여기에서 우리는 이전에 설명한 시스템 개선 한 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)의 AAVS1 궤적에 RMCE에 따라 신속하고 효율적인 유전자 편집 방법을보고합니다. 이 기술을 이용하여, 동질 라인 신속하고 안정적으로 형질 전환 hPSCs 매개 연구를 용이하게 적절한 비교 연구를 위해 생성 될 수있다.
심지어 CRISPR-Cas9, 인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)의 유전자 변형에 의해 주도 유전자 타겟팅 기술의 혁명 아직 시간이 소요됩니다. 더 신속하고 오프 대상 효과에 덜 경향이있다 Cre 호텔 또는 FLPe 같은 사이트 별 대상 콤비 네이즈를 사용하는 방법, 혜택을 누릴 수있는 안전한 항구의 궤적에 통합 유전자와 재조합 선을 사용하여 비교 연구. 그들은 훨씬 뛰어나다 유전자의 대부분의 측면에 타겟팅하지 않지만 이러한 방법이 설명되었다. 아연 핑거 뉴 클레아 제를 사용하여, 우리는 이전에 이형 FRT 시퀀스에 의해 형벌 카세트를 표현하는 GFP – 하이 그로 마이신 – TK를 포함 hPSCs의 AAVS1 궤적에서 마스터 세포주를 만들었습니다. 여기, 우리는이 줄을 사용 FLPe 재조합 효소 중재 카세트 교환 (RMCE)을 수행하는 절차를 설명합니다. 마스터 C엘 라인은 promoterless 퓨로 마이신 저항을 포함하고 FLPe의 재조합 효소와 RMCE 기증자 벡터로 형질된다. 모두 (퓨로 마이신) 양극과 음극 (FIAU) 선택 프로그램의 응용 프로그램은 임의의 통합없이 RMCE의 선택으로 이어집니다. RMCE 100 % 효율 (15) 라 완전히 특성화 된 다 능성 클론 유전자 변형 라인을 생성합니다. (가) 최근 AAVS1 궤적의 한계를 설명에도 불구하고, 시스템의 용이성, 동종 설정에서 hPSC의 형질 전환을위한 길을 열어 비교 연구에 필요한, 그리고 그 다른 것 기능 분석의 이익 / 손실을 반 높은 처리량 유전자 화면을 수 매우 많은 시간이 소요될 수.
표적 유전자 재조합 연구의 많은 분야에서 빠른 발전을 촉진했다. 마우스에서, 게놈 편집 및 줄기 세포 연구의 시너지 효과는 유전자 기능과 유전자 조절의 복잡한 메커니즘의 증가 이해를 허용했다. 몇 년 동안, 인간 배아 줄기 세포의 제 1 격리 (hESCs는) 및 유도 후에 인간 때문에 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 유전자 편집 기술적 장애물을 구성했지만 진척은 물론 인간 다 능성 줄기 세포 (hPSCs)에서 예상 . 대상 클레아 제 – 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs), 전사 활성제와 같은 이펙터 뉴 클레아 제 (TALEN), 또는를 사용하여 게놈 엔지니어링의 최근 발전 클러스터 정기적으로 팔린 드롬 반복이 / CRISPR 관련 단백질 9 (CRISPR / Cas9는) 우리가 이것들을 극복 할 수있는 짧은 interspaced 3 – 어려움, 효율적인 프로세스를 재조합 1을 대상으로 만들기.
제 m에서 특정 유전자좌Rosa26, Hprt1 또는 Col1A1 같은 부작용의 부재하에, 안정 신뢰성 유비쿼터스 도입 유전자의 발현을 허용 여러개의 게놈 유전자의 연구 성과에 필수적인 도구가되었다. 안전 항구의 궤적은 동종 상황에서 쥐의 다른 라인 사이의 비교 분석을 할 수 있습니다. 이것은 삽입 성 돌연변이 유발, 용량 의존적 효과 또는 잡 트랜스 식 등 공지의 한계와 연관된 표준 랜덤 통합 방법을 이용하여 달성 될 수 없다. 면책 궤적에 유전자 편집 용이성과 유연성은 구체적으로 (각각에 loxP 또는 FRT) 표적 서열을 인식하고 동일한 대상 사이의 효율적인 재결합을 촉진 Cre 호텔 또는 Flippase (FLPe) 같은 사이트 별 대상 콤비 네이즈의 사용을 통해 증가된다. 때문에 이러한 특성에 사전 통합 면책 궤적에에 loxP 또는 FRT 시퀀스를 사용하여 재조합 효소 매개 유전자 편집 트랜스 마우스에 사용되는 일반적인 도구입니다창세기. 카세트 삽입하거나 동일한 표적 서열 사이에 매개 절단 이외에 호환성은 loxP 또는 FRT 부위를 사용하는 재조합 효소 매개 카세트 교환 (RMCE) (4)을 허용한다.
인간에서 안전한 항구의 궤적이 수행 된 식별을 시도합니다. 마우스 orthologous HPRT는 손실의 기능 Lesch – 니한 증후군, 및 ROSA26와의 연결에도 불구하고이 hPSCs의 대상이되고있다. HPRT 빠르게 ROSA26처럼, ESC에 유전자 발현을 침묵하고보고에서 유전자 발현을 유지하는 능력 7 – 말기 분화 세포는 5 조사되지 않았다. CCR5 유전자의 동형 접합 널 돌연변이가 아니라 인간에 허용 될 것으로 보여, 안전한 항구로 그 값은. 평가 하였다 CCR5는 목표와는 ESC 8,9 등 다양한 인간의 세포 라인에서 안정적으로 유전자 발현을 유지하는 것으로보고되었다. 하나,후자는 장기 배양 동안 클론 수준에서 입증되지 않았으며 유비쿼터스 유전자 발현은 세 가지 배엽의 분화 된 자손에서 증명되지 않았다. AAVS1, 아데노 관련 바이러스 타입 2 (AAV)의 자연 통합 사이트를 시험 하였다 형질 전환 유전자로 인해보고 된 저항뿐만 아니라 hESCs는, 10를 침묵. 이후, 많은 그룹은 시험 관내 및 생체 내 모두에서 2,8,11,12 상기 AAVS1 궤적을 사용 미분화 hPSCs 안정한 유전자의 발현뿐만 아니라, 모든 세 배엽들의 차별화 된 자손을 설명했다. AAVS1 궤적이 미분화 hESCs는 및 간세포 자손 13 체외에서 변수 유전자 억제를 발휘하는 것으로 확인되면서 최근 결과는 그럼에도 불구하고, 이러한 연구 결과를 뉘앙스.
임의의 통합 접근법과 방법을 사용하여 추가 검사 연구는 제노을 찾을 목적으로 단일 복사본 통합을 결정하는hPSCs 확장 및 분화 14,15 동안 유전자 사일런 싱에 강한 MIC 통합 사이트. 전반적으로, 지금까지 아무 게놈 사이트는 완전히 hPSCs과 그 자손에서 안전한 항구로 검증되지 않은; 유비쿼터스 안정적인 형질 전환 유전자 발현, hPSCs에서뿐만 아니라 생체 외 및 생체 내에서의 차별화 된 자손에서뿐만 아니라 적절한 사이트의 식별, 해결해야 할 남아있다. 모든 연구 궤적 중과 한계에도 불구하고, AAVS1 남아 가장 특징 및 줄기 세포 연구에 가장 많이 사용.
RMCE 성공적 FLPe Cre 호텔은 17보다 효율적이다 지시가있는 경우에도, 대부분 Cre 호텔 재조합 효소를 사용하여,이 유전자좌 6,7,14,16의 일부 hPSCs에서 수행되었다. 이러한 모든 경우에서, 하나의 양의 약물 내성 카세트 재조합 콜로니의 선택을 위해 사용되었다. 성공하지만, 이러한 절차는 표준 발생원을 통해 기술 진보를 구성하지 않는다ZFNs를 사용하여 편집 절차, TALENs 또는 CRISPR / Cas9는 같은 단일 항생제 선택 절차는 임의의 통합을 배제하고 올바르게 대상으로 클론을 식별하기 위해 식민지 검사를 필요로하지 않습니다.
이 절차에서는 방법과 ± 15 일합니다 (사전 통합 카세트 내에) 클론 성 형질 전환 라인의 생성을 허용 선택 A (수신 카세트 내) 양의 조합과 음극을 이용하여 AAVS1 궤적에 hPSCs에 RMCE을 수행하도록 설명 100 % 효율 랜덤 통합 이벤트 무료. 따라서,이 방법은 hPSCs 현재 기술 RMCE 기술을 넘어 진행 상황을 나타냅니다.
면책 궤적에 유전자 편집 방법은 hPSCs에 형질 전환을 개발하기 위해 필수적인 도구 남아있다. AAVS1의 면책 문자가 최근 일부 응용 프로그램 13,18에 대해 의문을 제기되었지만,이 궤적은 현재 가장 잘 인간 유래 세포주 특징으로 남아있다. hPSCs에서 그 한계의 인식은 신뢰할 수있는 데이터를 얻을 수 있습니다. 따라서 AAVS1 여전히 이득 – 및 기능 상실 연구 또는 내부와 결정된 유전 배경 간의 동종 컨텍스트 요구 요인 유도 / 구성 적 발현, 예를 들면, 유용한 사이트가 될 것으로 예상된다.
AAVS1의 궤적은 ZFNs, TALEN 또는 CRISPR / Cas9 1,2,19를 사용하여 여러 그룹의 대상이되고있다. 이러한 클레아 크게 결정된 유전자좌에 상 동성 재조합의 효율을 증가시킨다. 그러나, 처리는 선별하고 완전히 랜덤 INTEG 프리 올바르게 표적 클론을 특성화배급과 다 능성을 유지하고 (최적화 된 유전자 편집 도구를 사용하여) 3 개월 (그림 3)까지 걸릴 수 있습니다 무결성을 게놈. 마지막 두 개는 오프 – 타겟 클레아 제 활성에 의해 발생 가능한 변이에 의해 발생 될 수있다. 여기서 사용 RMCE 시스템 그러나 특이 적 재조합 효소 표적 서열은 AAVS1 궤적에 사전 통합되면, 두 주에서이 목적을 달성하기 위해 신속하고 효율적인 우아한 방법을 제공한다. 양 / 음 선택과 적절한 선택 프로그램의 사용은 RMCE에 의해 AAVS1 궤적에 유전자 편집의 간소화에 기여하는 주요 요인이다.
새로운 유전자 변형 라인의 유전자형 특성이 크게 (더 클론 선별이 필요하지 않습니다) 감소하고, 오프 대상 클레아 제 활성에 관련된 특성으로 인해 FRTS에 대한 FLPe의 특이성으로 비용 소비 렌더링됩니다. 특성화도를 보여줌으로써 루틴 RMCE 실험에서 감소 될 수있다전체 카세트 교환 및 랜덤 통합 부족이 이미 충분히 PCR (도 2b)에 의해 증명 되었기 때문에 마스터 세포주 (도 2A)에서 GFP 발현의 완전한 손실 및 서던 블랏 13. 양성 / 음성 선별의 사용은 이전 보고서와의 주요 차이점을 구성한다. 이전 AAVS1 다른 궤적에서든 hPSCs RMCE에서 설명한 여러 그룹은 단일 양성 선별 공정을 사용 7,14,16. 콜로니 스크리닝 클론 동등 수준에서 정확한 통합 랜덤 통합의 부재를 증명하기 위하여 수행 될 수 있기 때문 클레아 수행 유전자 편집 위에 중요한 기술적 장점을 구성하지 않는다.
여러 hESC의 / IPSC 라인이 RMCE 시스템의 사용은 각각의 독립적 인 라인의 AAVS1 궤적의 설명 FRT 함유 카세트의 사전 통합이 필요합니다. 그러나, 한 번 생성,그 신속성과 단순성은 가능한 기술적으로 매우 시간이 소모 될 것이다, 그렇지 않으면 그 위에서 언급 한 응용 프로그램에 대한 정의 동종 설정에서 세미 높은 처리량 유전자 화면을 개발 할 수 있습니다. 또한, 모든 RMCE 벡터는 ZFNs 함께 궤적을 타겟팅하는데 사용되는 PZ AAVS1 유전자 타겟팅 벡터 내에 구성되어 있지만 TALENs 또는 CRISPR / Cas9도보고되었다. RMCE 벡터의 이중성은 또는 FRT없이 hPSCs의 결정 형질 전환 유전자에 대한 여러 줄을 생성하는 것이 매우 유용하다. 예를 들어, 하나의 히트 이상적 결과를 확인하기 위해 여러 hPSC 라인에서 테스트 될 필요 RMCE 의해 수행 결정된 유전 화면 성공적 보였다. 다중 마스터 RMCE-적합한 세포주의 부재에서, 뉴 클레아 제를 이용하여 조회 대상의 직접적인 유전자가 수행 될 수있다. RMCE 벡터의 이중 성격의 유틸리티는 우리 그룹 (20)에 의해 입증되었습니다. 이 연구에서 유전자 보정 환자 유래 행했다측두엽 치매 (FTD) PROGRANULIN (PGRN) 식 결핍을 일으키는 돌연변이를 부담 iPSCs. PGRN 수준을 회복 카세트의 AAVS1 궤적에 ZFNs 매개 삽입에 의한 유전자 보완은 돌연변이의 존재와 관련된 corticogenesis의 결함 표현형을 수정했습니다. 또한, 비교 선 PGRN 외인성 발현 제어로서 사용되는 WT의 hESCs는 RMCE에 의해 생성 하였다.
재조합 콜로니 없으면, RMCE 공여체 벡터의 형질 감염 효율을 확인한다. 30 % 우수한 형질 전환 효율은 상기 나타낸 결과를 얻었다. 낮은 형질 감염 효율, 재결합 효율을 감소시킨다. 마지막 RMCE 시스템은 AAVS1 궤적 생성되었지만, 다른 어떤 궤적에 적용 가능하다.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |