи при температуре 60 ° С и положить одну каплю горячей дисперсии в 10 мл отфильтрованных бидистиллированной воды , предварительно нагретой по объему PNIPAM температуры фазового перехода (VPTT, 32 -34 ° C) 1, для DLS характеристик в свернутое состояние.
    12. Пусть остальные дисперсии охладиться до комнатной температуры и перевести их в центрифужные пробирки.
    13. Центрифуга Раствор три раза в течение 40 мин при 257000 XG и разбавленных микрогелей, наконец, в 2 мл отфильтрованных дважды дистиллированной воды FOиспользование в качестве г трассирующих частиц.

2. Рассеяние света Характеристика

  1. Определение гидродинамического радиуса в свернутом состоянии путем динамического рассеяния света
    1. Вымойте кюветки и изделия из стекла с парами ацетона.
    2. Тепло 10 мл фильтрованной (например, 200 нм или меньше , RC фильтр) дважды дистиллированной воды над PNIPAM VPTT.
    3. Перенести каплю горячей дисперсии в отфильтрованной воде с использованием предварительно нагретой иглы (0,9 х 40 мм) и шприц (1 мл).
    4. Закалить DLS гониометра индекс соответствия ванны до 50 ° C и переноса образца в прибор, не давая ей остыть.
    5. Найдите наибольший угол рассеяния, где интенсивность рассеянного света достаточно, чтобы приобрести коррелограмме, выполняя контрольные измерения.
      1. Вставка образца кювету (10 мм стекла диаметром трубки 1 мл дисперсии частиц). Перемещение рычага детектора малого угла рассеяния (здесь 30 °).
      2. Проверьте профиль пучка Foг многократного рассеяния: нет свечения вокруг первичного пучка, отсутствие многократного рассеяния и т.д. Убедитесь , что диапазон счетчика предназначен для измерения на самом низком угле рассеяния (приблизительно от 30 до 600 кГц, в правом верхнем углу окна программы.) .
      3. Переместить гониометра руку до самого высокого угла рассеяния (выбрать 120 ° здесь). Убедитесь, что скорость счета по-прежнему достаточно высок для измерения (от 30 до 600 кГц). Если интенсивность слишком низкая, переместить руку, чтобы нижний угол рассеяния.
    6. Проверьте луч визуально через толуол ванны стекло на самом низком угле рассеяния, если свечение вокруг падающего пучка наблюдается многократное рассеяние происходит. В этом случае, уменьшить интенсивность лазерного излучения или использовать более высокое разбавление.
    7. Приобретать 20 коррелограмм между минимальным и максимальным углом рассеяния (например, 30 ° - 140 °) с минимальным временем приобретения 60 сек. Увеличьте время приобретения для слабой интенсивности больших углов рассеянияесли необходимо.
  2. Анализ данных 37
    1. Расчет рассеяния векторных величин для угла рассеяния согласно уравнение 2 , Где п - показатель преломления дисперсии, уравнение 3 длина волны лазера в вакууме и уравнение 4 угол рассеяния.
    2. В случае, программное обеспечение измерения обеспечивает функцию корреляции интенсивности уравнение 5 , Преобразование его корреляционной функции электрического поля уравнение 6 в соответствии с уравнение 7 , параметр уравнение 8 это неинтересный инструментальный параметр, связанный со степенью пространственной когерентности рассеянного света Овег площади детектора.
    3. Выполните кумулянт анализ на кореллограмм, т.е. подходят полином второго порядка к логарифму каждой корреляционной функции электрического поля уравнение 9 линейными методом наименьших квадратов. уравнение 8 выступает как перехватывать фита и его точное значение не имеет значения по отношению к анализу данных. Ограничить впору содержательного значения т времени запаздывания, например, так , что амплитуда корреляции составляет 10 - 20% от максимальной амплитуды. Коэффициент члена первого порядка является средняя скорость затухания корреляционной функции, уравнение 10 ,
    4. Найти наиболее вероятное значение среднего коэффициента диффузии уравнение 11 частиц линейными наименьших квадратов на уравнение 12 , Еслиуравнение 10 против уравнение 13 не появляется линейно и проходит через начало координат в пределах ошибки определения распределения частиц по размерам является широким и гидродинамический радиус будет плохо определена.
    5. Вычислить среднее гидродинамический радиус из соотношения Стокса-Эйнштейна уравнение 14 , где уравнение 15 коэффициент Больцмана, уравнение 16 абсолютная температура и уравнение 17 вязкость дисперсии в уравнение 16 , Размножаются стандартное отклонение уравнение 11 к уравнение 18 ,
    6. Частица Определение структуры под воздействием статического рассеяния света
      1. Вымойте кюветки и изделия из стекла с парами ацетона. Используйте диаметр 20 мм и более кювет, чтобы минимизировать цилиндрический эффект линзы.
      2. Фильтр (200 нм RC-фильтра или меньше) примерно в 20 мл дистиллированной воды в стеклянную пробирку и переносят каплю очищенного дисперсии во флакон. Промыть фильтр 10 мл воды перед использованием для приготовления образца для удаления примесей, оставшихся из производственного процесса.
      3. Проверьте образец против любого окружающего источника света. Если наблюдается голубой оттенок, образец, вероятно, будет слишком сгущают. Развести соответственно.
      4. Подготовка фона пробы воды с помощью промывки в кювету несколько раз с фильтрованной водой, а затем заполнить до соответствующего объема образца, в зависимости от кювету и положение лазера в приборе. Лазер должен проходить через образец без преломляется от мениска.
      5. Откалибруйте INSTRUMлор, используя образец толуола.
      6. Мера воды рассеяние (фон) в течение всего доступного диапазона углов.
      7. Измерение интенсивности рассеяния от образца в течение всего доступного угловом диапазоне предпочтительно на нескольких длинах волн. Картинырассеяния нормирована на интенсивность рассеяния вперед известна как форм-фактор.
      8. Если структура частиц, как известно, используют соответствующее выражение модели для расчета глобальной посадки на наборах данных, измеренных на разных длинах волн.
      9. Для использования неизвестной структуры частиц регуляризированной прямой (например, FitIt! 33) или в более общем косвенном обратное преобразование Фурье 21,22 процедуру в сочетании с деконволюции парной функции распределения расстояния (только для сферических частиц) 23,24 для получения приблизительной классификации частиц тип.
      10. В случае фитинга или инверсии рутина дает оценку функции распределения частиц радиуса, вычислить полидисперсностиИндекс (стандартное отклонение распределения, деленной на ее среднее значение).

    3. Отслеживание частиц с помощью широкоугольной флуоресцентной микроскопии

    Примечание: Tracer и матричные частицы 465 ± 7 нм и 405 ± 7 нм гидродинамических радиусов при 20 ° С, соответственно, были использованы для отслеживания частиц.

    1. Базовые приготовления
      1. Готовят концентрированной дисперсии матрицы микрогеля путем повторного диспергирования известное количество немеченого лиофилизированного микрогель к известному количеству бидистиллированной воды. Добавьте небольшой объем меченых трассирующих частиц.
      2. Подтвердите соответствующую концентрацию изотопных индикаторов микрогеля в микроскоп. Оптимальная концентрация представляет собой компромисс между одновременным приобретением максимального количества треков, имея при этом концентрации индикаторного достаточно низко, так что вероятность того, что следы частиц трассирующими крест во время приобретения незначительна.
      3. Приготовьте концентрированных дисперсий путем выпариваниявода в печи. Определить концентрацию веса путем сравнения веса дисперсии к исходной массе образца перед выпариванием.
    2. Сбора и анализа данных
      1. Используйте соответствующий объектив желаемого увеличения и диафрагмы для возбуждения трейсеров и одновременного сбора флуоресценции от образца. В этой работе, использовать 100X / 1.3 NA иммерсионным объектива.
      2. Поместите камеру влаги на в хуг-пьезо таблицу, которая вписывается в коммерческий микроскоп.
      3. Для того, чтобы предотвратить образца от высыхания, поместите плазменную очищено покровного стекла в камеру влаги и пипеткой 10 мкл поли (NIPAM) дисперсии нужной концентрации на скольжении.
      4. В зависимости от возбуждения и излучения флуоресцентного красителя, используйте подходящий лазер для возбуждения и регулировки мощности лазера соответствующим образом. Интенсивность должна быть достаточно низкой, чтобы избежать быстрого фотообесцвечивание красителей, но прив то же время достаточно сильным для точного позиционирования одночастичной (смотри ниже). В этой работе, используют 561 нм с диодной накачкой твердотельный лазер и поддержания постоянной мощности лазера в 16 мВт (приблизительно 0,5 кВт см -2 в образце) для всех измерений.
      5. Для получения однородного образца освещения, используют критическую установку освещения, описанной здесь. Для этого, пара лазер в многомодовом волокне (NA 0,22 ± 0,02, 0,6 мм диаметр сердцевины), встряхните волокно, используя Вортекс для того, чтобы временно усредненной лазерные пятнышки, и проект конец волокна в плоскости образца.
      6. Калибровка расстояния г от заднего отражения покровного стекла и фокус несколько микрометров в образец, перемещая цель немного вверх и зафиксировать Z-позицию, используя Z-компенсатор. Это позволяет избежать каких-либо эффектов интерфейса с покровным.
      7. Настройка параметров детектора, таких как время экспозиции, чтобы сила сигнала флуоресценции. В этом случае используйте камеру EMCCDсо временем экспозиции 0,1 сек, электронный режим и коэффициент усиления 50 умножения.
      8. Приобретите несколько фильмов с соответствующим количеством кадров, чтобы получить достаточное количество времени задержки для вычисления среднего квадрата смещения микрогелей в различных областях образца. В этой работе, используют номера кадров приобретения 500 или 1000 кадров.
      9. Анализ данных путем размещения частиц в каждом кадре с помощью Gaussian фитинг 25 и использовать соответствующий алгоритм отслеживания частиц 26 , чтобы получить средний квадрат смещения. 27 Вычислить средние значения и стандартное отклонение путем усреднения по всем следам во всех фильмах. Вычислить длинные коэффициенты диффузии времени запаздывания с помощью линейной регрессии с уравнение 19 , где уравнение 20 это средний квадрат смещения, D означает среднюю величину коэффициента диффузии и т временной лаг.
      10. Стандартное восточное времяImate параметр аномалии у из аномального уравнения диффузии уравнение 21 путем преобразования данных в логарифмическом масштабе, что дает уравнение 22 , Параметр аномалия уравнение 23 дается производной от сюжета. Производное может быть оценена с помощью конечных разностей точек данных, или подгонки точек данных с помощью полиномиальных функций и дифференцирования аналитически. Определить достаточную степень полиномиальных функций подгонки путем построения графика уложения остатков и остаточную норму для увеличения полиномиальное порядка.
      11. Повторите ту же процедуру для различных концентраций матриц микрогеля.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Число частиц PNIPAM микрогеля в пакете, и , таким образом , чтобы конечный объем частиц, определяется в начале реакции в течение Гидрофобный methacryloxyethyl красителя со-мономер фаза зарождение 20 тиокарбамоильная родамин влияет на зарождение за счет уменьшения плотности числа частиц в партии. Уменьшение концентрации частиц для двух различных начальных концентраций NIPAM можно рассматривать как увеличение среднего конечного объема частиц в свернутом состоянии с концентрацией увеличением красителя, показано на рисунке 1. Увеличение объема может быть связано с гидрофобного сомономера краситель, способствует агрегации ядер микрогеля на ранних временах реакции, уменьшая концентрацию частиц и увеличение конечного объема частиц.

Результаты успешных DLS проводились измеренияTS показаны на рисунке 2. Для шести маленьких конечного объема частиц партий линейной зависимости скорости затухания среднего Г 2 на Q 2 и нулевой у-перехват в пределах погрешности показывают , что распределение частиц по размерам для этих партий являются относительно узкими и хорошо -определено оценка средней коэффициента диффузии можно получить из наклона линейной аппроксимацией. на фиг.3 показан более сложный результат двух самых крупных партий томов, где Γ 2 отклоняется от линейного поведения в промежуточном диапазоне д. Нелинейность берет свое начало от форм - фактора (угловая картина рассеяния) минимума , который совпадает с этим д значений. 28 данного явления можно наблюдать для частиц с размерами , сравнимыми с длиной волны падающего лазерного излучения и даже умеренное распределение частиц по размерам ширина. Определение коэффициента диффузии в этом д показанной на фиг.3, Γ 2 отражает среднее поведение снова при высокой добротностью, где все фракции по крупности частиц способствуют более равномерно по полной рассеянной интенсивности. Несложный способ получить разумную оценку для среднего коэффициента диффузии является исключение промежуточных значений Γ 2 из линейной аппроксимации. Если форм - фактор частиц известны, более сложный фитинга метод может быть использован 28.

Определение гидродинамического объема в свернутом состоянии, не давая образцы остыть ниже PNIPAM VPTT гарантирует, что негелеобразные золь фракция не отделяется от частиц. Поэтому объем в свернутом состоянии отражает массу и число частиц в процессе полимеризации, что очень важно, если ФундаментСИХИЧЕСКОЕ свойства полимеризации осадков исследуются 20. Объем в свернутом состоянии, также обеспечивает хорошее количество для сравнения различных параметров реакции, так как он не зависит от разбухания и фракции негелеобразные полимер в частицах, регулируемым количеством сшивающего агента в смеси мономеров. Меньший размер и выше контраст рассеяния в свернутом состоянии также облегчить DLS характеристику.

Данные статического рассеяния света , измеренные на двух длинах волн 642 нм и 404 нм для матричных и трассирующих частиц показаны на рисунке 4 Визуальный осмотр угловых диаграмм рассеяния показывает , что частицы хорошо определены:. Множественные отличившихся колебания , характерные для сферических частиц по всему добротность указывает на узкую полидисперсность, в данном случае 7% и 6% для индикаторных и матричных микрогелями соответственно. Гладкая бehavior при низкой добротностью указывает на то, что образцы достаточно разбавленным и агрегация частиц существенным не присутствует. Увеличение интенсивности рассеянного при экстремальных д может быть связано с рассеянием из - за спины отраженного луча от внутренней стенки кювет. Инверсия формфакторов частиц матрицы подтверждают типичную структуру микрогеля 29 с плотным ядром и радиально разлагающийся профиля плотности в результате кинетики сополимеризации кросс-линкера 30 (см врезку). Пунктирная линия показывает форм-фактор эталонной твердой сферы с тем же средним радиусом гирацией как частиц матрицы. Экспериментальная форм - фактор убывает быстрее , чем с д жесткого форм - факторе сферы, что характерно для частиц с нечеткой поверхности. В противоположность этому, маркерные частицы проявляют нестандартную структуру микрогеля. Это может быть также видно из опорного жесткого форм-факторе сфера, которая показывает, что экспериментальный форм-фактор изначально нераспадаются быстрее, чем ссылки. Этот результат показывает, что включающие молекулы красителя к микрогелей может повлиять на их структуру, которая должна быть объяснено в интерпретации результатов.

Высокая однородность синтезированных частиц представляет большой интерес для изучения их диффузии при объемных долей вокруг температуры стеклования для того , чтобы точно определить поведение эволюции в этом режиме 13, и сравнить его с твердыми частицами 31. Таким образом, низкая доля меченых микрогелей были смешаны с немеченого микрогель сопоставимого размера. Возбуждение и спектры испускания микрогеля внедренной молекул красителя наряду с длиной волны возбуждения и конфигурации фильтра , используемого в пути излучения представлены на рисунке 5. Абсорбция и максимумов эмиссии methacryloxyethyl тиокарбамоильная родамина B близки к длине волны возбуждения и диапазона сбора флуоресценции,соответственно, обеспечивает высокую эффективность сбора в настройки отслеживания частиц. Эволюция во времени среднего квадрата смещения для трассирующих микрогелей в различных концентрациях матрицы не меченных микрогеля показаны на рисунке 6 и рисунке 7 в линейном и логарифмическом масштабе, соответственно. При низких концентрациях матричных микрогеля частицы трассирующими быстро диффундируют. Несмотря на то, что они видны только для ограниченного числа кадров, прежде чем перейти из фокальной плоскости, достаточно хороший оценка их среднеквадратичных смещений возможно. Линейное увеличение среднего квадрата смещения со временем указывает на нормальное поведение диффузии для всех времен запаздывания измеряется. Тем не менее, для микрогеля концентрациях , близких к коллоидной стеклования, т.е. 29-36 мг / мл, временная эволюция среднеквадратичных смещений становится нелинейной (см рисунок 7). Поведение напоминает один из коллоидных микронного размера частиц ПММА как по алфавиту с концаribed неделями и Вайц 31 и может быть связано с эффектом клетки. Как схематично показано на фиг.10, меченое микрогель в плотной матрице может диффундировать довольно свободно внутри клетки. По этой причине средний квадрат смещения линейно возрастает в течение первых нескольких миллисекунд. Однако, поскольку частицы улавливаются в переходных клетках, образованных их соседей, коллективный перегруппировка окружающих микрогелями необходимо для микрогели, чтобы двигаться дальше. Эта клетка эффект выражается в довольно пологий склон во втором диапазоне рисунке 7, а также может быть подтверждена путем проверки следов частиц на рисунке 9. При коротком времени запаздывания частицы покачивания в своих клетках, из которых они смогут избежать только , чтобы получить в ловушке снова. При больших временах запаздывания, линейное поведение диффузии восстанавливается. Эффекты Кейдж могут быть проанализированы с помощью аномальных модели диффузии, где ВременнaÂя эволюция (двумерным обнаружен) средний квадрат дisplacement выражается степенным законом во времени: уравнение 24 или в логарифмической форме уравнение 25 с параметром аномалии уравнение 26 32. Для нормальной диффузии, параметр аномалии равен 1, субдиффузия представлена ​​значениями ниже 1. Рисунок 8 представляет временную эволюцию параметра аномалии непосредственно определяется из наклона в лог-лог-участок на рисунке 7. Для более низких концентраций микрогели в нашем исследовании, параметр аномалии в основном равен 1. для времени запаздывания уравнение 27 в диапазоне от нескольких секунд, то коэффициент отклоняется от 1 в сторону более низких значений. Такое поведение является искажением из-за того, что осевая (Z-) диапазон наблюдения в широком поле микроскопии ограничивается лишь несколько микрометров. Узкая z-Диапазон смещает анализ для быстрой диффузии через большие промежутки времени для быстро диффундирующих трассеры при низких концентрациях матрицы. При увеличении концентрации микрогеля, мы находим, что минимум параметра аномалии становится гораздо более выраженным и переход к нормальной диффузии ( уравнение 28 ) Появляется позже. Это ясно указывает на эффект клетки появляются для плотных систем микрогели при приближении режима их стеклования.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Одно объем частиц в сжатом состоянии с концентрацией исходной красителя в партии были использованы два различных начальных концентраций NIPAM, 57,5 ммоль дм -3 (черные кружки) и 28,8 ммоль дм -3 (серые прямоугольники). использовали 1% мольных сшивающего агента. Исходная концентрация КПС была одинаковой во всех летучих мышейчес на 1,56 ммоль дм -3. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рисунок 2: скорость затухания с квадратом вектора рассеяния величины для четырех наименьших объем микрогеля партий линейная зависимость. уравнение 29 на Q 2 и нулевой перехватом указывают узкое распределение частиц по размерам и указывает на то, что хорошо определена оценка среднего коэффициента диффузии можно рассчитать по наклону линейной аппроксимацией. Концентрации NIPAM были 57,5 ммоль дм -3 (красные квадраты и оранжевые перевернутые треугольники) и 28,8 ммоль дм -3 (остальные символы). Концентрации красителя 0,044 ммоль dм -3 (красные квадраты), 0,022 ммоль дм -3 (оранжевые перевернутые треугольники), 0,088 ммоль дм 3 (зеленые треугольники), 0,066 ммоль дм -3 (Cyan ромбы), 0,044 ммоль дм -3 (темно - синие треугольники), и 0,022 ммоль дм -3 (розовые кружки). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рис . 3: Распад скорости с квадратом вектора рассеяния величины для двух самых крупных партий объема Нелинейная поведение Г 2 с Q 2 в центральном диапазоне д обусловлена ​​изменениями в интенсивности взвешивания сигнала по разным фракциям в непосредственной близости от форм-фактора минимума. Концентрация NIPAM в обеих партиях были 57,5 ​​ммоль дм-3, Концентрации красителя были 0,088 ммоль дм -3 (черные кружки) и 0,066 ммоль дм -3 (красные треугольники). Увядшие символы были исключены из линейной аппроксимации. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рисунок 4: Форм - факторы меченого трассирующими и немеченых частиц матрицы Для обеих частиц форм - фактор был измерен на двух длинах волн, 642 нм (светлые точки синего и красного данных) и 404 нм (зеленый и темно - синих точек данных).. Сплошные линии являются глобальными припадки к 642 нм и 404 нм наборов данных. Пунктирные линии показывают коэффициенты формы твердых частиц опорной сферы с тем же радиусы инерции в качестве матрицы и трассирующих частиц (оранжевый и зеленый пунктирными линиями, соответственно.) Врезках нормализованное частицупрофили плотности от ядра к поверхности , рассчитанной, например, FitIt! Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5
Рис . 5: Возбуждение и спектры испускания флуоресценции маркированы частиц микрогеля Синяя линия обозначает спектр излучения возбуждения и красной линии. Сплошная вертикальная линия длина волны возбуждения. Затененная область обозначает сбор флуоресценции в диапазоне длин волн. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Среднеквадратичное DISPlacement со временем запаздывания для частиц трассера. концентрации микрогеля Немеченому матрикса были 15,56 мг / мл (слева), 22,05 мг / мл, 28,28 мг / мл, 28,67 мг / мл, 30,32 мг / мл, 31,13 мг / мл и 35,35 мг / мл. Точки и Столбики ошибок обозначают экспериментальные значения и стандартное отклонение, соответственно. Сплошные линии являются линейными подгонку к точкам данных. Врезка показывает широкий поля флуоресценции микрофотографии меченых микрогелей на 35,35 мг / мл концентрации матрицы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 7
Рис . 7: средний квадрат смещения со временем запаздывания для трассирующих частиц в логарифмической шкале концентрации микрогеля Немеченому матрицы были 15,56 мг / мл (слева), 22,05 мг / мл, 28,28 мг / мл, 28,67 мг / мл, 30,32 мг / мл, 31,13 мг / мл и 35,3 5 мг / мл. Точки и Столбики ошибок обозначают экспериментальные значения и стандартное отклонение, соответственно. Сплошные линии являются полиномиальными подгонку к точкам данных. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 8
Рис . 8: Параметры Аномалия со временем запаздывания для трассирующих частиц концентрации микрогеля Немеченому матрицы были 15,56 мг / мл (слева), 22,05 мг / мл, 28,28 мг / мл, 28,67 мг / мл, 30,32 мг / мл, 31,13 мг / мл и 35,35 мг / мл. Очки представляют собой производные , оцениваемые конечных разностей и сплошными линиями аналитически вычисленных производных от полинома припадков на рисунке 7. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

e_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 "> Рисунок 9
Рисунок 9:.. Треков частиц для 12 трассирующих микрогелями в дисперсии с 35,35 мг / мл концентрации матрицы кластеризация треков в отличительных результатов BLOBS из частиц векторизации будучи захваченными в переходных клетках , образованных их немеченых соседей Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию эта фигура.

Рисунок 10
Рис . 10: Схематическое изображение диффузии меченых микрогелевого в концентрированной немаркированной дисперсии матрицы микрогелевого Красная траектория означает быстрое распространение трейсеров в пределах переходных клеток (синяя пунктирная линия) , образованный соседними частицами. Синий траектория означает длинный лаг тименя диффузия включена коллективным перегруппировки переходных клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 11
Рис . 11: Длинные коэффициенты диффузии временной лаг с немаркированной концентрации матрицы микрогелевого При низкой концентрации матрицы диффузия меченых микрогелями не зависит от частиц матрицы. С увеличением концентрации матрицы микрогеля диффузии долгое время замедляет порядков , так как диффузия требует коллективных перегруппировку переходных клеток, где запертых трассеры. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Добавление небольших количеств функционального сомономера может оказывать значительное влияние на размер частиц и структуры PNIPAM полученных микрогелей. Полимеризация пробирка Одновременная мелкосерийное является хорошим методом для учета таких изменений, а также помогает быстро находить нужные композиции реагентов для целевого размера частиц для масштабировании реакции по мере необходимости. Масса частиц приблизительно экспоненциально зависит от температуры полимеризации , когда термического разложения инициатора, такого как КПС, используется 20, и , следовательно , нужно установить стабильный и точный контроль температуры внутри реактора для хорошей воспроизводимостью. Конечные объемы частиц с обычной загрузкой реакции и не перемешиваемой реакции, как правило, хорошо согласуются, если один минимизирует пакетный синтез связанных возмущений, таких как слишком сильным перемешиванием реакционной смеси в эвиз аппарата температурные градиенты в большом реакторе, или с использованием избыточного количества раствора инициатора так, чтобы изменения температуры реакции в течение периода инициации.

Динамическое рассеяние света является устоявшейся и быстрый метод для определения поведения диффузии большого числа частиц на месте. Существенно, однако, для получения данных под разными углами рассеяния. Измерения DLS на одном произвольном угле, совпадающий с форм-фактором минимума или в случае широкого гранулометрического состава, приведет к явному коэффициент диффузии существенно отличающиеся от среднего коэффициента диффузии образца. Такие случаи могут быть признаны из нелинейного поведения в Г 2 против Q 2 участка. Для решения распределения широких или мультимодальные размеров частиц, можно попытаться использовать алгоритм преобразования Лапласа обратное , такие как CONTIN 34. DLS, однако, не идеально подходит для этой цели из-за плохообусловленной физЮр проблемы обращения.

Для обоих динамического и статического рассеяния света образцы должны быть достаточно разводили, чтобы избежать многократного рассеяния, которое аннулирует анализ обычных данных. Для определения форм-фактора по СЛС также разность показателей преломления частиц и растворителя должно быть низким, чтобы избежать рассеяния Ми, что предотвращает непосредственный анализ форм-фактор. Это условие выполняется, когда уравнение 30 , где уравнение 31 это средний радиус частиц и уравнение 32 разница между показателями преломления растворителя и частиц. Для получения микрогелей широко опухших растворителем этот критерий выполняется, но в общем случае частицы должны быть контрастными согласованы с достаточно высоким показателем преломления растворителя. Mie рассеяние может быть распознан с размытием тон Форм-фактор минимумами, эффект, который уменьшается, когда разность показателей преломления уменьшается.

Световые методы рассеяния обеспечивают ансамбль усредненной информации, в то время как отслеживание частиц широкого поля можно использовать для исследования поведения диффузии одиночных частиц в реальном пространстве. В отличие от отслеживания частиц на основе рассеяния света, высокая чувствительность флуоресценции позволяет отслеживать мелких частиц и, в крайнем случае, даже отдельные молекулы. Кроме того, соотношение меченых и немеченого частиц могут быть приспособлены для точного измерения также в высококонцентрированных растворах. Поэтому отслеживание частиц обеспечивает модель свободный способ определения коэффициента диффузии и диффузии режим коллоидов на месте даже с учетом сопоставления между поведением одиночных частиц. Точность локализации отдельных индикаторов, как правило, лучше, чем дифракционный предел, но зависит от сигнала к шуму отношения флуоресценции сигнал одиночных частиц на установке широкого поля. Таким образом, маркировка с красителями, которые демонстрируют высокий квантовый выход, хороший фотостабильностью и максимум поглощения, близкую к длине волны возбуждения является необходимым условием для получения хороших результатов. концентрации индикаторного должна быть поддерживать на низком уровне, чтобы минимизировать пересечения траекторий различных частиц, нарушающих алгоритм отслеживания. Для получения концентрированных дисперсий, плотность флуоресцентных трассеров можно регулировать путем смешивания меченных и не меченных частиц. Последние работы по функции рассеяния точки инженерии позволяет 3D частицы отслеживания 35,36, который может быть использован для изучения анизотропной диффузии в различных направлениях пространства.

Таким образом, точная характеристика DLS и полимеризация мелкосерийное пробирка обеспечивают надежную основу для высокой точности настройки микрогелевого конечного объема частиц. Методы рассеивание света и отслеживания флуоресценции частиц обеспечивают дополнительную информацию по ансамблю иповедению диффузии частиц в широком диапазоне концентраций дисперсии. Сочетание синтеза четко определенных мягких частиц с возможностью отслеживать их в растворах различной концентрации будет иметь важное значение для исследования динамики систем мягких частиц и сравнение с хорошо изученных твердых коллоидных систем.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetone VWR Chemicals KRAF13455
Bisacrylamid AppliChem A3636
n-Hexane Merck 104374
N-Isopropylacrylamide Fisher Scientific AC412785000 recrystallized from n-hexane
Methacryloxyethyl thiocarbamoyl rhodamine B Polysciences 23591
Potassium peroxodisulfate Merck 105091
Silicone oil 47 V 350 VWR Chemicals 83851
Toluene Sigma Aldrich 244511
F12 Refrigerated/heating circulator Julabo 9116612
Microscope Olympus IX83
XY(Z) Piezo System Physik Instrumente P-545.3R7
100X Oil immersion objective Olympus UPLSAPO
QuadLine Beamsplitter AHF Analysentechnik F68-556T
Cobolt Jive 150 laser Cobolt 0561-04-01-0150-300
Multimode Fiber Thorlabs UM22-600
iXON Ultra 897 EMCCD camera Andor DU-897U-CS0-BV
Laser goniometer SLS Systemtechnik Mark III
CF40 Cryo-compact circulator Julabo 9400340
Laser goniometer system  ALV GmbH ALV / CGS-8F
Multi-tau corretator ALV GmbH ALV-7004
Light scattering electronics ALV GmbH ALV / LSE 5004
Photon counting module PerkinElmer SPCM-CD2969 2 units in pseudo cross-correlation mode
633 nm HeNe Laser JDS Uniphase 1145P
F32 Refrigerated/heating circulator Julabo 9312632

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelton, R. Temperature-sensitive aqueous microgels. Adv. Colloid Interfac. 85, 1-33 (2000).
  2. Pich, A., Richtering, W. Microgels by Precipitation Polymerization: Synthesis, Characterization and Functionalization. Adv. Polym. Sci. 234, 1-37 (2010).
  3. Richtering, W. Responsive Emulsions Stabilized by Stimuli-Sensitive Microgels: Emulsions with Special Non-Pickering Properties. Langmuir. 28 (50), 17218-17229 (2012).
  4. Wiese, S., Spiess, A. C., Richtering, W. Microgel-Stabilized Smart Emulsions for Biocatalysis. Angew. Chem. Int. Edit. 52 (2), 576-579 (2012).
  5. Schmitt, V., Ravaine, V. Surface compaction versus stretching in Pickering emulsions stabilised by microgels. Curr. Opin. Colloid In. 18 (6), 532-541 (2013).
  6. Wellert, S., Richter, M., Hellweg, T., von Klitzing,, R,, Hertle, Y. Responsive Microgels at Surfaces and Interfaces. Z. Phys. Chem. 229 (7-8), 1-26 (2015).
  7. Li, Z., Harbottle, D., Pensini, E., Ngai, T., Richtering, W., Xu, Z. Fundamental Study of Emulsions Stabilized by Soft and Rigid Particles. Langmuir. 31 (23), 6282-6288 (2015).
  8. Deshmukh, O. S., van den Ende, D., Stuart, M. C., Mugele, F., Duits, M. H. G. Hard and soft colloids at fluid interfaces: Adsorption, interactions, assembly & rheology. Adv. Colloid Interfac. 222, 215-227 (2015).
  9. Serpe, M. J., Kim, J., Lyon, L. A. Colloidal Hydrogel Microlenses. Adv. Mater. 16 (2), 184-187 (2004).
  10. Schmidt, S., Zeiser, M., Hellweg, T., Duschl, C., Fery, A., Möhwald, H. Adhesion and Mechanical Properties of PNIPAM Microgel Films and Their Potential Use as Switchable Cell Culture Substrates. Adv. Func. Mater. 20 (19), 3235-3243 (2010).
  11. Xia, Y., He, X., et al. Thermoresponsive Microgel Films for Harvesting Cells and Cell Sheets. Biomacromolecules. 14 (10), 3615-3625 (2013).
  12. Guan, Y., Zhang, Y. PNIPAM microgels for biomedical applications: from dispersed particles to 3D assemblies. Soft Matter. 7 (14), 6375 (2011).
  13. Yunker, P. J., Chen, K., Gratale, M. D., Lohr, M. A., Still, T., Yodh, A. G. Physics in ordered and disordered colloidal matter composed of poly(N-isopropylacrylamide) microgel particles. Rep. Prog. Phys. 77 (5), 056601-056629 (2014).
  14. Lohr, M. A., Still, T., et al. Vibrational and structural signatures of the crossover between dense glassy and sparse gel-like attractive colloidal packings. Phys. Rev. E. 90 (6), 062305 (2014).
  15. Dreyfus, R., Xu, Y., Still, T., Hough, L. A., Yodh, A. G., Torquato, S. Diagnosing hyperuniformity in two-dimensional, disordered, jammed packings of soft spheres. Phys. Rev. E. 91 (1), 012302-012312 (2015).
  16. Kojima, H., Tanaka, F. Reentrant volume phase transition of cross-linked poly(N-isopropylacrylamide) gels in mixed solvents of water/methanol. Soft Matter. 8 (10), 3010-3011 (2012).
  17. Hofmann, C. H., Plamper, F. A., Scherzinger, C., Hietala, S., Richtering, W. Cononsolvency Revisited: Solvent Entrapment by N-Isopropylacrylamide and N, N-Diethylacrylamide Microgels in Different Water/Methanol Mixtures. Macromolecules. 46 (2), 523-532 (2013).
  18. Bischofberger, I., Calzolari, D. C. E., Trappe, V. Co-nonsolvency of PNiPAM at the transition between solvation mechanisms. Soft Matter. 10 (41), 8288-8295 (2014).
  19. Virtanen, O. L. J., Richtering, W. Kinetics and particle size control in non-stirred precipitation polymerization of N-isopropylacrylamide. Colloid Polym. Sci. 292 (8), 1743-1756 (2014).
  20. Virtanen, O. L. J., Ala-Mutka, H. M., Richtering, W. Can the Reaction Mechanism of Radical Solution Polymerization Explain the Microgel Final Particle Volume in Precipitation Polymerization of N-Isopropylacrylamide? Macromol. Chem. Phys. 216 (13), 1431-1440 (2015).
  21. Glatter, O. A new method for the evaluation of small-angle scattering data. J. Appl. Crystallogr. 10 (5), 415-421 (1977).
  22. Svergun, D. I. Determination of the regularization parameter in indirect-transform methods using perceptual criteria. J. Appl. Crystallogr. 25 (4), 495-503 (1992).
  23. Glatter, O. Convolution Square Root of Band-Limited Symmetrical Functions and Its Application to Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 14, 101-108 (1981).
  24. Glatter, O., Hainisch, B. Improvements in Real-Space Deconvolution of Small-Angle Scattering Data. J. Appl. Crystallogr. 17, 435-441 (1984).
  25. Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. Quantitative Comparison of Algorithms for Tracking Single Fluorescent Particles. Biophys. J. 81 (4), 2378-2388 (2001).
  26. Wöll, D., Kölbl, C., Stempfle, B., Karrenbauer, A. A novel method for automatic single molecule tracking of blinking molecules at low intensities. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (17), 6196-6205 (2013).
  27. Saxton, M. J., Jacobson, K. Single-particle tracking: Applications to membrane dynamics. Annu. Rev. Bioph. Biom. 26, 373-399 (1997).
  28. Pusey, P. N., van Megen, W. Detection of small polydispersities by photon correlation spectroscopy. J. Chem. Phys. 80 (8), 3513 (1984).
  29. Stieger, M., Pedersen, J. S., Richtering, W., Lindner, P. Small-angle neutron scattering study of structural changes in temperature sensitive microgel colloids. J. Chem. Phys. 120 (13), 6197-6206 (2004).
  30. Wu, X., Pelton, R. H., Hamielec, A. E., Woods, D. R., McPhee, W. The kinetics of poly(N-isopropylacrylamide) microgel latex formation. Colloid Polym. Sci. 272, 467-477 (1994).
  31. Weeks, E. R., Weitz, D. A. Subdiffusion and the cage effect studied near the colloidal glass transition. Chem. Phys. 284 (1-2), 361-367 (2002).
  32. Ernst, D., Köhler, J., Weiss, M. Probing the type of anomalous diffusion with single-particle tracking. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (17), 7686-7691 (2014).
  33. Virtanen, O. L. J. FitIt! (Version 1.1.4). , Available from: https://www.github.com/ovirtanen/fitit (2015).
  34. Provencher, S. W. A Constrained Regularization Method For Inverting Data Represented By A Linear Algebraic or Integral Equations. Comput. Phys. Commun. 27 (3), 213-227 (1982).
  35. Holtzer, L., Meckel, T., Schmidt, T. Nanometric three-dimensional tracking of individual quantum dots in cells. Appl. Phys. Lett. 90 (5), 053902-053904 (2007).
  36. Diezmann, A. V., Lee, M. Y., Lew, M. D., Moerner, W. E. Correcting field-dependent aberrations with nanoscale accuracy in three-dimensional single-molecule localization microscopy. Optica. 2 (11), 985-989 (2015).
  37. Neutrons, X-rays and Light: Scattering Methods Applied to Soft Condensed Matter. Lindner, P., Zemb, T. , North Holland Delta Series. Amsterdam. (2002).

Tags

Химия выпуск 115 поли (N-изопропилакриламид) полимеризация осадков флуоресцентная маркировка микрогели рассеяние света отслеживание частиц флуоресцентная микроскопия
Контролируемый синтез и флуоресценция отслеживание высокой однородности поли (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) Микрогели
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Virtanen, O. L. J., Purohit, A.,… More

Virtanen, O. L. J., Purohit, A., Brugnoni, M., Wöll, D., Richtering, W. Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels. J. Vis. Exp. (115), e54419, doi:10.3791/54419 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter