Nous rapportons ici une méthode d'édition de gène rapide et efficace basée sur CREM dans le locus AAVS1 des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui améliore les systèmes décrits précédemment. En utilisant cette technique, les lignes isogéniques peuvent être rapidement et de manière fiable générés pour des études comparatives appropriées, ce qui facilite la recherche en transgénèse médiée avec hPSCs.
Même avec la révolution des technologies de gènes ciblage dirigé par CRISPR-cas9, la modification génétique des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) est encore temps. Des études comparatives qui utilisent des lignes recombinantes avec des transgènes intégrés dans le port sûr loci pourrait bénéficier d'approches qui utilisent recombinases site-spécifiques ciblées, comme Cre ou FLPe, qui sont plus rapides et moins sujettes à des effets hors-cible. Ces méthodes ont été décrites, mais ils ne le font pas de manière significative le gène surperformer le ciblage dans la plupart des aspects. Utilisation de nucléases à doigt de zinc, nous avons déjà créé une lignée de cellules de maître dans le locus AAVS1 de hPSCs qui contient un GFP-hygromycine-tk exprimant cassette, flanqué par des séquences FRT hétérotypiques. Ici, nous décrivons les procédures pour effectuer FLPe échange de cassette recombinase-médiée (CREM) en utilisant cette ligne. Le maître cligne ell est transfectée avec un vecteur CREM donneur, qui contient un promoteur de résistance puromycine, et avec FLPe recombinase. Application de la fois positif (puromycine) et négatif (CARF) programme de sélection conduit à la sélection de CREM sans intégrations aléatoires. CREM génère des lignées transgéniques polyclonaux pluripotentes entièrement caractérisé en 15 j avec 100% d'efficacité. Malgré la récente décrit les limites du locus AAVS1, la facilité du système ouvre la voie à HPSC transgénèse dans les paramètres isogéniques, est nécessaire pour des études comparatives, et permet des écrans génétiques semi-haut débit pour le gain / perte d'analyse de la fonction qui autrement être très longue.
Ciblée recombinaison du génome a permis des progrès rapides dans de nombreux domaines de recherche. Chez les souris, la synergie entre l'édition du génome et les cellules souches a permis une meilleure compréhension du mécanisme complexe de la fonction des gènes et la régulation des gènes. Ces progrès sont attendus dans les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), ainsi, bien que depuis de nombreuses années depuis le premier isolement de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), et humain plus tard induite par des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), l'édition de gènes a constitué un obstacle technique . Les progrès récents dans l'ingénierie du génome en utilisant nucléases-zinc ciblées Finger nucléases (ZFN), transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talen), ou en cluster régulièrement intercalées courte répétitions palindromiques / CRISPR-associated protein 9 (CRISPR / cas9) nous ont permis de surmonter ces difficultés, ce qui rend la recombinaison un processus efficace ciblés : 1 – 3.
loci spécifiques dans le mouse génome qui permettent stable, fiable et omniprésente expression du transgène en l'absence d'effets indésirables comme Rosa26, HPRT1 ou COL1A1, sont devenus des outils essentiels dans la réalisation d'études génétiques. loci portuaires sécuritaires permettent une analyse comparable entre les différentes lignées de souris dans des contextes isogéniques. Ceci ne peut être réalisé en utilisant des méthodes d'intégration aléatoire standard, qui sont associés à des limites bien connues telles que la mutagenèse insertionnelle, les effets dépendants de la dose, ou l'expression du transgène bigarrée. Gene montage facilité et la flexibilité dans le port sûr loci est augmenté par l'utilisation de recombinases site-spécifiques ciblés comme Cre ou flippase (FLPe), qui reconnaissent spécifiquement des séquences cibles (loxP ou FRT, respectivement) et catalysent la recombinaison efficace entre des objectifs identiques. En raison de ces caractéristiques, l'édition du gène recombinase à médiation en utilisant des séquences loxP ou FRT dans préintégrées loci de refuge est un outil couramment utilisé dans la souris transgenèse. En plus de l' insertion de la cassette ou l' excision à médiation entre des séquences cibles identiques, l'utilisation de sites loxP ou FRT incompatibles permet l'échange de cassette à médiation par la recombinase (CREM) 4.
Chez l'homme, les tentatives pour identifier les loci de la sphère de sécurité ont été effectuées. Le HPRT orthologue de la souris, en dépit de son association avec le syndrome de la perte de fonction de Lesch-Nyhan et ROSA26 ont été ciblés en hPSCs. HPRT a été signalé pour faire taire rapidement l' expression du transgène dans ESC et, comme ROSA26, sa capacité à maintenir l' expression du transgène dans terminale des cellules différenciées n'a pas été étudiée 5-7. Parce qu'une mutation nulle homozygote du gène CCR5 semble être bien toléré chez l' homme, sa valeur refuge a été évaluée. CCR5 a été ciblé et rapporté pour soutenir l' expression du transgène stable dans différentes lignées cellulaires humaines, y compris 8,9 CES. cependant,ce dernier n'a pas été prouvé au niveau clonal pendant la culture à long terme, et l' expression du transgène omniprésente n'a pas été démontrée dans la descendance différenciée des trois couches germinales. AAVS1, le site d'intégration naturelle de l'Adeno Associated Virus de type 2 (AAV), a été testé en CSEh ainsi, en raison de la résistance rapportée à transgène taire 10. Par la suite, de nombreux groupes ont utilisé le locus AAVS1 et décrit l' expression stable du transgène dans hPSCs indifférenciées, ainsi que leur descendance différenciée de l' ensemble des trois couches germinales, à la fois in vitro et in vivo 2,8,11,12. Les résultats récents nuancent néanmoins ces résultats, comme le lieu AAVS1 a été trouvé pour exercer une inhibition de transgène variables in vitro dans CSEh indifférenciées et hépatocytes descendance 13.
études de dépistage supplémentaires utilisant des approches et des méthodes d'intégration aléatoires pour déterminer l'intégration à copie unique visant à trouver des génosites d'intégration micro résistantes aux transgène silencieux pendant hPSCs l' expansion et la différenciation 14,15. Dans l'ensemble, jusqu'à présent, aucun site génomique a été entièrement validée comme un port sûr dans hPSCs et leur progéniture; l' identification d'un site approprié pour l' expression du transgène stable omniprésente, non seulement en hPSCs mais aussi dans leurs descendances différenciées in vitro et in vivo, reste à résoudre. Parmi tous les loci étudiés et malgré ses limites, AAVS1 reste le mieux caractérisé et le plus utilisé dans la recherche sur les cellules souches.
CREM a été réalisé avec succès en hPSCs dans certains de ces loci 6,7,14,16, en utilisant la plupart du temps Cre recombinase, même s'il y a des indications que FLPe est plus efficace que Cre 17. Dans tous ces cas, une cassette de résistance à la drogue positive a été utilisée pour la sélection de colonies recombinantes. Malgré son succès, ces procédures ne constituent pas un progrès technique sur la norme géné-procédures d'édition en utilisant ZFNs, TALENs ou CRISPR / cas9, comme une seule procédure de sélection antibiotique ne permet pas d'exclure des intégrations aléatoires et exige le dépistage des colonies pour identifier les clones correctement ciblés.
Dans cette procédure, on décrit des méthodes pour effectuer CREM en hPSCs dans le locus AAVS1 utilisant une combinaison de positif (à l'intérieur de la cassette entrant) et négative (à l'intérieur de la cassette pré – intégrée) , les sélections qui permettent la génération de lignées transgéniques polyclonaux à ± 15 jours , avec 100% d'efficacité et sans événements d'intégration aléatoires. Par conséquent, cette méthode représente un progrès au-delà des technologies de CREM actuellement décrites dans hPSCs.
édition Gene méthodes loci portuaires sécuritaires demeurent un outil essentiel pour développer la transgénèse dans hPSCs. Bien que le caractère de refuge de AAVS1 a récemment été remise en question pour certaines applications 13,18, ce locus reste actuellement le meilleur , caractérisé en lignées cellulaires humaines dérivées. La conscience de ses limites dans hPSCs peut aider à obtenir des données fiables. Par conséquent, AAVS1 devrait encore être un site utile, par exemple, pour les études de perte et intensité forte de fonction ou inductible expression / constitutive de facteurs qui nécessitent un contexte isogénique dans et entre les milieux génétiques déterminés.
Le locus AAVS1 a été ciblé par de nombreux groupes utilisant ZFNs, TALEN ou CRISPR / cas9 1,2,19. Ces nucleases augmentent de façon significative l'efficacité de la recombinaison homologue dans un lieu déterminé. Cependant, le processus de dépister et de caractériser complètement clones correctement ciblés, libres de integ aléatoireration et de maintenir la pluripotence et l' intégrité du génome peut prendre jusqu'à 3 mois ( à l' aide des outils d'édition optimisés de gènes) (figure 3). Les deux derniers peuvent être causés par des mutations possibles générés par l'activité de nucléase hors cible. Le système de CREM utilisé ici, cependant, offre une méthode rapide, efficace et élégante pour atteindre cet objectif en seulement deux semaines, une fois que des séquences cibles spécifiques recombinase sont préintégrées dans le locus AAVS1. Utilisation de la sélection positive / négative et un programme de sélection approprié sont les principaux facteurs qui contribuent à la simplification de l' édition des gènes dans le locus AAVS1 par CREM.
La caractérisation génotypique des nouvelles lignées transgéniques est significativement réduite (pas de dépistage clonale est nécessaire), et la caractérisation associée à l'activité hors cible nucléase est rendue indispensable en raison de la spécificité de FLPe pour FRT. La caractérisation peut également être réduit dans des expériences de routine CREM en démontrant laperte complète de l' expression de GFP à partir de la lignée cellulaire maître (figure 2A), parce que l' échange de la cassette complète et le manque d'intégration aléatoire ont déjà été suffisamment démontrée par PCR (figure 2B) et Southern blot 13. L'utilisation de la sélection positive / négative constitue également la principale différence avec les rapports précédents. Plusieurs groupes décrits précédemment CREM dans hPSCs, soit dans le AAVS1 ou d' autres loci, utilisés une seule étape de sélection positive 7,14,16. Cela ne constitue pas un avantage technique sur l'édition génétique réalisée avec des nucléases, parce que le dépistage de la colonie doit être effectuée également dans le but de démontrer l'intégration correcte et l'absence d'intégration aléatoire au niveau clonal.
L' utilisation de ce système CREM dans plusieurs CSEh lignes / iPSC nécessite préintégration du FRT contenant la cassette décrite dans le locus AAVS1 de chaque ligne indépendante. Cependant, une fois généré,sa rapidité et de simplicité, il est possible de développer des semi-haut débit écrans génétiques dans les paramètres isogéniques définis pour les applications mentionnées ci-dessus qui, autrement, serait techniquement très coûteuse en temps. En outre, tous les vecteurs de CREM sont construits dans le vecteur de ciblage de gène pZ AAVS1 utilisé pour cibler le locus avec ZFN, mais TALENs ou CRISPR / cas9 ont également été signalés. La dualité du vecteur CREM est très utile pour générer plusieurs lignes pour un transgène déterminé hPSCs avec ou sans FRT. Par exemple, un coup a démontré avec succès dans un écran génétique déterminée effectuée par CREM serait idéalement besoin d'être testé dans plusieurs lignes HPSC pour confirmer les résultats. En l'absence de plusieurs lignées de cellules maître CREM-approprié, gène cible directe du succès en utilisant nucléases pourrait être effectuée. L'utilité du double caractère des vecteurs de CREM a été prouvé par notre groupe 20. Dans cette étude, la correction génique a été réalisée chez le patient dérivéLa démence frontotemporale (DFT) CSPi qui portent une mutation causant progranuline (PGRN) déficit d'expression. Gène de complémentation par ZFN médiées par insertion dans le locus AAVS1 d'une cassette qui rétablit les niveaux PGRN, corrige le phénotype déficient en corticogenèse associé à la présence de la mutation. En outre, une ligne comparable a été générée par CREM en CSEh WT pour être utilisé comme témoin pour l' expression PGRN exogène.
En l'absence de colonies recombinantes, vérifier l'efficacité de transfection du vecteur CREM des donateurs. l'efficacité de transfection supérieure à 30% donnent les résultats indiqués ci-dessus. efficacités plus faibles de transfection diminuent l'efficacité de recombinaison. Enfin, le système de CREM a été généré dans le locus AAVS1, mais elle est applicable à tout autre locus.
The authors have nothing to disclose.
L.O. was funded by IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04, and the Government of Aragon FMI048/08; RB by IWT fellowship SB-121396; M.P. by FWO 1288714N; and R.S. by the Dutch Diabetes Foundation. N.H., J.V., K.C., and Q.C. were supported by IWT fellowships SB-121396, SB-101230, SB-91228, and SB-093228, respectively. Funding to C.M.V. was from FWO G.0667.07, G.0975.11, and KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).
DR4 Mouse Embryonic Fibroblasts (MEF) | AMS bio | GSC-6204G | hPSC culture on feeers |
CF-1 MEF, mitomycin-C treated | AMS Bio | GSC-6001M | |
EmbryoMax 0.1% Gelatin Solution | Millipore | ES-006-B | iMEF plating |
DMEM/F-12, HEPES | Gibco | 31330-038 | |
KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828-028 | |
L-Glutamine | Sigma Aldrich | G8540 | For hESC medium |
L-Glutamine 200 mM | Gibco | 25030-081 | For iMEF medium |
2-Mercaptoethanol 50 mM | Gibco | 31350-010 | |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Gibco | 11140-035 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Human basic FGF | Peprotech | 100-18C | |
Y-27632 in Solution | VWR | 688001-500 | |
DMEM High Glucose | Gibco | 41965-039 | |
Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | F7524 | |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | hPSC culture on feeders |
Matrigel hESC qualified | VWR | 734-1440 | |
mTeSR1 complete medium kit | Stem cell technologies | 05850 | For Feeder free culture |
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent | Gibco | A1110501 | For feeder free culture |
Y-27632 in solution | VWR | 56726 | |
Human Stem Cell Nucleofector Kit 2 | Lonza | VVPH-5022 | |
Puromycine Dihydrochloride | Gibco | A11138-03 | |
FIAU (Fialuridine) | ABX | 2910 | |
Hygromycin B | Sigma Aldrich | H3274 | |
pFLPe | Modified to from pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) to remove puromycin | ||
RMCE donors | – | – | Modified from pZ donor AAVS1 puromycin vector (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13 |
5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer | Falcon | 352235 | |
PureLink Genomic DNA kit | Invitrogen | K182001 | |
GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8298 | |
Agarose | Sigma | A9539 | |
SYBR Safe DNA Gel Stain | Invitrogen | S33102 | |
Nucleofector 2b Device | Lonza (Amaxa) | AAB-1001 | |
NucleoCounter NC-100 | Chemometec | NC-100 | |
BD FACS Canto | BD Biosciences | 337175 | |
NucleoCassette | Chemometec | 941-0002 |